Nghiên Cứu Chiết Tách và Xác Định Cấu Trúc Taxoid Từ Cành, Lá Thông Đỏ (Taxus Wallichiana)

Khóa luận trình bày phương pháp chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc các taxoid từ cành lá thông đỏ Taxus wallichiana tại Lâm Đồng.

• Tác giả: Châu Thị Nhã Trúc
• Người hướng dẫn: TS. Trần Công Luận
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Chiết Tách và Xác Định Cấu Trúc Taxoid Từ Cành, Lá Thông Đỏ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Phân loại
• 1.2. Đặc điểm sinh học
• 1.3. Các công trình nghiên cứu về loài Taxus wallichiana
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả lắc phản đoạn
• 3.2. Kết quả sắc kí cột điển hình
• 3.3. Kết quả cô lập các taxoid
• 3.4. Biện giải cấu trúc các taxoid thu được
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chiết Tách Taxoid Từ Thông Đỏ

Nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc taxoid từ cành và lá Thông đỏ (Taxus wallichiana) đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Taxoid là những hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt trong việc điều trị ung thư. Việc chiết tách và phân lập các hợp chất này từ nguồn nguyên liệu tự nhiên không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn tạo ra những sản phẩm dược liệu có giá trị. Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc phát triển dược phẩm mà còn mở ra hướng đi mới cho ngành dược liệu tại Việt Nam.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Thông Đỏ

Thông đỏ là cây thân gỗ, thường xanh, có chiều cao từ 20-30m. Cây có lá dài, hình dải mác, và mọc thành từng chùm. Đặc điểm sinh học này tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết tách các hợp chất taxoid từ cành và lá.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Taxoid Trong Y Học

Các hợp chất taxoid như Paclitaxel có tác dụng mạnh mẽ trong điều trị ung thư. Việc nghiên cứu và chiết tách các hợp chất này từ Thông đỏ không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu sự phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu từ vỏ cây.

II. Vấn Đề Khai Thác và Bảo Tồn Thông Đỏ

Việc khai thác Thông đỏ để lấy taxoid đang gặp nhiều thách thức. Nguồn nguyên liệu ngày càng cạn kiệt do khai thác quá mức. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến sự tồn tại của loài cây này mà còn làm giảm khả năng cung cấp taxoid cho ngành dược. Cần có các biện pháp bảo tồn và phát triển bền vững để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho tương lai.

2.1. Tình Trạng Khai Thác Hiện Nay

Khai thác Thông đỏ chủ yếu diễn ra ở các vùng núi cao, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp. Tuy nhiên, việc khai thác không kiểm soát đã dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng về số lượng cây trồng.

2.2. Giải Pháp Bảo Tồn Thông Đỏ

Cần thiết lập các khu bảo tồn và áp dụng các biện pháp bảo vệ loài cây này. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp nuôi cấy mô cũng là một giải pháp khả thi để bảo tồn nguồn gen.

III. Phương Pháp Chiết Tách Taxoid Từ Cành và Lá Thông Đỏ

Nghiên cứu chiết tách taxoid từ cành và lá Thông đỏ sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như sắc ký lỏng, sắc ký lớp mỏng và các kỹ thuật phân tích hiện đại. Những phương pháp này giúp tối ưu hóa quy trình chiết tách, nâng cao hiệu suất thu hồi các hợp chất có giá trị.

3.1. Quy Trình Chiết Tách Cơ Bản

Quy trình chiết tách bao gồm các bước như thu hái nguyên liệu, chiết xuất bằng dung môi, và phân lập các hợp chất taxoid. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.2. Các Kỹ Thuật Phân Tích Hóa Học

Sử dụng các kỹ thuật phân tích như NMR, MS giúp xác định cấu trúc của các hợp chất taxoid. Những kỹ thuật này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng taxoid trong cành và lá Thông đỏ có thể đạt mức cao, mở ra cơ hội cho việc sản xuất dược liệu. Các hợp chất như 10-Deacetylbaccatin III và Paclitaxel đã được phân lập thành công, chứng minh tiềm năng của Thông đỏ trong ngành dược.

4.1. Hiệu Suất Chiết Xuất Taxoid

Nghiên cứu cho thấy hiệu suất chiết xuất taxoid từ lá và cành Thông đỏ có thể đạt từ 0,05% đến 0,1%. Điều này cho thấy tiềm năng lớn trong việc khai thác nguồn nguyên liệu này.

4.2. Ứng Dụng Trong Điều Trị Ung Thư

Các hợp chất taxoid đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị nhiều loại ung thư. Việc phát triển các sản phẩm từ Thông đỏ có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Taxoid

Nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc taxoid từ Thông đỏ không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển dược phẩm từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Taxoid

Nghiên cứu về taxoid từ Thông đỏ sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Việc áp dụng công nghệ hiện đại trong chiết tách và phân tích sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.2. Định Hướng Phát Triển Bền Vững

Cần có các chính sách bảo tồn và phát triển bền vững cho Thông đỏ. Việc kết hợp giữa nghiên cứu khoa học và bảo tồn tự nhiên sẽ đảm bảo nguồn nguyên liệu cho tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Tong quan 5) H re H,co : HO °© tử HO H OCH, on HCO (42) HCO CH,OH HO HO CH;OH 18 Khỏa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan H,CO OH (48) - (52) (48) Ry = Ry = CH¡, Ry = Ry = H (49) Rị = R; = Ry = CH; Ry = H (50) Ry = CHy, Ro = Ry * Rye H ($1) Ry = Ry = R¿ = CH¡, R;y = H (52) Ry = Rp = Ry = Rạ =OH (33) (54) Khỏa luận tốt nghiệp Chương |; Tong quan H;ạC COOCH;, ch, ($7) Tên và nguồn tài liệu của các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana.1 : Các hợp chất được cô lập từ loài Taxus wallichiana _ Hợp chất Tên hợp chất Tài liệu tham khảo - - Toxoid ưu" __ Chattopadhyay et al. | laxusin (1996a, 1997) Chattopadhyay Sharma 2-Deacetoxydecinnamoyltaxinine J (1995) Chattopadhyay và Sharma (1995), Zhang et al. (1995c) và 2a-Deacetoxytaxinine J Chattopadhyay, Saha, Kulshrestha, Sharma, Kumar (19966) 3 1-Hydroxy-2-deacetyltaxinine J Zhang et al, (1995c) _ 6 2°-Desacetoxyaustrospicatin Barboni et al. (1994a) Barboni et al.

9 2-Deacetoxytaxinine B anskota, Manandhar, va | Taylor (1997) 20 Khoa luận tot nghiệp Chương |: Tông quan 10 19-Debenzoyl-19-acetyltaxinine M Barboni ct al. (1995b) Miller, Powell, Smith (Jr), Arnold, va Clardy lÌ 1B-Hydroxybaccatin I (1981) va Chattopadhyay ct al. (1996b) Barboni et al. (1997) Baccatin I] Wang (1997) — MeLaughhlin, Miller, - 19-Hydroxybaccatin II] Powell, và Smith (Jr) (1981) —* Vander Velde ct al.

(1994), Zhang et al. l§ 10-Deacetylbaccatin II] (1995) Singh et al. (1997) va Wang (1997) 16 va Wang (1997) Miller et al. (1981), Vander Velde et al.

17 Paclitaxel (Taxol) (1994), Zhang et al. (1995c), Singh et al.(1997) va Wang (1997) 7-Xylosyltaxol Zhang et al. (1995c) —— | #hang et al, (199S¢) và - 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C Chattopadhyay et al. (1996a, 1997) —v_ Vander Velde et al.

(1994), Zhang et al. Cephalomannine (1995c), Rao et al. (1996), Singh ct al. Khỏa luận tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan (1997) và Wang (1997) 22 10-Deacetylcephalomanninc ˆ McLaughlin et al.

(1981) Appendino et al. (1992a), 23 14ƒ-Hydroxy- !0-deacetylbaccatin Il Bombardelli và Gabetta (1998) " 2-Debenzoyl-14-B-benzoyloxy-10- 24 ; Appendino ct al. (1993¢) deacetylbaccatin I] _— Chattopadhyay ct al. 25 Baccatin IV shia (1996b) - 11(15— 1 abeotaxane ¬ — Vander Velde et al, 26 Brevifoliol (1994) Chattopadhyay et al.

27 13-Acetylbrevifoliol ky d4 (1996b) | 10-Debenzoy!-2-a-acctoxybrevifoliol Barboni ct al, (1995b) yo xin etal. (19938 7-Deacetoxy-10-debenzoy|brevifoliol Barboni ct al. (1993) Appendino ct al. (1993a) 10-Debenzoylbrevifoliol R va Barboni et al.

(1993) Vander Velde et al. 31 Taxchinin A (1994) va Chattopadhyay et al. (1996b) | 32 Taxchinin H Barboni et al. (1995b) — 33 s5 laxaeusuin — Zhang et al.

(1995c) [3 | —— Taxayunin - “Zhang et al.13-deacetyl abeobaccatin IV Appendino, và Gariboldi | (1995) 22 Khóa luận tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan Chattopadhyay. Saha, 7,9,13-Deacety! abeobaccatin IV Kulshrestha. Sharma, vi Roy (1997) 10,15-Epoxy-11(15— 1 jabeo-10- tờ Appendino et al. (1993e) deacetylbaccatin IH Non-taxoid isoprenoid Zhang ct al.

(1995c) va -Sitosterol Shrestha et al.(1997) Daucosterol Zhang et al. (1995c) Lignan Chattopadhyay etal. Secoisolariciresinol (1997) Hydroxymatairesinol Miller ct al. (1982) Isoliovil Miller et al.

(1982) Chattopadhyay et al Isolariciresinol (1997) | ae | B-Conidendrin Miller ct al. (1982) Chattopadhyay et al. 47 Taxiresinol i “4 (1997) Flavonoid Parveen, Taufeeq, Khan 48 Ginkgetin (1985) va Qiu, Lian, Ma, He (1989) 7 vả Khan ct al. (1976) 49 Sciadopitysin Aljancic, Popovic, & Stefanovic (1995) = | Parveen et al.

(1985) và | 50 Sequoiaflavone Qiu et al. (1989) 2) 1- ˆ- Kayaflavone — Singh etal, (1997) 23 Qiu et al. (1997) thododendrol/betuligenol | s4 =| Deglycosylicariside By Appendino et al.(1993b) 55 —— Dehydrovomifoliol 56 Vomifoliol Appendino ct al.(1993b) §7 | J-Orcinolcarboxylate Shrestha et al.13a- Priacetoxy-1 1(15— lDabeotaxa-4(20), 1 l-diene-Sa. 24 Khoa luận tốt nghiệp Chương 1: Tông quan 5.

Trong nước Năm 2005, Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự đã cô lập được 4 hợp chất tasoid chính từ lá vả vỏ thân của cây Thông đỏ lá dai thu hải tại Lam Déng bao gém : 10- dcacctylbaccaun II (10-DAB) (15), 19-hydroxybaccatin III (14), paclitaxel (Taxol) (17) với hiệu suất lân lượt là 0,05-0,1%.01% trong lá va 0,006% trong vo thin, 7-xyloside-10-deacety! taxol C (20) với hiệu suất là 0.5% trong vo thân [28] |20]. Trong năm 2008, từ la Thông đỏ được thu hai tại tỉnh Lam Đông. nhóm tác gia trên dd đã khảo sát các quá trình chiết tinh dầu dưới tác dụng của sóng siêu âm va vi sóng. Thanh phân tỉnh dầu được xác định bằng sắc kỷ khi va sắc kỷ khí kết hợp khối pho.

Trong đó các cấu tử bay hơi đặc trưng cho tinh dau của các loài Thông đỏ như (Z)-3-hexen-I-ol va I-octen-3-ol có hiệu suất cao nhất (35,98%; 5,60%) khi sử dụng phương pháp chiết bằng vi sóng trong điều kiện không có nước [5]. Cũng trong năm này, Nguyễn Hữu Toàn Phan va cộng sự đã phân lập được taxol (17) và cephalomannin (21). Cả hai hợp chất trên có hoạt tính gây độc tế bảo trên các dòng ung thư gan Hep-G2 rất mạnh với giá trị IC50 (ug/ml) lần lượt là 0,072 và 0,065 [6|]. Năm 2008, tại trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.

HCM, Tiến sĩ Trần Công Luận cùng cộng sự đã xác định được các đặc điểm vi học của lá và cảnh Thông đỏ, các thánh phần hóa học chính như: Alkaloid, saponin, taxoid và xác định cấu trúc của 10- DAB, tiên chất của taxol bằng cách áp dụng các phương pháp phân tích vi học, thành phân húa thực vật bằng các phản ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. chiết tách bảng kỹ thuật lóng-lỏng. long-rin và xác định cau trúc của 10-DAB bằng các kỳ thuật phỏ.|27| Cũng tại diy, Nguyễn Ngọc Song Trâm củng cộng sự đã xây dựng thành cong quy trình định lượng 10-DAB va taxol trong lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) bảng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao. Với quy trình định lượng dé xuất, có thé áp tJ wv Khoa luận tốt nghiệp Chương |: Tông quan ee SSS.

ee dụng định lượng 10-DAB va taxol trong mau, từ đó có thê so sánh, đánh giá sự khác biệt vẻ ham lượng 2 taxoid chính yêu nảy trong các nguôn nguyên liệu khác nhau [9|. Năm 2008, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết cùng cộng sự đã khảo sát môi quan hệ di truyền va ham lượng 10-DAB của một số cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) tại Lâm Đồng. Với đối tượng nghiên cửu là 7 mẫu Thông đỏ Lam Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) và 1 mẫu Thông dé lấy ở Hòa Binh (Taxus chinensis (Pilg. Định lượng 10-DAB bang phương pháp sắc ký lớp mỏng ghép quang phó.

Phân tích dau hiệu di truyền 8 mẫu bằng kỹ thuật RAPD vả thiết lập mỗi quan hệ di truyền bing NTSYS. Nhóm nghiên cửu đã đưa ra kết quả là tí lệ phần tram ham lượng 10-DAB trong các mẫu biến đổi, cao nhất là mẫu NV4 (0,205 %), thắp nhất là mẫu NV3 (0,029 %). Sự tương đồng giữa các mẫu thông được khảo sát nằm trong khoảng tir 0. Với 10 môi được sử dụng, thi hai môi OPF-14 vả OPP-8 cho kết qua với băng điện di rd và đa hình cao | 10].

26 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM Khóa tuân tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu là lá và cảnh của cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zuec.) được trồng ở Lâm Đông đo trung tâm trông và chế biển cây thuốc Da Lạt cung cấp. Sau khi thu hai, mẫu được phơi khô vả xay thành bột. Điều kiện thực nghiệm 2.

- Nhựa Diaion HP-20 (Missubishi). Trang thiết bị = Tủ say KC-65, tủ say chân không VWRS/P. Cân phân tích Meltler Toledo AB- 204. Dén soi UV-VIS DESAGA SARTEDT GRUPPE, Máy cô quay BUCHI R-114.

Máy anh kĩ thuật sé. May siéu ấm [:Ìma LC 60H (Đức). liếp cách thủy Memment. (Đức), - Cot sắc ki kich thước : 6 cm x 60 cm, 3 cm x 60 cm, 2 cm x 40 cm 27 Khóa luận tot nghiệp Chương 2; Thực nghiệm — ———>ề>>>—_—_—_—~—_——memm===mi Bình phun thuộc thử.

Binh triển khai sắc ki. z Máy sắc kí điều chế C-18 Star-chrom (Mỹ). Ban nhôm tráng sẵn, loại silicagel 60 Fz, (Merck). May do diém chay: STUART SMP3.

May do IR: Shimadzu FTIR-8201 PC. - Máy do UV: He2ios y Thermo Spectronic (UNICAM-UK). - Máy ghi phổ cộng hướng tử hat nhân: AVANCE 500 BRUKER [500 MHz ('H) va 125 MHz ("'C)}, do trong CDCI3 & MeOD với tetramethyl! silan (TMS) lam chất chuẩn nội. Phương pháp nghiên cứu 3.1, Chiết suất Bột nguyên liệu (25 kg) được làm ẩm (18 1) và ngâm 24 giờ (60 1), chiết ngắm kiệt bằng MeOH (ti lệ 1:6), thu được 150 | dịch chiết.

Cô giảm áp dịch chiết đến dang cao sệt (khoảng 10 |) thu được cao MeOH thô (8 kg). Lắc phân đoạn Dùng | kg cao MeOH thô hòa với 1 | nước rồi lắc với đichloromethane (khoảng 12 1), sau khi cô giảm áp dịch dichloromethane ta thu được 200 g cao CH;C]; (độ im 7,2%). Sắc kí cột diaion HP-20 Nạp 12 g cao CH;C]; vào cột diaion, rửa giải lần lượt với các dung môi ; Nước (1 1), MeOH 20% (2,5 1), MeOH 60% (8 1), MeOH 80% (3 1), MeOH! 100% (3 1). Sắc kí cột silica gel pha thuận Phân đoạn McOH 60% (phân đoạn 11) được chọn đê tiếp tục nap cột silica gel.

Khóa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm CO giảm áp dịch ở phân đoạn McOH 60% thu được 2,5 g cao. a) SKC silica gel phan doan 60% (2.5 g) với hệ dung mỏi giải li PE-:acetone có độ phân cực tang dan (100% PE -+ 9:1 -+ 8:2 — 7:3 — 5:5 —+ 100% acetone), dựa trên SKLM hiện mau băng dung dịch HạSO; 10%/FtOH thu được 3 phan đoạn (III,. 3) vả một chất kết tinh T(111) (ghi khôi lượng lun nha). Sứ dụng cột sắc kí với các thông số sau (COT 1): Chất hap phy: Silica gel 60 Fas, (100 g).

Quy cách cột: 3 cm x 60 em. - Chiều cao cột silica gel; 40 cm. ˆ Tốc độ dòng: 40 giot/phut. - Thẻ tich mỗi phan đoạn; 40 mi.

: Tổng sé phân đoạn: 92. Dé kiểm tra thành phân tách của các phân đoạn hứng trong quá trình chiết tách, chúng tôi ding SKLM, khai triển với hệ dung mỗi: CHCI;:MeOH (9:1). Thuốc thử phát hiện là H;SO, 10% /EtOH, phun sấy 110°C trong 5 phút. 1 vết tinh sạch «+ 8:2 11-39 0.7 2 4 vết | : | Có 3 vét 7:3 40-67 03g | 6 vet - đậm ==—= eee | —l a ——=——- 7 Có Ì vết 6:4 68-92 | 08g 4 vet | đậm Khéa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm Sau khi qua cột silica gel phân đoạn MeOH 60% của cây Thông đỏ tách được một chất sạch T(II1), và tách thành những phan đoạn tập hợp qua đó cũng loại được một lượng lớn tạp màu.

Dé phân lập được đơn chat, phải tiếp tục tách va tỉnh chẻ các phân đoạn tiếp theo. b) Tiếp tục tiền hanh SKC silica gel phân doan II; (0.5 g) với hệ dung môi CHCÌy:MeOH có độ phân cực ting din (100% CHCl, —= CHCI;:MeOH 100:5), các đoạn giếng nhau trên SKLM được gom chung thu được ba phân đoạn lI;.