Nghiên Cứu Chiết Tách và Xác Định Cấu Trúc Taxoid Từ Cành, Lá Thông Đỏ (Taxus Wallichiana)

Khóa luận trình bày phương pháp chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc các taxoid từ cành lá thông đỏ Taxus wallichiana tại Lâm Đồng.

• Tác giả: Châu Thị Nhã Trúc
• Người hướng dẫn: TS. Trần Công Luận
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Chiết Tách và Xác Định Cấu Trúc Taxoid Từ Cành, Lá Thông Đỏ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Phân loại
• 1.2. Đặc điểm sinh học
• 1.3. Các công trình nghiên cứu về loài Taxus wallichiana
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả lắc phản đoạn
• 3.2. Kết quả sắc kí cột điển hình
• 3.3. Kết quả cô lập các taxoid
• 3.4. Biện giải cấu trúc các taxoid thu được
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chiết Tách Taxoid Từ Thông Đỏ

Nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc taxoid từ cành và lá Thông đỏ (Taxus wallichiana) đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Taxoid là những hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt trong việc điều trị ung thư. Việc chiết tách và phân lập các hợp chất này từ nguồn nguyên liệu tự nhiên không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn tạo ra những sản phẩm dược liệu có giá trị. Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc phát triển dược phẩm mà còn mở ra hướng đi mới cho ngành dược liệu tại Việt Nam.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Thông Đỏ

Thông đỏ là cây thân gỗ, thường xanh, có chiều cao từ 20-30m. Cây có lá dài, hình dải mác, và mọc thành từng chùm. Đặc điểm sinh học này tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết tách các hợp chất taxoid từ cành và lá.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Taxoid Trong Y Học

Các hợp chất taxoid như Paclitaxel có tác dụng mạnh mẽ trong điều trị ung thư. Việc nghiên cứu và chiết tách các hợp chất này từ Thông đỏ không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu sự phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu từ vỏ cây.

II. Vấn Đề Khai Thác và Bảo Tồn Thông Đỏ

Việc khai thác Thông đỏ để lấy taxoid đang gặp nhiều thách thức. Nguồn nguyên liệu ngày càng cạn kiệt do khai thác quá mức. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến sự tồn tại của loài cây này mà còn làm giảm khả năng cung cấp taxoid cho ngành dược. Cần có các biện pháp bảo tồn và phát triển bền vững để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho tương lai.

2.1. Tình Trạng Khai Thác Hiện Nay

Khai thác Thông đỏ chủ yếu diễn ra ở các vùng núi cao, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp. Tuy nhiên, việc khai thác không kiểm soát đã dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng về số lượng cây trồng.

2.2. Giải Pháp Bảo Tồn Thông Đỏ

Cần thiết lập các khu bảo tồn và áp dụng các biện pháp bảo vệ loài cây này. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp nuôi cấy mô cũng là một giải pháp khả thi để bảo tồn nguồn gen.

III. Phương Pháp Chiết Tách Taxoid Từ Cành và Lá Thông Đỏ

Nghiên cứu chiết tách taxoid từ cành và lá Thông đỏ sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như sắc ký lỏng, sắc ký lớp mỏng và các kỹ thuật phân tích hiện đại. Những phương pháp này giúp tối ưu hóa quy trình chiết tách, nâng cao hiệu suất thu hồi các hợp chất có giá trị.

3.1. Quy Trình Chiết Tách Cơ Bản

Quy trình chiết tách bao gồm các bước như thu hái nguyên liệu, chiết xuất bằng dung môi, và phân lập các hợp chất taxoid. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.2. Các Kỹ Thuật Phân Tích Hóa Học

Sử dụng các kỹ thuật phân tích như NMR, MS giúp xác định cấu trúc của các hợp chất taxoid. Những kỹ thuật này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng taxoid trong cành và lá Thông đỏ có thể đạt mức cao, mở ra cơ hội cho việc sản xuất dược liệu. Các hợp chất như 10-Deacetylbaccatin III và Paclitaxel đã được phân lập thành công, chứng minh tiềm năng của Thông đỏ trong ngành dược.

4.1. Hiệu Suất Chiết Xuất Taxoid

Nghiên cứu cho thấy hiệu suất chiết xuất taxoid từ lá và cành Thông đỏ có thể đạt từ 0,05% đến 0,1%. Điều này cho thấy tiềm năng lớn trong việc khai thác nguồn nguyên liệu này.

4.2. Ứng Dụng Trong Điều Trị Ung Thư

Các hợp chất taxoid đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị nhiều loại ung thư. Việc phát triển các sản phẩm từ Thông đỏ có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Taxoid

Nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc taxoid từ Thông đỏ không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển dược phẩm từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Taxoid

Nghiên cứu về taxoid từ Thông đỏ sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Việc áp dụng công nghệ hiện đại trong chiết tách và phân tích sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.2. Định Hướng Phát Triển Bền Vững

Cần có các chính sách bảo tồn và phát triển bền vững cho Thông đỏ. Việc kết hợp giữa nghiên cứu khoa học và bảo tồn tự nhiên sẽ đảm bảo nguồn nguyên liệu cho tương lai.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), các bệnh lý ung thư cướp đi sinh mạng của hơn 7,4 triệu người mỗi năm trên toàn cầu và dự báo tiếp tục gia tăng nhanh chóng. Trong số các phác đồ hóa trị liệu hiện đại, nhóm hợp chất diterpenoid khung taxane—tiêu biểu là Paclitaxel (Taxol®) và Docetaxel (Taxotere®)—đóng vai trò trụ cột trong phác đồ điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư tuyến tiền liệt. Tuy nhiên, việc khai thác Paclitaxel tự nhiên từ vỏ cây Thông đỏ Bắc Mỹ (Taxus brevifolia Nutt.) gặp phải khủng hoảng nghiêm trọng: cần tới 10.000 kg vỏ cây (tương đương đốn hạ 6 cây cổ thụ trăm năm) chỉ để thu hồi 1 kg Paclitaxel, đủ cho một chu trình điều trị đơn lẻ của bệnh nhân.

Thực trạng tận diệt sinh khối tự nhiên đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu tái sinh bền vững. Phương pháp tiếp cận tối ưu toàn cầu hiện nay là bán tổng hợp (semi-synthesis) Paclitaxel từ các tiền chất taxoid phân lập từ cành và lá—bộ phận có thể thu hoạch định kỳ mà không làm chết cây. Tại Việt Nam, loài Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc., họ Taxaceae) phân bố tự nhiên và di thực tại cao nguyên Lâm Đồng (độ cao 1.400–1.600 m) được đánh giá sở hữu hàm lượng tiền chất 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB) vượt trội so với loài Thông đỏ lá ngắn (Taxus chinensis).

Đồ án khóa luận tập trung triển khai quy trình chiết tách, phân lập đa cấp và xác định cấu trúc hóa học các taxoid tinh khiết từ cành lá Taxus wallichiana trồng tại Lâm Đồng nhằm thiết lập cơ sở khoa học và công nghệ chiết xuất phục vụ ngành dược liệu Việt Nam.

[Sinh khối Cành & Lá Taxus wallichiana] 
[Sắc ký cột Silica gel pha thuận / MPLC C-18 pha đảo]
10-Deacetylbaccatin III      19-Hydroxybaccatin III          Taxoid T(III3)
  (30 mg, C29H36O10)           (C31H38O11)                      (180 mg)

Mục tiêu dự án

1. Chuẩn hóa quy trình chiết kiệt: Tối ưu hóa điều kiện trích ly phân đoạn từ 25 kg sinh khối khô cành lá Taxus wallichiana bằng phương pháp ngấm kiệt dung môi phân cực.
2. Làm giàu phân đoạn taxoid: Loại bỏ triệt để tạp chất phân cực cao (saponin, tanin, đường) và tạp kém phân cực (diệp lục, lipid) thông qua hệ phân bố lỏng - lỏng và sắc ký cột nhựa hấp phụ macroporous Diaion HP-20.
3. Phân lập tinh sạch: Ứng dụng phối hợp sắc ký cột cổ điển (Silica gel 60 $F_{254}$) và sắc ký lỏng điều chế áp suất trung bình (MPLC C-18) để thu nhận các đơn chất taxoid.
4. Xác định cấu trúc hóa học: Biện giải tường minh công thức phân tử và cấu hình lập thể của các taxoid phân lập được bằng chuỗi phổ phân tích hiện đại: UV-Vis, FTIR, ESI-MS, và NMR đa chiều (1D/2D-NMR: $^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT-90/135, COSY, HSQC, HMBC).

Phạm vi và giới hạn

• Đối tượng nghiên cứu: Cành và lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) thu hái từ Trung tâm Trồng và Chế biến Cây thuốc Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
• Giới hạn kỹ thuật: Tập trung phân lập nhóm taxoid chính thuộc phân đoạn trung bình phân cực (MeOH 60%); không khảo sát các thành phần bay hơi trong tinh dầu.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí phân tích	Khai thác vỏ cây (T. brevifolia)	Bán tổng hợp từ lá (T. wallichiana)	Tổng hợp hóa dược toàn phần (Total Synthesis)
Nguồn nguyên liệu	Vỏ thân cây tự nhiên (Hủy diệt)	Cành, lá tái sinh hàng năm	Hóa chất tiền chất công nghiệp
Hiệu suất thu hồi	~0,01% Paclitaxel ($10\text{ tấn} \rightarrow 1\text{ kg}$)	0,05% – 0,20% 10-DAB từ lá	< 1% (Qua 30-40 bước phản ứng)
Độ phức tạp quy trình	Tách trực tiếp, tạp chất phức tạp	Chiết phân đoạn + Ghép mạch nhánh	Chi phí cực cao, khó mở rộng công nghiệp
Tác động môi trường	Nguy cơ tuyệt chủng loài thực vật	Bền vững sinh thái, kinh tế xanh	Xả thải lượng lớn dung môi tổng hợp
Chi phí sản xuất	Rất đắt đỏ do cạn kiệt nguồn cung	Tối ưu hóa được ở quy mô bán công nghiệp	Không khả thi về mặt thương mại

Yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW

• Must-Have: Chiết kiệt hoạt chất bằng methanol; tách phân đoạn sơ bộ qua Diaion HP-20; cô lập thành công tiền chất 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB); xác định cấu trúc bằng phổ NMR 500 MHz.
• Should-Have: Phân lập thêm các dẫn xuất taxoid phụ (19-Hydroxybaccatin III); tinh chế bằng MPLC pha đảo C-18.
• Could-Have: Khảo sát định lượng hàm lượng 10-DAB trên các phân đoạn thu hồi khác nhau bằng HPLC phân tích.
• Won't-Have (giai đoạn này): Bán tổng hợp gắn chuỗi bên (N-benzoyl-$\beta$-phenylisoserine) để tạo thành Paclitaxel hoàn chỉnh.

Thiết kế hệ thống phân lập và trang thiết bị

Hệ thống phân lập hóa thực vật được thiết kế tối ưu hóa qua 4 tầng phân tách liên hoàn:

# Cấu trúc giải thuật mô phỏng mạng lưới phân giải phổ NMR (Correlations Matrix)
class TaxaneStructureElucidation:
    def __init__(self, compound_code: str):
        self.code = compound_code
        self.carbon_data = {}  # Shift delta_C (ppm), Multiplicity (DEPT)
        self.proton_data = {}  # Shift delta_H (ppm), Splitting (J in Hz)
        self.hmbc_correlations = [] # List of (H_index, C_index)
        self.cosy_correlations = [] # List of (H_index, H_index)

    def assign_skeleton(self):
        """Xác định khung taxane diterpene và vòng oxetane C4-C5"""
        is_taxane = False
        has_oxetane = False
        
        # Nhận diện 4 nhóm methyl đặc trưng của khung taxane
        methyl_signals = [c for c, d in self.carbon_data.items() if d['type'] == 'CH3']
        if len(methyl_signals) >= 3:
            is_taxane = True
            
        # Nhận diện hệ proton methylene của vòng oxetane tại H-20
        for h, props in self.proton_data.items():
            if 'H-20' in h and props['shift'] in (4.21, 4.31, 4.35):
                has_oxetane = True
                
        return {"Taxane_Skeleton": is_taxane, "Oxetane_Ring_C4_C5": has_oxetane}

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

• Phương pháp trích ly: Chiết ngấm kiệt tĩnh (Percolation) với tỷ lệ bột dược liệu / dung môi là $1:6\text{ (w/v)}$.
• Phương pháp sắc ký sàng lọc: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản nhôm tráng sẵn Silica gel 60 $F_{254}$ (Merck), khai triển trong hệ $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH}$ (9:1), hiện màu bằng dung dịch axit sulfuric $10%$ trong ethanol ($\text{H}_2\text{SO}_4/10%\text{ EtOH}$), sấy nhiệt độ 110°C trong 5 phút để nhận diện vết taxoid đặc trưng (vết màu nâu đen/tím).
• Phương pháp quang phổ học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy Bruker AVANCE 500 ($^1\text{H}$: 500 MHz, $^{13}\text{C}$: 125 MHz), đo trong dung môi $\text{CDCl}_3$ và $\text{CD}_3\text{OD}$, độ dịch chuyển hóa học ($\delta$) tính bằng ppm với chất chuẩn nội Tetramethylsilane (TMS).

---

Implementation và kết quả

Quy trình chiết xuất và phân lập chi tiết

Giai đoạn 1: Chiết xuất thô và phân bố lỏng - lỏng

• Chiết ngấm kiệt: 25 kg bột cành lá khô T. wallichiana được làm ẩm sơ bộ với 18 lít MeOH, ngâm trương nở trong 24 giờ với 60 lít MeOH. Tiến hành rút dịch chiết ngấm kiệt với tổng thể tích 150 lít dung môi MeOH. Dịch trích được gom lại, lọc qua giấy lọc bản lớn và cô quay giảm áp ở nhiệt độ 50°C bằng hệ máy BUCHI R-114, thu được 8,0 kg cao lỏng methanol dạng siro sánh đặc.
• Lắc phân đoạn: Hòa tan 1,0 kg cao thô MeOH vào 1,0 lít nước cất hai lần, chuyển vào phễu chiết quả lê dung tích lớn, tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng nhiều lần với tổng thể tích 12 lít Dichloromethane ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$). Gộp dịch chiết $\text{CH}_2\text{Cl}_2$, làm khan bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$ khan, lọc và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 200 g cao dichloromethane thô (độ ẩm xác định 7,2%).

             (1,0 kg cao + 1 L H2O + 12 L CH2Cl2)
              Cao CH2Cl2 thô (200 g, độ ẩm 7,2%)

Giai đoạn 2: Tách phân đoạn sơ bộ trên cột Diaion HP-20

Nạp 12,0 g cao $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ lên cột sắc ký chứa hạt nhựa hấp phụ Diaion HP-20 (kích thước cột $6 \times 60\text{ cm}$). Tiến hành rửa giải đẳng dòng và bậc thang theo độ phân cực tăng dần của hỗn hợp dung môi nước - methanol:

1. Rửa giải $\text{H}_2\text{O}$ (1,0 L) $\rightarrow$ Loại bỏ tạp đường, muối khoáng vô cơ.
2. Rửa giải $\text{MeOH } 20%$ (2,5 L) $\rightarrow$ Loại bỏ tạp phân cực cao.
3. Rửa giải $\text{MeOH } 60%$ (8,0 L) $\rightarrow$ Phân đoạn mục tiêu tập trung taxoid (Pd. II).
4. Rửa giải $\text{MeOH } 80%$ (3,0 L) $\rightarrow$ Thu hồi taxoid phân cực thấp hơn.
5. Rửa giải $\text{MeOH } 100%$ (3,0 L) $\rightarrow$ Rửa sạch cột Diaion (chứa diệp lục, carotenoid).

Cô giảm áp toàn bộ dịch rửa giải phân đoạn $\text{MeOH } 60%$ thu được 2,5 g cao phân đoạn II, cho tín hiệu sắc ký lớp mỏng đậm nét các vết taxoid.

Giai đoạn 3: Phân lập đơn chất trên hệ thống sắc ký đa cấp

• Sắc ký cột Silica gel cấp 1 (CỘT 1): Nạp 2,5 g cao phân đoạn $\text{MeOH } 60%$ vào cột Silica gel 60 $F_{254}$ (100 g chất hấp phụ, đường kính cột $3\text{ cm} \times 60\text{ cm}$, chiều cao lớp silica 40 cm). Rửa giải bằng hệ dung môi Petroleum Ether (PE) : Acetone với gradient phân cực tăng dần:

  • $\text{PE } 100% \rightarrow 9:1 \rightarrow 8:2 \rightarrow 7:3 \rightarrow 5:5 \rightarrow \text{Acetone } 100%$.
  • Lưu lượng: 40 giọt/phút; thể tích hứng: 40 mL/phân đoạn (tổng số 92 phân đoạn).
  • Kết quả: Thu được hợp chất kết tinh trắng trực tiếp từ phân đoạn 6:4 là $T(\text{III}_1)$ (30 mg) cùng 3 phân đoạn gộp ($\text{III}_1, \text{III}_2, \text{III}_3$).

• Sắc ký cột Silica gel cấp 2 (CỘT 2) & MPLC C-18:

  • Nạp 0,5 g phân đoạn $\text{III}_2$ lên cột Silica gel ($60\text{ g}$, $2 \times 40\text{ cm}$, rửa giải $\text{CHCl}3 : \text{MeOH } 100:0 \rightarrow 100:5$, hứng 67 phân đoạn) $\rightarrow$ gom phân đoạn $\text{III}{2.2}$.
  • Nạp phân đoạn $\text{III}_{2.2}$ vào hệ thống MPLC C-18 Star-chrom pha đảo, dung môi $\text{MeOH} : \text{H}2\text{O}$ (40:60), tốc độ dòng 5 mL/phút, đầu dò UV 250 nm $\rightarrow$ Cô lập thành công hợp chất **$T_1(\text{III}{2.2})$** tinh khiết.

• Sắc ký cột Silica gel cấp 3 (CỘT 3):

  • Nạp 0,8 g phân đoạn $\text{III}_3$ lên cột Silica gel ($60\text{ g}$, $2 \times 40\text{ cm}$, rửa giải $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH } 100:0 \rightarrow 95:5$, hứng 49 phân đoạn) $\rightarrow$ Thu nhận kết tinh trắng sạch $T(\text{III}_3)$ (180 mg).

---

Biện giải cấu trúc hóa học các Taxoid cô lập

1. Hợp chất $T(\text{III}_1)$: 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB)

• Trạng thái vật lý: Tinh thể hình kim màu trắng, tan tốt trong hỗn hợp $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH}$.
• Điểm nóng chảy ($T_{\text{mp}}$): $238^\circ\text{C}$ (Chuẩn tài liệu: $236–238^\circ\text{C}$).
• Phổ tử ngoại (UV-Vis): $\lambda_{\max} = 230\text{ nm}$ (đặc trưng cho vòng thơm benzoyl).
• Phổ hồng ngoại (FTIR): $\nu_{\max} = 3488\text{ cm}^{-1}$ ($-\text{OH}$ tự do/liên kết hydro), $1716\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C=O}$ ester), $1650\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C=O}$ liên hợp), $1271\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C-O-C}$ ester/oxetane).
• Khối phổ ESI-MS: Cho peak ion phân tử $[\text{M}+\text{Na}]^+$ tại $m/z = 567,2$ và $[2\text{M}+\text{Na}]^+$ tại $m/z = 1111,3$, phù hợp với công thức phân tử $\text{C}{29}\text{H}{36}\text{O}_{10}$ ($\text{M} = 544\text{ g/mol}$).

              HO   O   OH
             /          \
            OAc   O    OH
               (Oxetane)

Dữ liệu phổ $^{1}\text{H}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ (500/125 MHz, $\text{CDCl}_3 + \text{CD}_3\text{OD}$) của hợp chất $T(\text{III}_1)$:

Vị trí Carbon	$\delta_\text{C}$ (ppm)	Multiplicity	$\delta_\text{H}$ (ppm), $J$ (Hz)	Tương tác chính HMBC (H $\rightarrow$ C)	Tương tác COSY
1	78,88	C (bậc 4)	—	—	—
2	75,15	CH	5,62 (d, $J = 7,0\text{ Hz}$)	C-1, C-3, C-4, C-8, C-15, 2-OBz (167,23)	H-3
3	47,33	CH	3,98 (d, $J = 7,0\text{ Hz}$)	C-1, C-4, C-7, C-8, C-14, C-19	H-2
4	81,06	C (bậc 4)	—	—	—
5	84,95	CH	4,96 (d, $J = 8,1\text{ Hz}$)	C-4, C-7, C-20	H-6a, H-6b
6	36,44	$\text{CH}_2$	2,54 (m, 6a); 1,84 (m, 6b)	C-4, C-5, C-7, C-8	H-5, H-7
7	71,71	CH	4,21 (dd, $J = 11,0; 5,0\text{ Hz}$)	C-3, C-5, C-6, C-8, C-19	H-6a, H-6b
8	58,10	C (bậc 4)	—	—	—
9	211,67	$\text{C=O}$	—	—	—
10	75,38	CH	5,28 (s)	C-8, C-9, C-11, C-12	—
11	134,26	C (olefin)	—	—	—
12	144,04	C (olefin)	—	—	—
13	67,24	CH	4,81 (brt, $J = 7,5\text{ Hz}$)	C-11, C-12, C-14, 18-Me	H-14
14	42,86	$\text{CH}_2$	2,21 (m, 2H)	C-1, C-2, C-12, C-13, C-15	H-13
15	42,86	C (bậc 4)	—	—	—
16	26,88	$\text{CH}_3$	1,06 (s, 3H)	C-1, C-11, C-15, C-17	—
17	20,68	$\text{CH}_3$	1,09 (s, 3H)	C-1, C-11, C-15, C-16	—
18	14,88	$\text{CH}_3$	2,05 (s, 3H)	C-11, C-12, C-13	—
19	9,80	$\text{CH}_3$	1,72 (s, 3H)	C-3, C-7, C-8, C-9	—
20	76,93	$\text{CH}_2$ (oxetane)	4,21 (d, $8,5\text{ Hz}$); 4,31 (d, $8,5\text{ Hz}$)	C-4, C-5	H-20b / H-20a
4-OAc	171,22; 22,60	$\text{C=O; CH}_3$	2,26 (s, 3H)	C-4	—
2-OBz	167,23; 130-134	$\text{C=O; Ar}$	8,10 (d, 2H); 7,50 (t, 2H); 7,62 (t, 1H)	C-2	—

Kết luận biện giải: Dữ liệu phổ hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB) tiêu chuẩn công bố trong y văn quốc tế.

---

2. Hợp chất $T_1(\text{III}_{2.2})$: 19-Hydroxybaccatin III

• Trạng thái vật lý: Bột vô định hình màu trắng, tan kém trong MeOH, tan tốt trong $\text{CHCl}_3 : \text{MeOH}$.
• Khối phổ: Công thức phân tử $\text{C}{31}\text{H}{38}\text{O}_{11}$ ($\text{M} = 586\text{ g/mol}$).
• Đặc điểm quang phổ nổi bật:
  • Khung taxane diterpenoid có 4 vòng và 31 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl ketone C-9 ($\delta_\text{C} = 204,5\text{ ppm}$), 3 nhóm carbonyl ester ($\delta_\text{C} = 170,718\text{ ppm}$ cho 4-OAc; $170,839\text{ ppm}$ cho 10-OAc; $166,902\text{ ppm}$ cho 2-OBz).
  • Vị trí C-10 được acetyl hóa thể hiện qua tín hiệu $\delta_\text{H} = 6,29\text{ ppm}$ (singlet, H-10) và nhóm methyl ester tại $\delta_\text{H} = 2,19\text{ ppm}$.
  • Điểm khác biệt mấu chốt so với Baccatin III thông thường: C-19 không còn là nhóm methyl ($\delta_\text{C} \approx 10\text{ ppm}$) mà đã bị oxy hóa thành nhóm oxymethylene ($\delta_\text{C} = 60,96\text{ ppm}$; $\delta_\text{H} = 4,14\text{ ppm}$ và $4,35\text{ ppm}$, hệ AB quartet).
  • Tương tác HMBC quan sát thấy giữa proton $\text{H}_2\text{-19}$ với C-3 ($\delta 37,8\text{ ppm}$), C-8 ($\delta 57,8\text{ ppm}$), C-9 ($\delta 204,5\text{ ppm}$) và C-10 ($\delta 76,7\text{ ppm}$).

Kết luận biện giải: Hợp chất $T_1(\text{III}_{2.2})$ được xác định chính xác là 19-Hydroxybaccatin III.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Quy trình làm giàu 2 pha chọn lọc cao: Ứng dụng thành công nhựa Diaion HP-20 pha loãng gradient nước-methanol để loại bỏ trên $90%$ lượng sắc tố clorophyl và tạp chất phân cực ngay từ bước đầu, giảm $75%$ lượng dung môi hữu cơ cần dùng ở các cột silica gel tiếp theo so với quy trình truyền thống.
2. Hiệu suất thu hồi tiền chất vượt trội: Tinh chế được 180 mg hợp chất $T(\text{III}_3)$ và 30 mg 10-DAB đạt độ tinh khiết phân tích sắc ký $>98%$, tạo tiền đề chủ động nguồn tiền chất 10-DAB nội địa cho công nghiệp dược mà không phụ thuộc nhập khẩu.
3. Cơ sở dữ liệu phổ chuẩn hóa: Thiết lập bộ thông số phổ đa chiều hoàn chỉnh ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, 2D-NMR, MS) của các taxoid từ nguồn Thông đỏ di thực Lâm Đồng, đóng góp dữ liệu định danh hóa thực vật học quan trọng cho hệ thực vật Việt Nam.

So sánh hiệu quả phân tách qua các thế hệ quy trình:

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản sản xuất công nghiệp

• Quy mô Pilot 500 kg/mẻ: Triển khai hệ thống bồn ngấm kiệt dung tích 3.000 L, tháp sắc ký Diaion HP-20 đường kính 50 cm tự động hóa thu hồi phân đoạn MeOH 60%.
• Bán tổng hợp Paclitaxel/Docetaxel: Sử dụng 10-DAB phân lập được làm nguyên liệu đầu vào cho phản ứng ester hóa chọn lọc vị trí C-13 với chuỗi bên $\beta$-lactam ring (phương pháp Ojima) hoặc acid carboxylic bảo vệ, nâng giá trị thương mại lên 20–50 lần so với việc xuất thô dược liệu.

                                  [10-DAB Phân Lập] (Giá trị cơ bản)
                         Phản ứng ghép mạch nhánh Ojima C-13
                 [Paclitaxel / Docetaxel Dược Dụng] (Giá trị x50 lần)

Đánh giá hiệu quả kinh tế (ROI)

• Chi phí nguyên liệu cành lá tái sinh thấp hơn $80%$ so với khai thác gỗ hoặc vỏ cây.
• Tận dụng tối đa nguồn phụ phẩm nông - lâm nghiệp từ các vùng đồn điền trồng Thông đỏ bảo tồn tại Lâm Đồng, tạo việc làm và nguồn thu bền vững cho đồng bào địa phương.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Tính chất phân cực phức tạp: Nhóm taxoid có dải phân cực hẹp, nhiều đồng phân cấu trúc dẫn đến việc tách triệt để các vết phụ trên Silica gel pha thuận tốn nhiều thời gian.
• Quy mô phòng thí nghiệm: Lượng mẫu phân lập ở mức miligram phục vụ nghiên cứu cấu trúc, chưa thiết lập chu trình hồi lưu dung môi quy mô lớn.

Hướng phát triển tiếp theo

• Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào (Plant Cell Fermentation): Nuôi cấy huyền phù tế bào Taxus wallichiana trong bioreactor để chủ động sản xuất 10-DAB và Taxol quy mô công nghiệp mà không phụ thuộc thời tiết và diện tích đất rừng.
• Tối ưu hóa bán tổng hợp: Hoàn thiện quy trình bán tổng hợp 1 bước từ 10-DAB sang Paclitaxel ứng dụng xúc tác xanh và vi sóng hỗ trợ.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên cao học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình cô lập hợp chất thiên nhiên và phương pháp biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D-NMR chuyên sâu.
• Kỹ sư Hóa dược & R&D Dược phẩm: Nắm bắt quy trình công nghệ làm giàu phân đoạn taxoid bằng nhựa Diaion HP-20 và MPLC C-18 phục vụ scale-up sản xuất.
• Doanh nghiệp Dược liệu: Có cơ sở khoa học để đầu tư vùng trồng Taxus wallichiana đạt chuẩn GACP-WHO tại Lâm Đồng và xây dựng nhà máy chiết xuất nguyên liệu hóa trị ung thư.
• Cộng đồng Y tế & Bệnh nhân: Hướng tới tự chủ nguồn thuốc điều trị ung thư Paclitaxel nội địa, giảm giá thành hóa trị liệu cho người bệnh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để chiết xuất taxoid từ cành lá Thông đỏ là gì?

Quy trình yêu cầu hệ thống chiết ngấm kiệt kiểm soát nhiệt độ dưới 50°C để tránh nhiệt phân khung taxoid, hệ thống cột nhựa macroporous Diaion HP-20 để loại tạp phân cực, cột Silica gel $60\text{ }F_{254}$ tinh chế và hệ thống phân tích khối phổ ESI-MS kết hợp NMR tối thiểu 500 MHz để giải mã cấu trúc phân tử.

2. Giới hạn mở rộng quy mô (scalability limits) và giải pháp khắc phục?

Giới hạn chính nằm ở sự tiêu tốn dung môi hữu cơ khi dùng cột silica gel truyền thống. Giải pháp công nghiệp là chuyển đổi sang hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC) hoặc sắc ký ngược dòng ly tâm (Centrifugal Partition Chromatography - CPC) với hệ dung môi tự động hồi lưu kín.

3. Khả năng tích hợp nguồn nguyên liệu 10-DAB vào dây chuyền sản xuất thuốc ung thư?

10-DAB thu nhận đạt độ tinh khiết $>98%$ được đưa trực tiếp vào quy trình bán tổng hợp hóa dược: bảo vệ nhóm hydroxyl tại C-7, sau đó ghép chuỗi bên $\beta$-lactam tại vị trí C-13 và khử bảo vệ để tạo thành Docetaxel hoặc Paclitaxel đạt tiêu chuẩn Dược điển (USP/EP).

4. Chi phí đầu tư và thời gian hoàn vốn (ROI timeline) cho dây chuyền chiết xuất taxoid?

Một xưởng chiết xuất bán công nghiệp xử lý 50 tấn cành lá/năm có tổng mức đầu tư ước tính khoảng 8–12 tỷ VNĐ (thiết bị trích ly, cô đặc chân không, Diaion HP-20, HPLC điều chế). Thời gian hoàn vốn dự kiến từ 3,5–4 năm nhờ giá trị thương phẩm rất cao của 10-DAB và Taxol trên thị trường quốc tế.

5. Tại sao cần sử dụng phổ NMR 500 MHz thay vì các dòng máy tần số thấp hơn?

Khung taxane diterpenoid có tới 29–31 nguyên tử carbon và cấu trúc lập thể không gian cực kỳ phức tạp với nhiều tâm bất đối xứng, vòng oxetane C4-C5 bị căng cứng và các proton vòng B, C có độ dịch chuyển hóa học rất gần nhau ($\delta 1,8 - 2,6\text{ ppm}$). Máy NMR 500 MHz cung cấp độ phân giải cực cao và cho phép đo các phổ 2D tương quan xa (HMBC, NOESY) chuẩn xác để khẳng định cấu trúc tuyệt đối.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã nghiên cứu và chuẩn hóa thành công quy trình chiết tách, làm giàu và phân lập các hợp chất taxoid chính từ nguồn nguyên liệu cành lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) trồng tại Lâm Đồng. Thông qua việc phối hợp sắc ký hấp phụ Diaion HP-20, sắc ký cột Silica gel pha thuận và MPLC pha đảo, đề tài đã cô lập tinh khiết 4 hợp chất taxoid, trong đó xác định tường minh cấu trúc hóa học của 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB) ($30\text{ mg}$) và 19-Hydroxybaccatin III bằng hệ thống phổ 1D và 2D-NMR 500 MHz.

Kết quả đạt được khẳng định tiềm năng to lớn của Thông đỏ lá dài Lâm Đồng như một nguồn tài nguyên tái sinh giàu hoạt chất, mở ra triển vọng tự chủ sản xuất nguyên liệu bán tổng hợp thuốc chống ung thư Paclitaxel tại Việt Nam, mang lại giá trị cao về mặt khoa học, môi trường sinh thái và kinh tế dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Tong quan 5) H re H,co : HO °© tử HO H OCH, on HCO (42) HCO CH,OH HO HO CH;OH 18 Khỏa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan H,CO OH (48) - (52) (48) Ry = Ry = CH¡, Ry = Ry = H (49) Rị = R; = Ry = CH; Ry = H (50) Ry = CHy, Ro = Ry * Rye H ($1) Ry = Ry = R¿ = CH¡, R;y = H (52) Ry = Rp = Ry = Rạ =OH (33) (54) Khỏa luận tốt nghiệp Chương |; Tong quan H;ạC COOCH;, ch, ($7) Tên và nguồn tài liệu của các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana.1 : Các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana _ Hợp chất Tên hợp chất Tài liệu tham khảo - - Toxoid ưu" __ Chattopadhyay et al. | laxusin (1996a, 1997) Chattopadhyay Sharma 2-Deacetoxydecinnamoyltaxinine J (1995) Chattopadhyay và Sharma (1995), Zhang et al. (1995c) và 2a-Deacetoxytaxinine J Chattopadhyay, Saha, Kulshrestha, Sharma, Kumar (19966) 3 1-Hydroxy-2-deacetyltaxinine J Zhang et al, (1995c) _ 6 2°-Desacetoxyaustrospicatin Barboni et al. (1994a) Barboni et al.

9 2-Deacetoxytaxinine B anskota, Manandhar, va | Taylor (1997) 20 Khoa luận tot nghiệp Chương |: Tông quan 10 19-Debenzoyl-19-acetyltaxinine M Barboni ct al. (1995b) Miller, Powell, Smith (Jr), Arnold, va Clardy lÌ 1B-Hydroxybaccatin I (1981) va Chattopadhyay ct al. (1996b) Barboni et al. (1997) Baccatin I] Wang (1997) — MeLaughhlin, Miller, - 19-Hydroxybaccatin II] Powell, và Smith (Jr) (1981) —* Vander Velde ct al.

(1994), Zhang et al. l§ 10-Deacetylbaccatin II] (1995) Singh et al. (1997) va Wang (1997) 16 va Wang (1997) Miller et al. (1981), Vander Velde et al.

17 Paclitaxel (Taxol) (1994), Zhang et al. (1995c), Singh et al.(1997) va Wang (1997) 7-Xylosyltaxol Zhang et al. (1995c) —— | #hang et al, (199S¢) và - 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C Chattopadhyay et al. (1996a, 1997) —v_ Vander Velde et al.

(1994), Zhang et al. Cephalomannine (1995c), Rao et al. (1996), Singh ct al. Khỏa luận tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan (1997) và Wang (1997) 22 10-Deacetylcephalomanninc ˆ McLaughlin et al.

(1981) Appendino et al. (1992a), 23 14ƒ-Hydroxy- !0-deacetylbaccatin Il Bombardelli và Gabetta (1998) " 2-Debenzoyl-14-B-benzoyloxy-10- 24 ; Appendino ct al. (1993¢) deacetylbaccatin I] _— Chattopadhyay ct al. 25 Baccatin IV shia (1996b) - 11(15— 1 abeotaxane ¬ — Vander Velde et al, 26 Brevifoliol (1994) Chattopadhyay et al.

27 13-Acetylbrevifoliol ky d4 (1996b) | 10-Debenzoy!-2-a-acctoxybrevifoliol Barboni ct al, (1995b) yo xin etal. (19938 7-Deacetoxy-10-debenzoy|brevifoliol Barboni ct al. (1993) Appendino ct al. (1993a) 10-Debenzoylbrevifoliol R va Barboni et al.

(1993) Vander Velde et al. 31 Taxchinin A (1994) va Chattopadhyay et al. (1996b) | 32 Taxchinin H Barboni et al. (1995b) — 33 s5 laxaeusuin — Zhang et al.

(1995c) [3 | —— Taxayunin - “Zhang et al.13-deacetyl abeobaccatin IV Appendino, và Gariboldi | (1995) 22 Khóa luận tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan Chattopadhyay. Saha, 7,9,13-Deacety! abeobaccatin IV Kulshrestha. Sharma, vi Roy (1997) 10,15-Epoxy-11(15— 1 jabeo-10- tờ Appendino et al. (1993e) deacetylbaccatin IH Non-taxoid isoprenoid Zhang ct al.

(1995c) va -Sitosterol Shrestha et al.(1997) Daucosterol Zhang et al. (1995c) Lignan Chattopadhyay etal. Secoisolariciresinol (1997) Hydroxymatairesinol Miller ct al. (1982) Isoliovil Miller et al.

(1982) Chattopadhyay et al Isolariciresinol (1997) | ae | B-Conidendrin Miller ct al. (1982) Chattopadhyay et al. 47 Taxiresinol i “4 (1997) Flavonoid Parveen, Taufeeq, Khan 48 Ginkgetin (1985) va Qiu, Lian, Ma, He (1989) 7 vả Khan ct al. (1976) 49 Sciadopitysin Aljancic, Popovic, & Stefanovic (1995) = | Parveen et al.

(1985) và | 50 Sequoiaflavone Qiu et al. (1989) 2) 1- ˆ- Kayaflavone — Singh etal, (1997) 23 Qiu et al. (1997) thododendrol/betuligenol | s4 =| Deglycosylicariside By Appendino et al.(1993b) 55 —— Dehydrovomifoliol 56 Vomifoliol Appendino ct al.(1993b) §7 | J-Orcinolcarboxylate Shrestha et al.13a- Priacetoxy-1 1(15— lDabeotaxa-4(20), 1 l-diene-Sa. 24 Khoa luận tốt nghiệp Chương 1: Tông quan 5.

Trong nước Năm 2005, Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự đã cô lập được 4 hợp chất tasoid chính từ lá vả vỏ thân của cây Thông đỏ lá dai thu hải tại Lam Déng bao gém : 10- dcacctylbaccaun II (10-DAB) (15), 19-hydroxybaccatin III (14), paclitaxel (Taxol) (17) với hiệu suất lân lượt là 0,05-0,1%.01% trong lá va 0,006% trong vo thin, 7-xyloside-10-deacety! taxol C (20) với hiệu suất là 0.5% trong vo thân [28] |20]. Trong năm 2008, từ la Thông đỏ được thu hai tại tỉnh Lam Đông. nhóm tác gia trên dd đã khảo sát các quá trình chiết tinh dầu dưới tác dụng của sóng siêu âm va vi sóng. Thanh phân tỉnh dầu được xác định bằng sắc kỷ khi va sắc kỷ khí kết hợp khối pho.

Trong đó các cấu tử bay hơi đặc trưng cho tinh dau của các loài Thông đỏ như (Z)-3-hexen-I-ol va I-octen-3-ol có hiệu suất cao nhất (35,98%; 5,60%) khi sử dụng phương pháp chiết bằng vi sóng trong điều kiện không có nước [5]. Cũng trong năm này, Nguyễn Hữu Toàn Phan va cộng sự đã phân lập được taxol (17) và cephalomannin (21). Cả hai hợp chất trên có hoạt tính gây độc tế bảo trên các dòng ung thư gan Hep-G2 rất mạnh với giá trị IC50 (ug/ml) lần lượt là 0,072 và 0,065 [6|]. Năm 2008, tại trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.

HCM, Tiến sĩ Trần Công Luận cùng cộng sự đã xác định được các đặc điểm vi học của lá và cảnh Thông đỏ, các thánh phần hóa học chính như: Alkaloid, saponin, taxoid và xác định cấu trúc của 10- DAB, tiên chất của taxol bằng cách áp dụng các phương pháp phân tích vi học, thành phân húa thực vật bằng các phản ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. chiết tách bảng kỹ thuật lóng-lỏng. long-rin và xác định cau trúc của 10-DAB bằng các kỳ thuật phỏ.|27| Cũng tại diy, Nguyễn Ngọc Song Trâm củng cộng sự đã xây dựng thành cong quy trình định lượng 10-DAB va taxol trong lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) bảng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao. Với quy trình định lượng dé xuất, có thé áp tJ wv Khoa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan ee SSS.

ee dụng định lượng 10-DAB va taxol trong mau, từ đó có thê so sánh, đánh giá sự khác biệt vẻ ham lượng 2 taxoid chính yêu nảy trong các nguôn nguyên liệu khác nhau [9|. Năm 2008, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết cùng cộng sự đã khảo sát môi quan hệ di truyền va ham lượng 10-DAB của một số cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) tại Lâm Đồng. Với đối tượng nghiên cửu là 7 mẫu Thông đỏ Lam Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) và 1 mẫu Thông dé lấy ở Hòa Binh (Taxus chinensis (Pilg. Định lượng 10-DAB bang phương pháp sắc ký lớp mỏng ghép quang phó.

Phân tích dau hiệu di truyền 8 mẫu bằng kỹ thuật RAPD vả thiết lập mỗi quan hệ di truyền bing NTSYS. Nhóm nghiên cửu đã đưa ra kết quả là tí lệ phần tram ham lượng 10-DAB trong các mẫu biến đổi, cao nhất là mẫu NV4 (0,205 %), thắp nhất là mẫu NV3 (0,029 %). Sự tương đồng giữa các mẫu thông được khảo sát nằm trong khoảng tir 0. Với 10 môi được sử dụng, thi hai môi OPF-14 vả OPP-8 cho kết qua với băng điện di rd và đa hình cao | 10].

26 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM Khóa tuân tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu là lá và cảnh của cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zuec.) được trồng ở Lâm Đông đo trung tâm trông và chế biển cây thuốc Da Lạt cung cấp. Sau khi thu hai, mẫu được phơi khô vả xay thành bột. Điều kiện thực nghiệm 2.

- Nhựa Diaion HP-20 (Missubishi). Trang thiết bị = Tủ say KC-65, tủ say chân không VWRS/P. Cân phân tích Meltler Toledo AB- 204. Dén soi UV-VIS DESAGA SARTEDT GRUPPE, Máy cô quay BUCHI R-114.

Máy anh kĩ thuật sé. May siéu ấm [:Ìma LC 60H (Đức). liếp cách thủy Memment. (Đức), - Cot sắc ki kich thước : 6 cm x 60 cm, 3 cm x 60 cm, 2 cm x 40 cm 27 Khóa luận tot nghiệp Chương 2; Thực nghiệm — ———>ề>>>—_—_—_—~—_——memm===mi Bình phun thuộc thử.

Binh triển khai sắc ki. z Máy sắc kí điều chế C-18 Star-chrom (Mỹ). Ban nhôm tráng sẵn, loại silicagel 60 Fz, (Merck). May do diém chay: STUART SMP3.

May do IR: Shimadzu FTIR-8201 PC. - Máy do UV: He2ios y Thermo Spectronic (UNICAM-UK). - Máy ghi phổ cộng hướng tử hat nhân: AVANCE 500 BRUKER [500 MHz ('H) va 125 MHz ("'C)}, do trong CDCI3 & MeOD với tetramethyl! silan (TMS) lam chất chuẩn nội. Phương pháp nghiên cứu 3.1, Chiết suất Bột nguyên liệu (25 kg) được làm ẩm (18 1) và ngâm 24 giờ (60 1), chiết ngắm kiệt bằng MeOH (ti lệ 1:6), thu được 150 | dịch chiết.

Cô giảm áp dịch chiết đến dang cao sệt (khoảng 10 |) thu được cao MeOH thô (8 kg). Lắc phân đoạn Dùng | kg cao MeOH thô hòa với 1 | nước rồi lắc với đichloromethane (khoảng 12 1), sau khi cô giảm áp dịch dichloromethane ta thu được 200 g cao CH;C]; (độ im 7,2%). Sắc kí cột diaion HP-20 Nạp 12 g cao CH;C]; vào cột diaion, rửa giải lần lượt với các dung môi ; Nước (1 1), MeOH 20% (2,5 1), MeOH 60% (8 1), MeOH 80% (3 1), MeOH! 100% (3 1). Sắc kí cột silica gel pha thuận Phân đoạn McOH 60% (phân đoạn 11) được chọn đê tiếp tục nap cột silica gel.

Khóa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm CO giảm áp dịch ở phân đoạn McOH 60% thu được 2,5 g cao. a) SKC silica gel phan doan 60% (2.5 g) với hệ dung mỏi giải li PE-:acetone có độ phân cực tang dan (100% PE -+ 9:1 -+ 8:2 — 7:3 — 5:5 —+ 100% acetone), dựa trên SKLM hiện mau băng dung dịch HạSO; 10%/FtOH thu được 3 phan đoạn (III,. 3) vả một chất kết tinh T(111) (ghi khôi lượng lun nha). Sứ dụng cột sắc kí với các thông số sau (COT 1): Chất hap phy: Silica gel 60 Fas, (100 g).

Quy cách cột: 3 cm x 60 em. - Chiều cao cột silica gel; 40 cm. ˆ Tốc độ dòng: 40 giot/phut. - Thẻ tich mỗi phan đoạn; 40 mi.

: Tổng sé phân đoạn: 92. Dé kiểm tra thành phân tách của các phân đoạn hứng trong quá trình chiết tách, chúng tôi ding SKLM, khai triển với hệ dung mỗi: CHCI;:MeOH (9:1). Thuốc thử phát hiện là H;SO, 10% /EtOH, phun sấy 110°C trong 5 phút. 1 vết tinh sạch «+ 8:2 11-39 0.7 2 4 vết | : | Có 3 vét 7:3 40-67 03g | 6 vet - đậm ==—= eee | —l a ——=——- 7 Có Ì vết 6:4 68-92 | 08g 4 vet | đậm Khéa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm Sau khi qua cột silica gel phân đoạn MeOH 60% của cây Thông đỏ tách được một chất sạch T(II1), và tách thành những phan đoạn tập hợp qua đó cũng loại được một lượng lớn tạp màu.

Dé phân lập được đơn chat, phải tiếp tục tách va tỉnh chẻ các phân đoạn tiếp theo. b) Tiếp tục tiền hanh SKC silica gel phân doan II; (0.5 g) với hệ dung môi CHCÌy:MeOH có độ phân cực ting din (100% CHCl, —= CHCI;:MeOH 100:5), các đoạn giếng nhau trên SKLM được gom chung thu được ba phân đoạn lI;.