MỞ ĐẦU Ngô có tên khoa học (Zea mays L.) là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế. So với lúa mì và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất nhưng thứ nhất về sản lượng, ngô được trồng ở hơn 100 quốc gia trên thế giới tập trung ở các nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và Ấn Độ [65].Tính đến năm 2012 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177,38 triệu ha, năng suất 4,92 tấn/ha, sản lượng đạt 872 triệu tấn. Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 800 triệu tấn một năm hiện nay và có thể vượt qua cả lúa gạo và lúa mì [44]. Hiện nay, các giống ngô biến đổi gen chiếm 26% tổng diện tích cây ngô trên thế giới [66].
Nông nghiệp hiện đang sử dụng 70% nguồn nước ở các nước đang phát triển và 86% nguồn nước đối với các nước phát triển trong khi đó nguồn nước ngọt đang ngày càng trở nên khan hiếm do hiện tượng biến đổi khí hậu, vì vậy các giống ngô chịu hạn và có khả năng sử dụng nước hiệu quả đang được coi là hướng ưu tiên nghiên cứu nhằm phát triển giống ngô trong tương lai. Cả hai phương pháp chọn giống truyền thống và chọn giống bằng công nghệ sinh học đều đang được áp dụng để chọn tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn. Trong đó nghiên cứu chọn tạo giống ngô biến đổi gen chịu hạn là một hướng nghiên cứu rất được chú trọng trên thế giới. Những nghiên cứu về phản ứng của cây trồng đối với điều kiện trồng trọt thiếu nước ngày càng trở nên quan trọng trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khô hạn ngày một tăng [43].
Khi gặp điều kiện thiếu nước, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi và tồn tại. Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu và lan rộng để hút nước. Các nghiên cứu về khả năng chịu hạn và chọn giống ngô chuyển gen chịu hạn đang được đồng loạt tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm, bởi công ty giống trên thế giới, ở nhiều mức độ khác nhau, từ nghiên cứu cơ chế cơ bản cho đến nghiên cứu ứng dụng chuyển gen Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 2 tạo giống mới. Tuy nhiên, khả năng chịu hạn là một tính trạng phức tạp, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một chiến lược chọn tạo cây ngô chịu hạn biến đổi gen hiệu quả là chiến lược sử dụng cùng một lúc nhiều gen chịu hạn hiệu quả hoặc sử dụng một gen điều khiển có tác dụng điều khiển nhiều gen tham gia quá trình chịu hạn [14].
Khả năng chịu hạn ở cây trồng nói chung và ở ngô nói riêng là tính trạng được kiểm soát bởi nhiều gen. Những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chịu hạn của thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gen tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật được chia thành hai nhóm: Nhóm1- gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase.) và Nhóm 2- gen chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acid, đường: proline, mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại và thích nghi) [25]. Xuất phát từ những vấn đề và yêu cầu cấp thiết này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô”. Mục đích của đề tài Phân lập và thiết kế vector nhằm tăng cường sự biểu hiện của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 phục vụ cho công tác chọn tạo các dòng ngô biến đổi gen có khả năng chiu hạn.
Yêu cầu của đề tài - Phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ giống ngô Tẻ Cao Bằng. - Thiết kế các vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1. - Khảo sát khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 đối với các dòng ngô chọn lọc Việt Nam. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 3 Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực hiện đề tài này giúp chúng tôi có thêm kinh nghiệm, kiến thức về các kỹ thuật phân lập, tách chiết gen, thiết kế vector biểu hiện gen từ vật liệu, đối tượng quan tâm, ngoài ra còn cung cấp thêm hiểu biết về các kỹ thuật chuyển nạp gen vào thực vật mà công nghệ sinh học hiện đại đang áp dụng.
- Kết quả nghiên cứu của để tài sẽ cung cấp các vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu chức năng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Ý nghĩa thực tiễn Ngoài ý nghĩa về khoa học, vấn đề nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi còn có ý nghĩa trong thực tiễn. Việc thiết kế thành công các vector biểu hiện mang gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 phục vụ cho việc chuyển gen vào các giống ngô Việt Nam bước đầu tạo thuận lợi cho công tác chọn tạo giống ngô chống chịu các bất lợi phi sinh học nói chung ở Việt Nam. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 4 Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về cây ngô 1. Nguồn gốc địa lý của cây ngô Căn cứ vào những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng của Vavilov (1926) đã chứng minh rằng: Miền Trung Nam Mexico là Trung tâm phát sinh thứ nhất và vùng núi Andet thuộc Peru là Trung tâm phát sinh thứ 2 của cây ngô [59]. Năm 1948 người ta đã tìm thấy hóa thạnh của phấn ngô được khai quật ở Bellar Arter – Mexico, điều này đã khẳng định những nhận định của Vavilov là đúng đắn.
Từ đây, bằng nhiều con đường ngô đã phân bố ra hầu hết các nước thuộc Châu Mỹ, lên phía Bắc, sang phía Tây của Hoa Kỳ và vượt đại dương đến các đảo thuộc vịnh Caribe. Dưới sự tác động mạnh mẽ của con người trong công tác chọn tạo giống, cây ngô đã nhanh chóng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau và đã hình thành một vùng “vành đai ngô” nổi tiếng của Mỹ với các giống ngô lai đầu tiên. Từ Peru cây ngô đã lan truyền xuống phía Nam Chile, đến Ecuador, Columbia và nhiều vùng thuộc nước Brazil. Cây ngô được đưa vào Châu Âu từ sau chuyến thám hiểm của Colombus năm 1493.
Ở đây người ta đã nhanh chóng nhận ra giá trị lương thực của nó, nên cây ngô đã được trồng rộng rãi và nhanh chóng lan truyền ra các nước trong châu lục. Vào khoảng 1521 cây ngô được đưa vào Ấn Độ, Indonesia và năm 1575 ngô được nhập vào Trung Quốc. Theo nhà bác học Lê Quý Đôn, cây ngô được đưa vào Việt Nam từ cuối thế kỷ 17 (thời Khang Hy) do ông Trần Thế Vinh đi sứ Trung Quốc về và được trồng đầu tiên ở Sơn tây và gọi là “ngô”. Nhờ những đặc điểm quý cây ngô sớm được người Việt Nam chấp nhận và mở rộng sản xuất, coi như là một trong các cây lương thực chính chỉ sau cây lúa nước về mặt diện tích nhưng lại là cây năng suất và giá trị kinh tế cao nhất.
Cây ngô có khả năng thích ứng rộng, có thể trồng được nhiều vụ trong năm và trồng được hầu hết các vùng sinh thái khác nhau trong nước, đặc biệt là vùng đất cao không có khả năng tưới tiêu. Đối với vùng núi phía Bắc và Tây Nguyên ngô là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc. Trải qua các Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 5 giai đoạn phát triển, cây ngô ở Việt Nam ngày càng được hoàn thiện và tăng mạnh về diện tích cũng như năng suất. Việc mở rộng diện tích trồng ngô, cùng với sử dụng những giống cho năng suất cao đã góp phần to lớn trong giải quyết nhu cầu lương thực, thực phẩm, làm thức ăn gia súc và sử dụng trong các ngành công nghiệp [7].
Nguồn gốc di truyền của cây ngô Không giống các cây ngũ cốc khác như lúa mỳ và đại mạch, ngô là những cây được thuần dưỡng và tiến hóa từ cây hoang dại làm cây lương thực từ thời cổ đại, cây ngô không có dạng hoang dại nào được tìm thấy ngày nay. Các nhà khoa học đã chỉ ra ngô là cây trồng cho năng suất cao với cấu trúc sinh sản như hiện nay không thể tồn tại trong điều kiện tự nhiên quá 2 năm. Muốn sống sót trong điều kiện chọn lọc tự nhiên đòi hỏi phải có cơ chế phát tán hạt giống, như kiểu quả dễ vỡ, cấu trúc hình thái kiểu lông cứng dễ vướng vào lông thú hay cấu trúc và kích thước cho phép chuyển động, phát tán theo gió. Nhưng ở ngô không có kiểu cấu tạo vậy.
Hạt trưởng thành được giấu kín trong lá bi, khi chúng rơi xuống đất hoặc bị phân hủy hoặc nảy mầm mọc thành cụm, những cụm này có thể không tạo ra con cháu vì độ cạnh tranh giữa các cá thể quá cao. Nếu bị muông thú ăn, hạt dễ dàng bị tiêu hóa mà không được cơ thể động vật thải ra nguyên hạt để nảy mầm, mọc, rồi sinh sản vì những hạt này không được bảo vệ trong vỏ cứng. Nếu không có sự chăm sóc của con người, cây ngô sẽ bị tuyệt chủng qua vài thế hệ [6]. Nguồn gốc di truyền của cây ngô là một đề tài được tranh luận sôi nổi trong suốt 50 năm qua, cho đến nay có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền cây ngô và được tóm lược như sau [6]: 1).
Là con lai giữa teosinte và thành viên không rõ thuộc chi Andropogoneae. Là con lai nhị bội tự nhiên giữa các loài Á châu thuộc chi Maydeae và Andropogoneae. Là con lai giữa ngô bọc, teosinte và tripsacum. Là con lai của ngô bọc Nam Mỹ và tripsacum Trung Mỹ với teosinte.
Ngô, teosinte và tripsacum bắt nguồn riêng từ một dạng tổ tiên chung. Teosinte là nguồn gốc của ngô sau một hoặc nhiều đột biến. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc điểm như chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng với các điều kiện ngoại cảnh khác nhau.
Song cây ngô có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu. Các bộ phận của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ) và hạt.