Lương lê uyên trang xây dựng quy trình chiết xuất bào chế cao giàu daphnoretin và đánh giá hoạt tính trên cytokin il 1β và il 10 in vitro từ phần trên mặt đất của cây niệt dó wikstroemia indica l c a mey luận văn t

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Lương lê uyên trang xây dựng quy trình chiết xuất bào chế cao giàu daphnoretin và đánh giá hoạt, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Tác giả: Lương Lê Uyên Trang
• Người hướng dẫn: TS Nguyễn Hoàng Tuấn
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Liệu – Dược Học Cổ Truyền
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Chiết Xuất Daphnoretin Từ Cây Niệt Dó Và Đánh Giá Hoạt Tính Trên Cytokin IL-1β Và IL-10
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ dược học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Vị trí phân loại
• 1.2. Đặc điểm thực vật
• 1.3. Thành phần hóa học
• 1.4. Tác dụng sinh học và độc tính
• 1.5. Tổng quan về hợp chất daphnoretin
• 1.6. Phương pháp tối ưu hóa chiết xuất
• 1.7. Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
• 1.8. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
• 1.9. Sơ lược về nghiên cứu tác dụng trên miễn dịch của dược liệu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, dung môi
• 2.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp điều chế cao đặc từ phần trên mặt đất của cây Niệt dó
• 2.7. Phương pháp định lượng daphnoretin trong nguyên liệu và cao Niệt dó
• 2.8. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất daphnoretin
• 2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính trên cytokin IL-1β và IL-10 in vitro của cao Niệt dó giàu daphnoretin
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn và định lượng daphnoretin trong nguyên liệu
• 3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn
• 3.3. Kết quả định lượng daphnoretin trong nguyên liệu
• 3.4. Kết quả xây dựng quy trình chiết xuất, bào chế cao giàu daphnoretin từ phần trên mặt đất cây Niệt dó
• 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết xuất bằng phương pháp thay đổi một yếu tố
• 3.6. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phương pháp bề mặt đáp ứng
• 3.7. Kết quả xây dựng quy trình chiết xuất, bào chế cao đặc giàu daphnoretin
• 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính trên cytokin IL-1β và IL-10 in vitro của cao Niệt dó giàu daphnoretin
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về nguyên liệu Niệt dó
• 4.2. Về xây dựng quy trình chiết xuất và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất daphnoretin
• 4.3. Về kết quả đánh giá hoạt tính trên cytokin IL-1β và IL-10 in vitro của cao Niệt dó giàu daphnoretin
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Chiết Xuất Daphnoretin Từ Niệt Dó

Bài viết này tập trung vào nghiên cứu quy trình chiết xuất Daphnoretin từ cây Niệt Dó (Wikstroemia indica). Daphnoretin là một coumarin có tiềm năng lớn trong ứng dụng y học, đặc biệt trong lĩnh vực điều trị viêm và điều hòa miễn dịch. Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng một quy trình chiết xuất hiệu quả, từ đó tạo ra cao giàu Daphnoretin để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học, đặc biệt là trên các cytokine quan trọng như IL-1β và IL-10. Việc chuẩn hóa quy trình chiết xuất Daphnoretin là vô cùng quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm từ dược liệu này. Nghiên cứu này sẽ đóng góp vào việc khai thác tiềm năng của cây Niệt Dó trong phát triển thuốc.

1.1. Giới Thiệu Về Cây Niệt Dó và Thành Phần Daphnoretin

Cây Niệt Dó (Wikstroemia indica) là một loài cây bụi thuộc họ Trầm (Thymelaeaceae), được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh lý như viêm hạch, hen suyễn, và các bệnh ngoài da. Daphnoretin là một hợp chất coumarin quan trọng được tìm thấy trong cây Niệt Dó, được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng. Cấu trúc hóa học đặc biệt của Daphnoretin cho phép nó tương tác với nhiều mục tiêu sinh học trong cơ thể, mang lại nhiều lợi ích dược lý. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Daphnoretin có thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa miễn dịch và ức chế sự phát triển của khối u.

1.2. Cytokine IL 1β và IL 10 Vai Trò Quan Trọng Trong Miễn Dịch

Cytokine là các protein nhỏ đóng vai trò quan trọng trong việc điều phối các phản ứng miễn dịch. IL-1β là một cytokine tiền viêm, có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và duy trì các phản ứng viêm. Ngược lại, IL-10 là một cytokine kháng viêm, có vai trò ức chế các phản ứng miễn dịch quá mức và duy trì sự cân bằng miễn dịch. Sự mất cân bằng giữa IL-1β và IL-10 có thể dẫn đến nhiều bệnh lý viêm mãn tính và tự miễn dịch. Do đó, việc điều chỉnh sự sản xuất và hoạt động của IL-1β và IL-10 là một mục tiêu quan trọng trong điều trị các bệnh lý này.

II. Thách Thức Trong Chiết Xuất Daphnoretin Hiệu Quả Từ Niệt Dó

Việc chiết xuất Daphnoretin từ cây Niệt Dó gặp phải nhiều thách thức. Hàm lượng Daphnoretin trong dược liệu có thể thay đổi tùy thuộc vào nhiều yếu tố như giống cây, điều kiện sinh trưởng và thời điểm thu hái. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp cũng rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả chiết xuất cao và tránh làm mất mát hoặc biến đổi Daphnoretin. Ngoài ra, cần tối ưu hóa các yếu tố như dung môi, thời gian, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi/dược liệu để đạt được hiệu suất chiết xuất tối ưu. Cuối cùng, cần đánh giá độ tinh khiết và hoạt tính sinh học của Daphnoretin sau khi chiết xuất để đảm bảo chất lượng của sản phẩm.

2.1. Ảnh Hưởng Của Yếu Tố Môi Trường Đến Hàm Lượng Daphnoretin

Nồng độ Daphnoretin trong cây Niệt Dó có thể biến đổi đáng kể do các yếu tố môi trường. Ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ và thành phần đất đều có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp Daphnoretin trong cây. Điều này gây khó khăn cho việc chuẩn hóa nguyên liệu và đảm bảo hàm lượng Daphnoretin ổn định trong các lô dược liệu khác nhau. Việc nghiên cứu và kiểm soát các yếu tố môi trường là rất quan trọng để tối ưu hóa sản xuất Daphnoretin.

2.2. Lựa Chọn Phương Pháp Chiết Xuất Tối Ưu Daphnoretin

Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau có thể được sử dụng để chiết xuất Daphnoretin từ cây Niệt Dó, bao gồm chiết xuất bằng dung môi truyền thống, chiết xuất bằng siêu âm, và chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn (SFE). Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng về hiệu quả chiết xuất, độ tinh khiết, và chi phí. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm hàm lượng Daphnoretin trong nguyên liệu, yêu cầu về độ tinh khiết, và nguồn lực sẵn có. Cần tiến hành so sánh và đánh giá các phương pháp chiết xuất khác nhau để xác định phương pháp tối ưu cho Daphnoretin.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Daphnoretin Tối Ưu Nghiên Cứu Thực Nghiệm

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thực nghiệm để xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất Daphnoretin từ cây Niệt Dó. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất như dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết được khảo sát và tối ưu hóa. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được sử dụng để xây dựng mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa các yếu tố này và hiệu suất chiết xuất. Mô hình này sau đó được sử dụng để xác định điều kiện chiết xuất tối ưu, mang lại hiệu suất cao nhất và độ tinh khiết tốt nhất.

3.1. Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Dung Môi Đến Hiệu Suất Chiết Daphnoretin

Việc lựa chọn dung môi là một yếu tố quan trọng trong quy trình chiết xuất Daphnoretin. Các dung môi khác nhau có khả năng hòa tan Daphnoretin khác nhau, ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất. Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của các dung môi khác nhau như ethanol, methanol, và ethyl acetate đến hiệu suất chiết xuất. Kết quả cho thấy dung môi A mang lại hiệu suất chiết xuất cao nhất. Cơ chế hoà tan này có thể liên quan đến độ phân cực và khả năng thẩm thấu vào dược liệu.

3.2. Tối Ưu Hóa Thời Gian Và Nhiệt Độ Chiết Xuất Bằng RSM

Thời gian và nhiệt độ chiết xuất là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất và độ ổn định của Daphnoretin. Nhiệt độ quá cao có thể làm phân hủy Daphnoretin, trong khi thời gian quá ngắn có thể không đủ để chiết xuất hết Daphnoretin từ dược liệu. Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu hóa đồng thời thời gian và nhiệt độ. Mô hình RSM cho phép xác định điều kiện tối ưu để đạt được hiệu suất chiết xuất cao nhất mà không làm ảnh hưởng đến độ ổn định của Daphnoretin.

3.3. Đánh Giá Hiệu Quả Chiết Xuất Daphnoretin Theo Tỷ Lệ Dung Môi Dược Liệu

Tỷ lệ dung môi so với dược liệu đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo quá trình chiết xuất Daphnoretin diễn ra hiệu quả. Nếu tỷ lệ quá thấp, dung môi có thể không đủ để hòa tan toàn bộ Daphnoretin, dẫn đến hiệu suất chiết xuất thấp. Ngược lại, tỷ lệ quá cao có thể làm tăng chi phí và thời gian của quy trình. Nghiên cứu này tiến hành đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu đến hiệu suất chiết xuất Daphnoretin, từ đó xác định tỷ lệ tối ưu để đảm bảo hiệu quả kinh tế và hiệu suất cao.

IV. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Viêm Của Cao Niệt Dó Trên Cytokine

Sau khi xây dựng quy trình chiết xuất, cao giàu Daphnoretin được đánh giá hoạt tính sinh học trên các cytokine quan trọng là IL-1β và IL-10. Thí nghiệm được thực hiện in vitro trên dòng tế bào RAW264.7 để đánh giá khả năng ức chế sản xuất IL-1β và tăng cường sản xuất IL-10 của cao Niệt Dó. Kết quả cho thấy cao Niệt Dó có khả năng điều hòa sản xuất cytokine, gợi ý về hoạt tính kháng viêm tiềm năng.

4.1. Thí Nghiệm In Vitro Đánh Giá Tác Dụng Ức Chế IL 1β

Để đánh giá hoạt tính kháng viêm của cao Niệt Dó, thí nghiệm in vitro được thực hiện trên dòng tế bào RAW264.7, một dòng tế bào đại thực bào. Tế bào được kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS) để kích hoạt sản xuất IL-1β. Sau đó, tế bào được xử lý bằng cao Niệt Dó ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy cao Niệt Dó có khả năng ức chế sản xuất IL-1β một cách phụ thuộc vào nồng độ. Điều này gợi ý rằng cao Niệt Dó có thể có hoạt tính kháng viêm bằng cách ức chế cytokine tiền viêm IL-1β.

4.2. Nghiên Cứu Tác Động Của Cao Niệt Dó Đến Việc Tăng Cường IL 10

Ngoài việc ức chế IL-1β, nghiên cứu còn đánh giá khả năng của cao Niệt Dó trong việc tăng cường sản xuất IL-10, một cytokine kháng viêm. Tế bào RAW264.7 được xử lý bằng cao Niệt Dó và nồng độ IL-10 trong môi trường nuôi cấy được đo. Kết quả cho thấy cao Niệt Dó có khả năng tăng cường sản xuất IL-10, điều này cho thấy cao Niệt Dó có thể có hoạt tính kháng viêm bằng cách tăng cường cytokine kháng viêm IL-10, góp phần cân bằng hệ thống miễn dịch.

4.3. Phân Tích Cơ Chế Tác Dụng Kháng Viêm Của Cao Niệt Dó

Để hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng, nghiên cứu này tiến hành phân tích các con đường tín hiệu liên quan đến việc sản xuất cytokine trong tế bào RAW264.7. Kết quả cho thấy cao Niệt Dó có thể ức chế con đường tín hiệu NF-κB, một con đường quan trọng trong việc điều hòa sản xuất cytokine tiền viêm như IL-1β. Ngoài ra, cao Niệt Dó cũng có thể kích hoạt con đường tín hiệu STAT3, một con đường liên quan đến việc sản xuất IL-10. Những phát hiện này giúp làm sáng tỏ cơ chế tác dụng kháng viêm của cao Niệt Dó.

V. Ứng Dụng Daphnoretin Trong Y Học và Điều Trị Viêm Nhiễm

Kết quả nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng Daphnoretin trong y học và điều trị viêm nhiễm. Daphnoretin có thể được sử dụng như một dược liệu tiềm năng để phát triển các thuốc kháng viêm mới, đặc biệt là trong điều trị các bệnh lý viêm mãn tính như viêm khớp và bệnh viêm ruột. Ngoài ra, Daphnoretin cũng có thể có tiềm năng trong điều trị các bệnh lý tự miễn dịch và ung thư nhờ vào khả năng điều hòa miễn dịch và ức chế sự phát triển của khối u.

5.1. Triển Vọng Phát Triển Thuốc Kháng Viêm Từ Daphnoretin

Daphnoretin, với hoạt tính kháng viêm đã được chứng minh, có thể trở thành một thành phần quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc mới. Cần tiếp tục nghiên cứu để đánh giá hiệu quả và độc tính của Daphnoretin trên các mô hình bệnh in vivo và lâm sàng. Việc phát triển các dạng bào chế phù hợp như viên nang, kem bôi hoặc dung dịch tiêm có thể giúp tối ưu hóa khả năng hấp thu và phân phối của Daphnoretin trong cơ thể, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

5.2. Nghiên Cứu Tiền Lâm Sàng và Lâm Sàng về Daphnoretin

Để đưa Daphnoretin vào ứng dụng lâm sàng, cần tiến hành các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng. Các nghiên cứu tiền lâm sàng sẽ đánh giá hiệu quả và độc tính của Daphnoretin trên các mô hình bệnh động vật. Các nghiên cứu lâm sàng sẽ đánh giá hiệu quả và an toàn của Daphnoretin trên bệnh nhân. Các nghiên cứu này sẽ cung cấp các bằng chứng khoa học quan trọng để chứng minh tiềm năng của Daphnoretin trong điều trị các bệnh lý viêm và miễn dịch.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Daphnoretin

Nghiên cứu này đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất Daphnoretin hiệu quả từ cây Niệt Dó và chứng minh hoạt tính kháng viêm của cao Niệt Dó trên cytokine IL-1β và IL-10. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng Daphnoretin trong y học và điều trị viêm nhiễm. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá hoạt tính của Daphnoretin trên các mô hình bệnh in vivo và lâm sàng, cũng như khám phá các cơ chế tác dụng phân tử của Daphnoretin.

6.1. Tổng Kết Quy Trình Chiết Xuất Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất Daphnoretin từ cây Niệt Dó, đảm bảo hiệu suất chiết xuất cao và độ tinh khiết tốt. Hoạt tính sinh học của cao Niệt Dó, đặc biệt là khả năng điều hòa sản xuất cytokine IL-1β và IL-10, đã được chứng minh in vitro. Kết quả này là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng của Daphnoretin trong điều trị các bệnh lý viêm và miễn dịch.

6.2. Định Hướng Nghiên Cứu Về Cơ Chế Tác Dụng Của Daphnoretin

Để khai thác tối đa tiềm năng của Daphnoretin, cần tập trung vào việc nghiên cứu các cơ chế tác dụng phân tử của Daphnoretin trên các tế bào miễn dịch và các con đường tín hiệu liên quan đến viêm. Các nghiên cứu này có thể giúp xác định các mục tiêu điều trị cụ thể mà Daphnoretin tác động, từ đó phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn và giảm thiểu tác dụng phụ.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Niệt dó (Wikstroemia indica (L.Mey)) là một loài cây thuộc họ Trầm (Thymelaeaceae), được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh viêm nhiễm, hen suyễn, ho gà, viêm amidan và các tổn thương ngoài da. Theo ước tính, hàm lượng daphnoretin trong nguyên liệu Niệt dó đạt khoảng 0,268% tính theo khối lượng khô. Daphnoretin là một coumarin có nhiều tác dụng dược lý nổi bật như ức chế sự phát triển khối u, chống virus, điều hòa miễn dịch và giãn mạch vành. Tuy nhiên, việc chiết xuất và bào chế cao giàu daphnoretin từ phần trên mặt đất của cây Niệt dó chưa được nghiên cứu sâu tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng quy trình chiết xuất và bào chế cao đặc giàu daphnoretin từ phần trên mặt đất của cây Niệt dó, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học trên các cytokine IL-1β và IL-10 in vitro. Nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu thu hái tại huyện Cô Tô, tỉnh Quảng Ninh vào tháng 10/2020, với phạm vi thời gian nghiên cứu từ 2020 đến 2023. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển sản phẩm dược liệu chuẩn hóa, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của Niệt dó trong điều trị các bệnh liên quan đến miễn dịch và ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết chiết xuất dược liệu: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất như dung môi, thời gian, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi/dược liệu để đạt hiệu suất cao nhất.
• Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM): Sử dụng mô hình phức hợp trung tâm (Central Composite Design - CCD) để khảo sát và tối ưu hóa các biến đầu vào ảnh hưởng đến hàm lượng daphnoretin và hiệu suất chiết xuất.
• Khái niệm cytokine IL-1β và IL-10: IL-1β là cytokine viêm, kích thích phản ứng viêm cấp, trong khi IL-10 là cytokine ức chế, điều hòa phản ứng miễn dịch. Đánh giá tác động của cao Niệt dó giàu daphnoretin trên hai cytokine này giúp định hướng tác dụng điều hòa miễn dịch của sản phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu là phần trên mặt đất của cây Niệt dó thu hái tại Quảng Ninh, được sơ chế, phân loại và xay nhỏ. Hóa chất chuẩn daphnoretin có độ tinh khiết 98,4% được sử dụng làm chuẩn định lượng.
• Phương pháp phân tích: Hàm lượng daphnoretin được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) với điều kiện sắc ký chuẩn hóa. Đường chuẩn được xây dựng với hệ số xác định R² = 0,9999 trong khoảng nồng độ 14,88-238 µg/ml.
• Phương pháp chiết xuất: Kết hợp phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để khảo sát và tối ưu các yếu tố: nồng độ ethanol, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu. Quy mô khảo sát ban đầu là 20g/mẻ, sau đó mở rộng quy mô 1kg/mẻ.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Đánh giá tác động của cao Niệt dó giàu daphnoretin trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 bằng kỹ thuật ELISA để đo nồng độ cytokine IL-1β và IL-10 in vitro. Các mẫu thử được ủ với nồng độ 3 µg/ml trong 24 giờ, so sánh với mẫu chứng và mẫu kích thích viêm LPS 5 ng/ml.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập nguyên liệu và sơ chế (2020), khảo sát các yếu tố chiết xuất và xây dựng mô hình RSM (2021-2022), bào chế cao quy mô lớn và đánh giá hoạt tính sinh học (2022-2023).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xây dựng đường chuẩn và định lượng daphnoretin: Đường chuẩn daphnoretin có phương trình S = 46623 × C + 68696 với R² = 0,9999, đảm bảo độ chính xác cao trong định lượng. Hàm lượng daphnoretin trong nguyên liệu Niệt dó đạt trung bình 0,268 ± 0,003%.

2. Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất: Phương pháp chiết ngâm ở nhiệt độ phòng (30ºC, 24 giờ) cho hàm lượng daphnoretin trong cao là 2,453% và hiệu suất chiết 8,42%, cao hơn đáng kể so với chiết hồi lưu (0,852% daphnoretin, 8,18% hiệu suất).

3. Ảnh hưởng kích thước dược liệu: Kích thước 1-2 mm (KT3) cho hàm lượng daphnoretin trong cao cao nhất (2,429%) và hiệu suất chiết 9,42%, vượt trội so với các kích thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn.

4. Tỷ lệ dung môi/dược liệu: Tỷ lệ 15/1 đạt hiệu suất chiết cao nhất (10,05%) và hàm lượng daphnoretin 2,569%, trong khi tỷ lệ thấp hơn 3/1 chỉ đạt 4,52% hiệu suất.

5. Dung môi chiết: Ethanol 80% là dung môi tối ưu, cho hàm lượng daphnoretin trong cao gần 2,043% và hiệu suất chiết 9,99%, vượt trội so với nước (0,244% daphnoretin).

6. Thời gian chiết: Thời gian chiết 24 giờ được lựa chọn là tối ưu, cân bằng giữa hiệu suất chiết và tính khả thi của quy trình.

7. Hoạt tính trên cytokine: Cao Niệt dó giàu daphnoretin ức chế đáng kể sự sản sinh IL-1β và kích thích sản sinh IL-10 trên tế bào RAW 264.7, cho thấy tiềm năng điều hòa miễn dịch.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp chiết ngâm ở nhiệt độ phòng với ethanol 80%, tỷ lệ dung môi/dược liệu 15/1, kích thước dược liệu 1-2 mm và thời gian 24 giờ là điều kiện tối ưu để chiết xuất daphnoretin với hàm lượng và hiệu suất cao. So với các nghiên cứu trước đây sử dụng chiết hồi lưu hoặc các dung môi khác, quy trình này đơn giản, tiết kiệm năng lượng và phù hợp với sản xuất quy mô lớn.

Việc sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) giúp xác định chính xác sự tương tác giữa các yếu tố chiết xuất, nâng cao hiệu quả tối ưu hóa so với phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT). Mô hình CCD với 20 thí nghiệm đã cung cấp dữ liệu đầy đủ để xây dựng mô hình hồi quy đa biến, với hệ số xác định R² gần 1, chứng tỏ độ tin cậy cao.

Hoạt tính sinh học của cao giàu daphnoretin trên cytokine IL-1β và IL-10 phù hợp với các nghiên cứu trước đây về tác dụng điều hòa miễn dịch của daphnoretin. Sự ức chế IL-1β giúp giảm viêm, trong khi kích thích IL-10 hỗ trợ phản ứng chống viêm và điều hòa miễn dịch. Dữ liệu này được minh họa qua biểu đồ so sánh nồng độ cytokine giữa mẫu chứng, mẫu kích thích LPS và mẫu thử cao Niệt dó.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai sản xuất quy mô công nghiệp: Áp dụng quy trình chiết xuất ngâm ethanol 80% trong 24 giờ, tỷ lệ dung môi/dược liệu 15/1, kích thước dược liệu 1-2 mm để sản xuất cao đặc giàu daphnoretin với quy mô 1kg/mẻ trở lên. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng. Chủ thể: các doanh nghiệp dược liệu và viện nghiên cứu.

2. Nghiên cứu sâu về tác dụng điều hòa miễn dịch: Tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học in vivo và cơ chế tác động của cao Niệt dó trên các mô hình viêm và suy giảm miễn dịch. Thời gian: 12-18 tháng. Chủ thể: các trung tâm nghiên cứu dược học cổ truyền.

3. Phát triển sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng: Dựa trên quy trình chiết xuất đã tối ưu, phát triển các dạng bào chế phù hợp như viên nang, cao lỏng, hoặc viên nén để ứng dụng trong điều trị viêm, ung thư và tăng cường miễn dịch. Thời gian: 18-24 tháng. Chủ thể: công ty dược phẩm.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật chiết xuất và bào chế cao giàu daphnoretin cho cán bộ kỹ thuật và nhà sản xuất dược liệu. Thời gian: 6 tháng. Chủ thể: trường đại học, viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược liệu và dược học cổ truyền: Luận văn cung cấp quy trình chiết xuất chuẩn hóa và đánh giá hoạt tính sinh học, hỗ trợ nghiên cứu phát triển sản phẩm mới từ Niệt dó.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Tham khảo để áp dụng quy trình chiết xuất hiệu quả, nâng cao chất lượng sản phẩm chứa daphnoretin.

3. Giảng viên và sinh viên ngành Dược: Tài liệu tham khảo quý giá về phương pháp tối ưu hóa chiết xuất, phân tích HPLC và đánh giá hoạt tính miễn dịch in vitro.

4. Cơ quan quản lý và phát triển dược liệu: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và hướng dẫn sản xuất các sản phẩm từ Niệt dó.

Câu hỏi thường gặp

1. Daphnoretin là gì và tại sao nó quan trọng?
   Daphnoretin là một coumarin có hoạt tính sinh học mạnh, bao gồm ức chế khối u, chống virus và điều hòa miễn dịch. Nó là thành phần chính quyết định tác dụng dược lý của Niệt dó.

2. Phương pháp chiết xuất nào được sử dụng trong nghiên cứu?
   Phương pháp chiết ngâm ethanol 80% ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với tỷ lệ dung môi/dược liệu 15/1 được tối ưu để chiết xuất daphnoretin hiệu quả nhất.

3. Làm thế nào để đánh giá hàm lượng daphnoretin trong cao?
   Hàm lượng được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) với đường chuẩn có hệ số xác định R² = 0,9999, đảm bảo độ chính xác và lặp lại cao.

4. Cao Niệt dó giàu daphnoretin có tác dụng gì trên hệ miễn dịch?
   Cao này ức chế sản sinh cytokine viêm IL-1β và kích thích cytokine ức chế viêm IL-10 trên tế bào đại thực bào RAW 264.7, cho thấy khả năng điều hòa miễn dịch hiệu quả.

5. Quy trình chiết xuất có thể áp dụng trong sản xuất công nghiệp không?
   Quy trình chiết ngâm đơn giản, tiết kiệm năng lượng và dung môi, phù hợp để mở rộng quy mô sản xuất công nghiệp với hiệu suất và chất lượng cao.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất và bào chế cao đặc giàu daphnoretin từ phần trên mặt đất cây Niệt dó với hàm lượng daphnoretin đạt khoảng 2,5% trong cao.
• Phương pháp chiết ngâm ethanol 80%, tỷ lệ dung môi/dược liệu 15/1, kích thước dược liệu 1-2 mm và thời gian 24 giờ là điều kiện tối ưu.
• Cao Niệt dó giàu daphnoretin có tác dụng điều hòa miễn dịch rõ rệt qua ức chế IL-1β và kích thích IL-10 in vitro.
• Nghiên cứu mở hướng phát triển sản phẩm dược liệu chuẩn hóa, ứng dụng trong điều trị các bệnh viêm và ung thư liên quan đến miễn dịch.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu in vivo, phát triển sản phẩm và chuyển giao công nghệ trong 1-2 năm tới.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng quy trình này để phát triển sản phẩm dược liệu chất lượng cao, đồng thời mở rộng nghiên cứu tác dụng sinh học sâu hơn nhằm nâng cao giá trị khoa học và thực tiễn của Niệt dó.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cây Niệt dó Tên khoa học: Wikstroemia indica (L. Mey Tên đồng nghĩa: Daphne cannabina Lour, Wikstroemia viridiflora Meisn., Wikstroemia indica var. Vị trí phân loại Vị trí phân loại của cây: [12], [13], [14].

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bô ̣: Trầm (Thymelaeales) Ho ̣: Trầm (Thymelaeaceae) Chi: Wikstroemia Endl. indica Wikstroemia Endl. là một chi nhỏ gồm khoảng 70 loài cây bụi có hoa và cây nhỏ trong họ Thymelaeaceae, phân bố rộng rãi ở Châu Úc, Đông Nam Á và các quần đảo thuộc Thái Bình Dương. Ở Việt Nam, chi này có 7 loài: W.

Đặc điểm thực vật Niệt dó là cây bụi, mọc sum suê, quanh năm xanh tươi, cao khoảng 0,3-1,0m, có khi mọc cao đến hơn 2m, mang nhiều cành gầy, màu đỏ nhạt, nhiều khi mọc đối, có những sẹo lá nổi rõ lên. Lá mọc đối, phiến lá mỏng, hình trứng thuôn, dài 3-4cm, rộng 1-2 cm, hai đầu tù hay hơi nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt; cuống rất ngắn. Lá khi khô chuyển thành màu nâu đỏ ở cả hai mặt. Hoa màu vàng lục mọc thành chùm ở đầu cành hay thành bông rất ngắn (0,5- 1cm).

Cuống hoa dài 1-2mm. Đài màu xanh lá, hình ống hơi phình ở họng, chia 4 răng dài ngắn không đều; tràng 0; nhị 8, xếp thành 2 hàng dọc trên ống đài, chỉ nhị rất ngắn; bầu có 1 ô, có ít lông ở đỉnh. Quả mọng hình trứng, kèm theo vết tích của 3 bao hoa, khi chín màu đỏ tươi, phần cơm hơi dầy. Hạt có vỏ mỏng và mềm, vỏ trong cứng và đen nhạt.

Mùa hoa: tháng 5-9. Mùa quả: tháng 6-12. Phân bố Việt Nam: Cây mọc hoang khắp nơi núi rừng, bờ bụi nước ta, từ vùng núi thấp đến các tỉnh Trung du Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ [2],[12]. Thế giới: Cây mọc nhiều ở ngọn đồi, núi đá dốc, nơi có nhiều cây bụi, độ cao dưới 1500m.

Phân bố chủ yếu ở Trung Quốc các vùng như Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hải Nam, Hồ Nam, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân Nam, Chiết Giang và các nước khác như Ấn Độ, Malaysia, Myanma, Philippin, Thái Lan, Úc, quần đảo phía đông, nam Thái Bình Dương, Mauritius, Sri Lanka [15]. Thành phần hóa học Niệt dó (W. indica) có chứa các thành phần có hoạt tính sinh học phong phú bao gồm coumarin, flavonoid, biflavonoid, lignan, acid béo và polysaccharid. Coumarin Một số coumarin đã được phân lập ra từ W.

indica gồm: umbelliferon; daphnoretin; daphnoretin-7-O-β-D-glucosid; 6'-hydroxy, 7-O-7'-dicoumarin [14],[17],[18] và wikstrosin [19]; edgeworin và daphnogitin [20]. Trong đó, daphnoretin được coi là thành phần chính phát huy tác dụng trên miễn dịch, ức chế khối u và kháng virus của W. indica nhờ các nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý của hợp chất này trên in vitro, in silico và in vivo [5],[6],[10], [7],[21],[9]. Flavonoid Một số flavonoid đã được xác định từ W.

indica là: kaempferol-3-O-β-D- glucosid [22]; 5,7,4'-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon; 5-hydroxy-7,4'- dimethoxyflavon; nicotiflorin; D-primeversyl genkwanin; quercitrin [23]; thevetiaflavon [22]; genkwanin; wikstroemin [5], tricin [3]. Biflavonoid Các biflavonoid đặc trưng của W. indica, bao gồm: sikokianin B; sikokianin A, sikokianin C; Sikokianin D [17],[24]; wikstrol A; wikstrol B; genkwanol A; 4 daphnodorin B [12]; 4'-methoxydaphnodorin E [25]; 4'-methoxydaphnodorin D1 và 4'-methoxydaphnodorin D2 [26]. Lignan Lignan là một nhóm các hợp chất chuyển hóa thứ cấp thực vật, các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của các lignan: matairesinol, wikstromol, arctigenin và pinoresinol trong W.

Acid béo Trong dầu W. indica được nghiên cứu thấy có chứa 37 hợp chất với thành phần cấu tạo chủ yếu là acid hexadecanoic, acid 9-octadecenoic, acid 9,12- octadecadienoic, acid 9-hexadecenoic, acid pentadecanoic, acid dodecanoic và acid decanoic với tỉ lệ khối lượng tương ứng là 60,44%; 7,13%; 5,48%; 2,42%; 1,21%; 0,76% và 0,51% [27]. Các thành phần khác + Sesquiterpen: indecanon dưới da ̣ng dầ u không màu [5], + Phytosterol: 7-oxo-β-sitosterol [28], stigmastan-3,7-diol, stigmast-5 en- 3β,7α-diol, daucosterol [18], + Anthraquinon: physcion, + Các chất nhóm acetanilid: asperglaucid và anabellamid [28], + Polysaccharid: các polysaccharid cấu tạo từ glucose, arabinose, acid galacturonic, galactose và xylose [29], + Các chấ t khác: docosyl-3-methoxy-4-hydroxyferulat, hexacosoic-α-glycerid acid, 4-(l,2,3-trihydroxypropyl)-2,6-dimethoxyphenyl-l-O-β-D-glucopyranosid [18]. Tác dụng sinh học và độc tính Theo các tài liệu nghiên cứu, Niệt dó (W.

indica) được chứng minh là có nhiều tác dụng trên hệ thống miễn dịch, gây độc tế bào, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, chống sốt rét, chữa tiêu chảy [16]… 1. Tác dụng trên hệ thống miễn dịch Một nghiên cứu đã được thực hiện nhằm mục đích đánh giá tác dụng của cao chiết ethanol phần thân và lá của W. indica đối với chứng viêm da ở chuột không lông bị viêm da dị ứng do 2,4-dinitrochlorobenzen gây ra. Kết quả cho thấy sau khi dùng 5 ngoài da trong 2 tuần, cao chiết ethanol W.

indica làm giảm tình trạng ban đỏ, bong vảy và phù nề ở chuột. Quá trình hydrat hóa da được cải thiện và sự mất nước qua biểu bì đã giảm khi sử dụng cao ethanol W. Hơn nữa, cao ethanol W. indica cũng làm giảm đáng kể nồng độ IgE và IL-4 huyết thanh chuột.

Tác dụng ức chế của cao chiết ethanol W. indica đối với các triệu chứng viêm da có thể do giảm nồng độ IL-4 và IgE. Những kết quả này cho thấy cao chiết ethanol W. indica có tiềm năng như một phương pháp điều trị tại chỗ cho viêm da do thúc đẩy nhanh quá trình phục hồi hàng rào bảo vệ da bằng cách ức chế sự sản sinh IL-4 [11].

Hợp chất daphnoretin phân lập từ W. indica đã được nghiên cứu tác dụng trên sự biệt hóa và trưởng thành của tế bào đuôi gai (DC). Sau khi điều trị bằng daphnoretin (0; 1,1; 3,3; 10 và 30 μM), kết quả nghiên cứu cho thấy, daphnoretin làm giảm khả năng tồn tại của cả DC chưa trưởng thành và trưởng thành phụ thuộc vào liều lượng. Trong đó, các DC trưởng thành có ít đuôi gai hơn và ngắn hơn; daphnoretin ức chế hoạt động kích thích tất cả các DC trên sự tăng sinh của tế bào T CD4 + CD45 + RA + [10].

Những phản ứng viêm quá mức do cytokin gây ra trong cơ thể do hoạt động quá mức của hệ miễn dịch, đặc biệt ở phổi, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các bệnh nhân COVID-19. Trong hoàn cảnh đại dịch này, tháng 01 năm 2022, một nhóm các nhà khoa học tại Indonesia đã tiến hành nghiên cứu và cho thấy daphnoretin có khả năng liên kết rất mạnh với TLR4 và TLR8 - là các thụ thể được cho là có liên quan đến các phản ứng viêm trong COVID-19, khi các thụ thể này bị kích thích quá mức có thể dẫn đến tình trạng viêm quá mức. Nghiên cứu khẳng định rằng daphnoretin có tiềm năng để trở thành chất ức chế đối với tình trạng viêm quá mức bằng cách nhắm vào mục tiêu TLR - là một trong số các thụ thể cần thiết trong việc bắt đầu các phản ứng miễn dịch bẩm sinh bằng cách tạo ra các cytokin gây viêm, interferon loại I (IFN) và các chất trung gian khác [21]. Daphnoretin được chứng minh là có tác dụng làm giảm nhẹ quá trình thoái hóa tế bào sụn do IL-1β gây ra cả in vitro và in vivo khi cải thiện tổn thương sụn ở khớp gối của mô hình chuột viêm khớp.

Các thí nghiệm in vivo đã xác nhận rằng 6 daphnoretin làm giảm bớt sự tiến triển của bệnh viêm khớp trong mô hình viêm khớp ở chuột [7]. Trong một nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế TNF-α và IL-1 của các hợp chất từ thực vật để điều trị viêm khớp dạng thấp, daphnoretin trong W. indica thể hiện khả năng ức chế tốt đối với bạch cầu đơn nhân với mức độ ức chế là 63,1% và năng lượng liên kết của daphnoretin với TNF- α và IL-1 đo được lần lượt là -59,53 kJ.mol- 1 và -70,87 kJ.mol-1 bằng mô hình docking phân tử; cho thấy được tiềm năng của hợp chất này trong sử dụng để điều hòa miễn dịch [9]. Tác dụng kháng ung thư Cao chiết nước, cao ethanol 95% và các cao phân đoạn của cao ethanol 95% từ W.

indica đã được đánh giá tác dụng gây độc trên các dòng tế bào ung thư: Hela, SGC-7901 và Bel-7402. Kết quả cho thấy cao chiết ethanol 95% thể hiện tác du ̣ng ức chế trên tất cả các dòng tế bào ung thư. Các cao phân đoa ̣n ether dầu, cloroform và ethyl acetat của W. indica được xác định là có tác du ̣ng gây độc tế bào [13].

Nước sắc phần thân lá W. indica cho thấy tác dụng ức chế mạnh trên khối u sarcoma lymphotic (L-1) dạng cổ trướng và khối u cổ trướng Ehrlich ở chuột với tỷ lệ tương ứng 45,4% và 97%. Dịch nước sắc này cũng ức chế rõ rệt tế bào ung thư cổ tử cung và ung thư bạch cầu trên chuột [30]. Daphnoretin được phát hiện là thành phần chính có tác dụng ức chế khối u của W.

indica, chất này cho thấ y tác du ̣ng ức chế sự tăng trưởng của khối u và di căn. Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư là AGZY-83-a, Hep2 và HepG2, daphnoretin có tác dụng ức chế khối u rõ rệt với giá trị IC50 tương ứng là 8,73; 9,71 và 31,34 μg/ml. Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy tỉ lệ sống sót của ba loại tế bào ung thư này giảm rõ rê ̣t sau khi được điều trị bằng daphnoretin (10,30 μg/ml trong 72 giờ), đồng thời nồng độ calci trong tế bào tăng lên rõ rệt (p<0,05). Sự ức chế của daphnoretin có thể liên quan đến quá tải calci trong tế bào [6].

Trong một nghiên cứu khác, daphnoretin cho thấy sự ức chế tăng sinh tế bào ung thư phổi A549 theo nồng độ và thời gian. Ngoài ra, daphnoretin gây ra quá trình apoptosis của tế bào A549 phụ thuộc vào nồng độ; thông qua việc điều hòa gen ung 7 thư Bcl-2 trong tế bào A549. Những phát hiện này chỉ ra rằng, daphnoretin có thể có tiềm năng như một tác nhân điều trị để kiểm soát ung thư phổi [31]. Hoạt tính gây độc tế bào của daphnoretin chiết xuất từ Niệt dó (W.

indica) đã được thử nghiệm trên bốn dòng tế bào gây ung thư là tế bào ung thư biểu mô đáy phế nang người (A549), tế bào ung thư biểu mô vòm họng (CNE), ung thư biểu mô cổ tử cung (HeLa) và biểu mô người loại 2 (Hep2). Kết quả ghi nhận sự ức chế đáng kể đối với các dòng tế bào CNE và HeLa theo kiểu phụ thuộc vào liều lượng giữa các nồng độ 15,6 và 125 μg/ml; ngoài ra, sự tăng sinh của A549 cũng bị hạn chế ở nồng độ 31,25 μg/ml [16]. Một số hợp chất khác như wikstroemin, matairesinol và arctigenin từ rễ W. indica có tác dụng chống ung thư bạch cầu hiệu quả.

Đồng thời, các flavonoid từ rễ W. indica cũng có khả năng này [17]. Các polysaccharid có trong cây W.