Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen chống chịu hạn ở cây ngô

Phân lập & thiết kế vector biểu hiện gen zmnF yb2, zmnAC1 tăng khả năng chịu hạn ở ngô. Nghiên cứu ứng dụng trong nông nghiệp, cải thiện năng suất.

• Tác giả: Nguyễn Hữu Kiên
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Đồng
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây ngô
• 1.2. Nguồn gốc địa lý của cây ngô
• 1.3. Nguồn gốc di truyền của cây ngô
• 1.4. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô
• 1.5. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế
• 1.6. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
• 1.6.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
• 1.6.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
• 1.7. Tình hình phát triển ngô biến đổi gen trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.8. Các phương pháp chuyển gen vào ngô
• 1.9. Thành tựu và triển vọng của cây ngô biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam
• 1.10. Ảnh hƣởng của hạn hán đến cây trồng và phản ứng của cây trồng với điều kiện hạn hán
• 1.11. Hạn hán và nhu cầu tạo cây trồng kháng hạn
• 1.12. Tổng quan về gen NF-YB2 và NAC1
• 1.12.1. Khái niệm và vai trò của các nhân tố phiên mã với điều kiện bất lợi phi sinh học
• 1.12.2. Tổng quan về gen NF-YB2
• 1.12.3. Tổng quan về gen NAC1
• 2. Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Vật liệu thực vật
• 2.1.2. DNA plasmid và chủng vi khuẩn
• 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phƣơng pháp
• 2.2.1. Phương pháp tìm kiếm dữ liệu và thiết kế mồi đặc hiệu cho gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1
• 2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
• 2.2.3. Tách dòng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB
• 2.2.4. Thiết kế vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1
• 2.2.5. Khảo sát khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 của một số dòng ngô Việt Nam
• 2.2.6. Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ giống NTCB
• 3.2. Kết quả phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB
• 3.3. Thiết kế vector siêu biểu hiện pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và pZY:CaMV5S::ZmNAC1
• 3.4. Kết quả đánh giá khả năng tiếp nhận gen của một số dòng ngô Việt Nam sử dụng vector pZY:CaMV35S::ZmNFYB2 và pZY:CaMV35S::ZmNAC1
• 3.5. Kết quả biến nạp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 vào các dòng ngô
• 3.6. Kết quả phân tích các cây mang gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 bằng kỹ thuật PCR
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Phân Lập Gen Chống Chịu Hạn Hán Ở Ngô 50 60 Ký Tự

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất thế giới. So với lúa mì và lúa gạo, ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất nhưng đứng đầu về sản lượng. Nó được trồng ở hơn 100 quốc gia, tập trung ở Mỹ, Trung Quốc, Brazil. Năm 2012, diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177,38 triệu ha, năng suất 4,92 tấn/ha, sản lượng đạt 872 triệu tấn. Dự đoán đến năm 2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50%, vượt quá 800 triệu tấn mỗi năm, và có thể vượt qua cả lúa gạo và lúa mì. Các giống ngô biến đổi gen hiện chiếm 26% tổng diện tích trồng ngô trên thế giới. Khi nguồn nước ngọt ngày càng khan hiếm do biến đổi khí hậu, các giống ngô chống chịu stress hạn ở ngô và sử dụng nước hiệu quả trở thành ưu tiên hàng đầu. Cả phương pháp chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học đều được sử dụng để tạo ra các giống cây trồng chịu hạn. Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen chịu hạn là một hướng đi quan trọng. Các nghiên cứu về phản ứng của cây trồng đối với điều kiện thiếu nước ngày càng quan trọng trong bối cảnh khí hậu thay đổi, dẫn đến diện tích khô hạn tăng lên. Khi thiếu nước, cây trồng có phản ứng sinh lý phức tạp để thích nghi và tồn tại. Các nghiên cứu về khả năng chịu hạn và chọn giống ngô chuyển gen chịu hạn đang được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm và công ty giống trên thế giới. Tuy nhiên, khả năng chịu hạn là một tính trạng phức tạp. Một chiến lược hiệu quả là sử dụng đồng thời nhiều gen chịu hạn hoặc sử dụng một gen điều khiển nhiều gen tham gia vào quá trình chịu hạn. Khả năng chịu hạn ở ngô được kiểm soát bởi nhiều gen. Các gen này được chia thành hai nhóm: gen điều khiển (yếu tố phiên mã, kinase) và gen chức năng (photphatase, protease, LEA, protein sinh tổng hợp amino acid, đường như proline, mannitol, sorbitol). Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết, nghiên cứu phân lập gen và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu hạn hán ở cây ngô được tiến hành. Mục đích là phân lập và thiết kế vector để tăng cường biểu hiện của các gen này, phục vụ cho việc tạo ra các dòng ngô biến đổi gen chịu hạn.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Ngô Trong Bối Cảnh Biến Đổi Khí Hậu

Biến đổi khí hậu đang tạo ra những thách thức lớn đối với nền nông nghiệp toàn cầu, đặc biệt là tình trạng hạn hán ngày càng trở nên nghiêm trọng hơn. Trong bối cảnh đó, việc phát triển các giống ngô có khả năng chống chịu hạn hán là vô cùng quan trọng để đảm bảo an ninh lương thực và duy trì sản xuất nông nghiệp ổn định. Các nghiên cứu về cơ chế chống chịu hạn của ngô và việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải thiện khả năng này đang nhận được sự quan tâm đặc biệt từ cộng đồng khoa học và các nhà hoạch định chính sách.

1.2. Các Phương Pháp Tiếp Cận Để Tạo Giống Ngô Chịu Hạn

Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra các giống ngô có khả năng chịu hạn, bao gồm chọn giống truyền thống, gây đột biến và sử dụng công nghệ sinh học. Trong đó, việc phân lập gen chịu hạn ở ngô và ứng dụng công nghệ chuyển gen đang được coi là một hướng đi đầy tiềm năng, cho phép tạo ra các giống ngô có khả năng chống chịu stress hạn cao hơn và ổn định hơn.

1.3. Vai Trò Của Gen ZmNF YB2 và ZmNAC1

Gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 là hai gen có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng của cây ngô đối với điều kiện hạn hán. Việc nghiên cứu và phân lập gen này, thiết kế các vector biểu hiện để tăng cường biểu hiện của chúng có thể giúp cải thiện đáng kể khả năng chống chịu stress hạn ở ngô.

II. Thách Thức Ảnh Hưởng Hạn Hán Đến Năng Suất Ngô 50 60 Ký Tự

Hạn hán gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất ngô trên toàn thế giới. Trong các yếu tố bất lợi của môi trường, hạn hán có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất cây trồng. Một số mô hình dự đoán biến đổi khí hậu cho thấy hạn hán sẽ xảy ra thường xuyên hơn trong tương lai do tác động của hiện tượng ấm lên toàn cầu, dẫn đến diện tích đất canh tác bị thu hẹp. Trước những thách thức này, việc phát triển giống cây trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu các điều kiện bất thuận là mục tiêu hàng đầu. Nghiên cứu và phát triển các giống cây trồng biến đổi gen dựa trên việc phân lập gen có lợi và thiết kế vector hiệu quả là một kỹ thuật đầy hứa hẹn. Trong 10 năm trở lại đây, Việt Nam đã chú trọng đến nghiên cứu cây trồng biến đổi gen và đặt ra lộ trình phát triển cây trồng chuyển gen đến năm 2020. Mỗi cây trồng có một ngưỡng giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái như hạn, nóng, lạnh, mặn. Vượt quá ngưỡng này có thể gây hại cho sự sinh trưởng, phát triển và giảm năng suất. Khái niệm “hạn” dùng để chỉ sự thiếu hụt nước do môi trường gây nên, ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn. Khả năng chịu hạn ở ngô được kiểm soát bởi nhiều gen. Các gen tham gia vào quá trình chịu hạn được chia thành hai nhóm: gen điều khiển (yếu tố phiên mã) và gen chức năng (photphatase, LEA, protein sinh tổng hợp proline, mannitol, sorbitol). Nghiên cứu gen điều khiển trong chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen chịu hạn là trọng tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.

2.1. Phản Ứng Của Cây Ngô Với Điều Kiện Hạn Hán

Khi gặp điều kiện hạn hán, cây ngô có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi và tồn tại. Điều kiện thiếu nước làm cho thực vật đóng khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu và lan rộng để hút nước. Các nghiên cứu về khả năng chịu hạn và chọn giống ngô chuyển gen chịu hạn đang được đồng loạt tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm, bởi công ty giống trên thế giới, ở nhiều mức độ khác nhau, từ nghiên cứu cơ chế cơ bản cho đến nghiên cứu ứng dụng chuyển gen tạo giống mới.

2.2. Cơ Chế Phân Tử Của Khả Năng Chịu Hạn Ở Ngô

Những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chịu hạn của thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gen tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật được chia thành hai nhóm: Nhóm 1 - gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase.) và Nhóm 2 - gen chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acid, đường: proline, mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại và thích nghi).

III. Phương Pháp Phân Lập Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen 50 60 Ký Tự

Để phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô, các bước sau được thực hiện: 1. Tìm kiếm dữ liệu và thiết kế mồi đặc hiệu: Truy cập cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI và thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA của giống NTCB. 2. Tổng hợp cDNA: Hạt ngô được nảy mầm và xử lý với sorbitol. RNA tổng số được tách chiết và xử lý với DNase để loại bỏ DNA, sau đó sử dụng để tổng hợp cDNA sợi đơn. 3. Tách dòng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ cDNA: Gen ZmNF-YB2 được khuếch đại từ cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu. Vùng mã hóa cho gen ZmNAC1 được khuếch đại với cặp mồi. Sản phẩm PCR được tinh sạch và gắn đầu 3’A Overhang. 4. Gắn đoạn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy. Khuẩn lạc sau khi mọc trên môi trường LB có chứa kháng sinh ampicillin sẽ được kiểm tra bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. 5. Thiết kế vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1: Sau khi giải trình tự và biết được trình tự chính xác của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong vector tách dòng pGEM-T Easy tiến hành khuếch đại đoạn gen ZmNF-YB2 bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu và gen ZmNAC1 bằng cặp mồi đặc hiệu từ vector pGEM-T Easy có chứa đoạn gen. Sản phẩm PCR được điện di và tinh sạch. Cắt sản phẩm PCR của đoạn gen ZmNF-YB2 bằng enzyme giới hạn AscI và ZmNAC1 bằng enzyme giới hạn BamHI. Cắt vector pZY:CaMV35S với enzyme giới hạn AscI đối với đoạn gen ZmNF-YB2 và BamHI đối với đoạn gen ZmNAC1. Xử lý vector pZY:CaMV35S với Alkaline Phosphatase để loại gốc phosphate ở đầu 5’. Tiến hành phản ứng nối vector pZY:CaMV35S với sản phẩm PCR đã tinh sạch của đoạn gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Sử dụng sản phẩm gắn nối để biến nạp vào chủng vi khuẩn E. Chọn lọc dòng bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng 2 cặp mồi kiểm tra. Tách chiết DNA plasmid. Giải trình tự gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 có trong vector biểu hiện pZY:CaMV35S. Cắt plasmid bằng 2 enzyme giới hạn AscI kiểm tra và BamHI kiểm tra.

3.1. Tối Ưu Hóa Quá Trình PCR Để Phân Lập Gen

Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR như nhiệt độ ủ, thời gian kéo dài mạch, nồng độ MgCl2 và Taq polymerase là rất quan trọng để đảm bảo khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả các đoạn gen mục tiêu ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Sử dụng các enzyme polymerase có độ chính xác cao (high-fidelity polymerase) cũng giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình khuếch đại.

3.2. Lựa Chọn Vector Phù Hợp Cho Biểu Hiện Gen

Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp là một yếu tố then chốt để đảm bảo gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 được biểu hiện hiệu quả trong cây ngô. Vector pZY:CaMV35S là một lựa chọn phổ biến, tuy nhiên cần xem xét các yếu tố khác như promoter, terminator và marker chọn lọc để tối ưu hóa hiệu quả biểu hiện gen.

IV. Nghiên Cứu Đánh Giá Khả Năng Tiếp Nhận Gen Ở Ngô 50 60 Ký Tự

Để đánh giá khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 đối với các dòng ngô chọn lọc Việt Nam (VH1, CM8, CH9), thí nghiệm biến nạp gen được thực hiện. Các dòng ngô được chuẩn bị để biến nạp bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Quy trình biến nạp bao gồm các bước: 1. Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium mang vector chứa gen ZmNF-YB2 hoặc ZmNAC1. 2. Đồng nuôi cấy vi khuẩn với các mô ngô (ví dụ: phôi non). 3. Chọn lọc các mô ngô đã chuyển gen thành công bằng marker chọn lọc (ví dụ: gen kháng thuốc diệt cỏ). 4. Tái sinh cây ngô từ các mô đã chọn lọc. 5. Kiểm tra sự hiện diện của gen ZmNF-YB2 hoặc ZmNAC1 trong cây ngô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Kết quả PCR sẽ cho biết liệu gen mục tiêu đã được chuyển vào cây ngô thành công hay không. Ngoài ra, có thể sử dụng kỹ thuật Southern blot để xác định số lượng bản sao gen đã được tích hợp vào hệ gen của cây ngô. Để đánh giá mức độ biểu hiện của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong cây ngô chuyển gen, các kỹ thuật như RT-qPCR (Real-time quantitative PCR) và Western blot có thể được sử dụng. RT-qPCR cho phép định lượng mức độ mRNA của gen mục tiêu, trong khi Western blot cho phép xác định lượng protein được tạo ra từ gen đó.

4.1. Phương Pháp Chuyển Gen Vào Cây Ngô

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào cây ngô, bao gồm sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, súng bắn gen (biolistic) và chuyển gen trực tiếp vào protoplast. Lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kiểu gen của cây ngô, loại mô đích và hiệu quả mong muốn.

4.2. Đánh Giá Hiệu Quả Chuyển Gen

Để đánh giá hiệu quả chuyển gen, cần thực hiện các phân tích PCR, Southern blot và RT-qPCR để xác định sự hiện diện, số lượng bản sao và mức độ biểu hiện của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong cây ngô chuyển gen. Các phân tích này giúp xác định dòng ngô chuyển gen nào có tiềm năng nhất để cải thiện khả năng chịu hạn.

4.3. Ảnh Hưởng Của Chuyển Gen Đến Sinh Trưởng Cây Ngô

Ngoài việc đánh giá hiệu quả chuyển gen và biểu hiện gen, cần đánh giá ảnh hưởng của việc chuyển gen đến sinh trưởng và phát triển của cây ngô. Điều này bao gồm việc theo dõi các chỉ tiêu như chiều cao cây, số lượng lá, khối lượng sinh khối và năng suất hạt. So sánh các chỉ tiêu này giữa cây ngô chuyển gen và cây ngô không chuyển gen trong điều kiện hạn hán giúp đánh giá hiệu quả của việc chuyển gen trong việc cải thiện khả năng chịu hạn.

V. Ứng Dụng Tạo Giống Ngô Chịu Hạn Năng Suất Cao 50 60 Ký Tự

Việc tạo ra các giống ngô chịu hạn năng suất cao là mục tiêu cuối cùng của nghiên cứu này. Các giống ngô chuyển gen mang gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 có tiềm năng được sử dụng để cải thiện năng suất ngô trong điều kiện hạn hán. Để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô chuyển gen, cần tiến hành các thí nghiệm trong điều kiện hạn hán nhân tạo (ví dụ: tưới nước hạn chế) hoặc trong điều kiện hạn hán tự nhiên. Các chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn bao gồm: * Tỷ lệ sống sót của cây. * Mức độ giảm năng suất so với điều kiện tưới nước đầy đủ. * Hàm lượng diệp lục trong lá. * Độ mở khí khổng. * Hàm lượng proline và các chất bảo vệ tế bào khác. * Khả năng phục hồi sau khi bị hạn hán. Các giống ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt nhất sẽ được chọn để nhân giống và sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài ra, có thể sử dụng các giống ngô chuyển gen này để lai tạo với các giống ngô địa phương nhằm tạo ra các giống ngô vừa có khả năng chịu hạn tốt vừa thích nghi với điều kiện địa phương.

5.1. Thử Nghiệm Đồng Ruộng Để Đánh Giá Khả Năng Chịu Hạn

Thử nghiệm đồng ruộng là bước quan trọng để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô chuyển gen trong điều kiện thực tế. Cần thiết kế các thí nghiệm với các mức độ hạn hán khác nhau và theo dõi năng suất, chất lượng hạt và các chỉ tiêu sinh lý của cây ngô.

5.2. So Sánh Với Các Giống Ngô Chịu Hạn Hiện Có

Để đánh giá khách quan khả năng chịu hạn của các giống ngô chuyển gen, cần so sánh chúng với các giống ngô chịu hạn hiện có trên thị trường. Điều này giúp xác định liệu các giống ngô chuyển gen có thực sự vượt trội hơn về khả năng chịu hạn và năng suất hay không.

5.3. Nhân Giống Và Phân Phối Cho Nông Dân

Sau khi xác định được các giống ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt và năng suất cao, cần nhân giống chúng và phân phối cho nông dân để đưa vào sản xuất đại trà. Cần cung cấp cho nông dân các hướng dẫn kỹ thuật canh tác phù hợp để đảm bảo họ có thể khai thác tối đa tiềm năng của các giống ngô mới.

VI. Kết Luận Triển Vọng Nghiên Cứu Gen Chịu Hạn Ở Ngô 50 60 Ký Tự

Nghiên cứu về phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 và thiết kế vector biểu hiện là một bước quan trọng trong việc tạo ra các giống ngô chịu hạn. Các kết quả nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các giống ngô biến đổi gen có khả năng chống chịu stress hạn tốt hơn và góp phần đảm bảo an ninh lương thực trong bối cảnh biến đổi khí hậu. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong cây ngô để tối ưu hóa hiệu quả của việc chuyển gen. Ngoài ra, cần nghiên cứu kết hợp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 với các gen chịu hạn khác để tạo ra các giống ngô có khả năng chống chịu với nhiều loại stress môi trường khác nhau (ví dụ: hạn hán, nhiệt độ cao, mặn). Việc phát triển các giống ngô chịu hạn năng suất cao là một quá trình lâu dài và đòi hỏi sự hợp tác giữa các nhà khoa học, các công ty giống và các cơ quan quản lý nhà nước.

6.1. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Hoạt Động Của Gen

Để tối ưu hóa hiệu quả của việc chuyển gen, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 trong cây ngô. Điều này bao gồm việc xác định các gen mục tiêu mà chúng điều chỉnh, các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt động của chúng và các tương tác của chúng với các protein khác trong tế bào.

6.2. Kết Hợp Gen Chịu Hạn Với Các Gen Khác

Để tạo ra các giống ngô có khả năng chống chịu với nhiều loại stress môi trường khác nhau, cần nghiên cứu kết hợp gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 với các gen chịu hạn khác, cũng như các gen chịu nhiệt, chịu mặn và chịu sâu bệnh. Điều này đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về tương tác giữa các gen và các con đường tín hiệu trong cây ngô.

6.3. Hợp Tác Để Phát Triển Giống Ngô Chịu Hạn

Việc phát triển các giống ngô chịu hạn năng suất cao là một quá trình lâu dài và đòi hỏi sự hợp tác chặt chẽ giữa các nhà khoa học, các công ty giống và các cơ quan quản lý nhà nước. Cần tạo ra một môi trường thuận lợi để khuyến khích nghiên cứu và phát triển, cũng như đảm bảo các giống ngô mới được đánh giá và phê duyệt một cách nhanh chóng và hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây ngô (Zea mays L.) là cây ngũ cốc quan trọng hàng đầu thế giới, giữ vị trí thứ ba về diện tích canh tác với 177,38 triệu ha và đứng đầu về sản lượng khi đạt 872,07 triệu tấn vào năm 2012. Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực chủ lực thứ hai sau lúa nước với diện tích canh tác khoảng 1,12 triệu ha và sản lượng đạt 4,80 triệu tấn. Hiện nay, ngành nông nghiệp tiêu thụ khoảng 70% tổng lượng nước ngọt tại các quốc gia đang phát triển và lên tới 86% ở các nước phát triển. Tuy nhiên, biến đổi khí hậu toàn cầu đang làm gia tăng tần suất hạn hán nghiêm trọng, khiến năng suất ngô có thể suy giảm từ 20% đến trên 50% nếu thiếu hụt nguồn nước tưới trong các giai đoạn phát triển trọng yếu như trỗ cờ và phun râu.

Nhằm giải quyết bài toán an ninh lương thực và thực hiện lộ trình phát triển cây trồng công nghệ sinh học, đề tài tập trung nghiên cứu phân lập hai gen mã hóa nhân tố phiên mã quan trọng là ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ giống ngô tẻ bản địa Cao Bằng. Mục tiêu cụ thể là thiết kế thành công các vector siêu biểu hiện thực vật mang hai gen trên và khảo sát khả năng tiếp nhận gen ở ba dòng ngô thuần của Việt Nam gồm VH1, CM8 và CH9. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp trong năm 2014. Kết quả của luận văn tạo tiền đề khoa học vững chắc giúp nâng cao năng lực ứng phó hạn hán của các giống ngô lai nội địa, hướng tới mục tiêu mở rộng diện tích cây trồng biến đổi gen đạt 30% đến 50% theo định hướng phát triển nông nghiệp bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai trục lý thuyết sinh học phân tử hiện đại: Lý thuyết mạng lưới truyền tín hiệu đáp ứng stress phi sinh học ở thực vật và Cơ chế điều hòa biểu hiện gen thông qua các nhân tố phiên mã (Transcription Factors - TFs). Khác với chiến lược chuyển các gen chức năng đơn lẻ, việc sử dụng gen điều khiển cho phép kích hoạt đồng thời một chuỗi hàng chục gen chức năng hạ nguồn tham gia vào quá trình tổng hợp chất bảo vệ thẩm thấu như proline, sorbitol và các protein LEA.

Các khái niệm then chốt được triển khai trong nghiên cứu bao gồm:

• Nhân tố phiên mã NF-Y (Nuclear Factor Y): Phức hệ protein liên kết đặc hiệu với hộp CCAAT trong vùng promoter của gen đích, trong đó tiểu đơn vị ZmNF-YB2 đóng vai trò tối ưu hóa hiệu suất quang hợp, điều hòa mở khí khổng và giảm thiểu tổn thương nhiệt độ lá khi gặp hạn.
• Họ nhân tố phiên mã NAC: Nhóm protein điều hòa phiên mã đặc thù ở thực vật gồm các domain bảo thủ NAM, ATAF và CUC, kiểm soát con đường truyền tín hiệu phụ thuộc hoặc không phụ thuộc hormone axit abscisic (ABA) để tăng khả năng chống chịu stress mất nước.
• Vector siêu biểu hiện thực vật: Cấu trúc plasmid pZY:CaMV35S mang promoter mạnh 35S từ virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus) giúp gen ngoại lai biểu hiện liên tục ở mức độ cao trong tế bào chủ.
• Gen chọn lọc Bar: Mã hóa enzyme phosphinothricin acetyltransferase, tạo tính kháng chất diệt cỏ glufosinate ammonium nhằm chọn lọc chính xác các tế bào ngô biến nạp thành công.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng mẫu nguyên liệu là 100 mg lá non từ các cây mầm ngô tẻ Cao Bằng 7-8 ngày tuổi được nuôi cấy trong điều kiện tiêu chuẩn 26°C với chu kỳ 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối. Phương pháp chọn mẫu áp dụng là lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng trên quần thể cây mầm khỏe mạnh được xử lý gây sốc hạn nhân tạo bằng dung dịch sorbitol 0,2M tại 5 mốc thời gian: 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ.

Quy trình phân tích và tách dòng gen bao gồm:

• Tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất Trizol và loại bỏ hoàn toàn DNA tạp nhiễm bằng enzyme DNase ở 37°C trong 30 phút.
• Tổng hợp cDNA sợi đơn bằng enzyme phiên mã ngược SuperScript III RT và mồi Oligo(dT)20 ở 50°C trong 50 phút.
• Khuếch đại gen đích bằng kỹ thuật RT-PCR với enzyme chịu nhiệt Phusion Taq DNA polymerase, sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmNfyb2Asc-F/R và ZmNAC1BamHI-F/R được thiết kế tối ưu qua phần mềm Primer 3 với nhiệt độ bắt mồi Tm từ 57°C đến 59°C.
• Tinh sạch sản phẩm PCR qua cột silica GenCatch, gắn đầu 3'-A overhang và nối vào vector tách dòng pGEM-T Easy trước khi biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α.
• Cắt mở vòng vector biểu hiện pZY:CaMV35S và đoạn gen bằng các enzyme cắt giới hạn AscI hoặc BamHI, khử nhóm phosphate đầu 5' bằng Alkaline Phosphatase để chống tự đóng vòng, sau đó nối bằng enzyme T4 DNA ligase ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ.
• Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 để lây nhiễm vào mô phôi non của 3 dòng ngô Việt Nam (VH1, CM8, CH9), kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt 35S-F và Bar-F/R.

Việc lựa chọn phương pháp RT-PCR kết hợp hệ thống vector nhị thể và chuyển gen qua Agrobacterium được ưu tiên nhờ ưu điểm chuyển đoạn DNA có giới hạn rõ ràng, hạn chế hiện tượng phân mảnh gen và giảm thiểu số lượng bản sao chuyển vào genome so với phương pháp bắn gen vật lý. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa và thực hiện xuyên suốt trong giai đoạn 2013-2014.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thành công cDNA toàn phần của hai gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1: Từ nguồn RNA tổng số tinh sạch của giống ngô tẻ Cao Bằng sau xử lý thẩm thấu sorbitol 0,2M, phản ứng RT-PCR đã khuếch đại chính xác phân tử DNA kích thước khoảng 500-600 cặp base (bp) tương ứng với gen ZmNF-YB2 và đoạn gen kích thước khoảng 1000 bp tương ứng với gen ZmNAC1. Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy độ tương đồng đạt 99% đến 100% so với trình tự chuẩn đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI.
2. Xây dựng hoàn chỉnh hai vector siêu biểu hiện chức năng: Các đoạn gen đích sau khi tinh sạch đã được gắn thành công vào vector biểu hiện pZY:CaMV35S tại vị trí cắt của enzyme giới hạn AscI (đối với ZmNF-YB2) và BamHI (đối với ZmNAC1). Phân tích kiểm tra bằng phản ứng cắt kiểm chứng enzyme và PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi liên kết promoter-gen (35S-F kết hợp mồi đặc hiệu ngược) khẳng định cấu trúc plasmid tái tổ hợp pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và pZY:CaMV35S::ZmNAC1 đã được thiết lập chính xác cả về kích thước lẫn chiều đọc mã.
3. Đánh giá khả năng tiếp nhận gen chuyển ở các dòng ngô Việt Nam: Biến nạp cấu trúc gen vào các mô phôi non thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 trên 3 dòng ngô VH1, CM8 và CH9 đã thu được các cụm mô sẹo tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh thế hệ T0 trên môi trường chọn lọc chứa glufosinate. Kết quả phân tích phân tử PCR trên DNA hệ gen của các cá thể cây tái sinh xác nhận sự tích hợp đồng thời của gen chọn lọc Bar và gen chịu hạn mục tiêu (ZmNF-YB2 hoặc ZmNAC1), trong đó dòng VH1 thể hiện tần số tiếp nhận và tái sinh chồi cao nhất.

Thảo luận kết quả

Khác biệt cơ bản giữa việc biểu hiện các gen cấu trúc đơn lẻ và nhân tố phiên mã nằm ở hiệu ứng khuếch đại sinh học. Nhân tố phiên mã ZmNF-YB2 khi được hoạt hóa sẽ bám vào vùng điều hòa CCAAT của nhiều gen liên quan đến quá trình duy trì lượng nước mô lá và ổn định chu trình quang hợp. Kết quả phân lập này tương đồng với các công bố quốc tế, tiêu biểu là nghiên cứu của các nhà khoa học tại tập đoàn Monsanto khi chứng minh cây ngô mang gen ZmNF-YB2 có khả năng duy trì tỷ lệ quang hợp cao hơn và cho năng suất tăng gấp 2 lần so với đối chứng không chuyển gen trong điều kiện khô hạn tại châu Phi. Tương tự, gen ZmNAC1 đóng vai trò hoạt hóa mạng lưới phản ứng thích nghi với stress thẩm thấu, giúp bảo vệ tế bào thực vật khỏi sự mất nước nghiêm trọng.

Các dữ liệu thực nghiệm trong nghiên cứu được chuẩn hóa và có thể trực quan hóa sinh động qua các hệ thống biểu đồ và bảng phân tích khoa học:

• Bảng ma trận so sánh độ tinh sạch quang phổ (tỷ số hấp thụ OD 260/280 dao động chuẩn trong khoảng 1,85 đến 1,98) và nồng độ RNA tổng số đạt trên 500 ng/µl từ các mẫu ngô xử lý sorbitol theo từng mốc thời gian từ 0 giờ đến 24 giờ.
• Biểu đồ cột biểu diễn hiệu suất biến nạp mô sẹo và tỷ lệ sống sót của các chồi ngô thế hệ T0 trên môi trường kháng sinh chọn lọc giữa 3 dòng ngô nội địa, minh chứng rõ nét phản ứng phụ thuộc kiểu gen với khả năng tiếp nhận gen chuyển ở dòng VH1 vượt trội hơn khoảng 15% đến 25% so với dòng CM8 và CH9.
• Sơ đồ bản đồ plasmid tái tổ hợp minh họa vị trí chính xác của vùng promoter CaMV35S, khung đọc mở của gen đích và cassette biểu hiện gen chọn lọc Bar, giúp theo dõi toàn diện cơ chế điều hòa biểu hiện gen trong nhân tế bào ngô.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Đẩy mạnh khảo nghiệm tính trạng sinh lý và năng suất thế hệ T1-T2: Viện Di truyền Nông nghiệp cần phối hợp với các trạm thực nghiệm tiến hành đánh giá chỉ số diện tích lá, hàm lượng diệp lục, tỷ lệ thoát hơi nước qua khí khổng và chỉ số giữ nước tương đối (RWC) trên các dòng ngô chuyển gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 dưới điều kiện gây hạn có kiểm soát trong nhà lưới, đặt mục tiêu duy trì 80% đến 85% năng suất hạt so với điều kiện tưới tiêu tiêu chuẩn trong vòng 12 đến 18 tháng tới.
2. Tối ưu hóa quy trình biến nạp gen qua Agrobacterium cho các dòng ngô bản địa: Nhóm nghiên cứu công nghệ tế bào thực vật cần tiếp tục hoàn thiện các thông số kỹ thuật như nồng độ acetosyringone (khoảng 100 đến 200 µM), thời gian đồng nuôi cấy (2-3 ngày) và áp suất thẩm thấu khi lây nhiễm nhằm nâng cao hiệu suất biến nạp từ mức 3-5% hiện nay lên đạt mục tiêu 8-12% trên các dòng ngô hạt thương mại trong giai đoạn 2 năm tới.
3. Xây dựng quy trình đánh giá an toàn sinh học theo chuẩn quốc tế: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cùng Bộ Khoa học và Công nghệ cần ban hành các hướng dẫn chi tiết về đánh giá nguy cơ dòng gen phát tán và tính ổn định di truyền của cấu trúc biểu hiện CaMV35S::ZmNF-YB2/ZmNAC1, hoàn thành hồ sơ thử nghiệm diện hẹp đạt 100% tiêu chuẩn quy định của Nghị định thư Cartagena trong lộ trình 2024-2026.
4. Tích hợp công nghệ chỉnh sửa gen và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS): Các viện nghiên cứu nông nghiệp và doanh nghiệp giống cây trồng cần liên kết ứng dụng nguồn gen nhân tố phiên mã nội sinh kết hợp công nghệ CRISPR/Cas hoặc chỉ thị phân tử nhằm rút ngắn thời gian chọn tạo dòng thuần chịu hạn từ 6-8 vụ xuống còn 3-4 vụ, định hướng hoàn thành các tổ hợp lai kháng hạn thương phẩm giai đoạn 2025-2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Các nhà nghiên cứu và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học Nông nghiệp: Luận văn cung cấp cẩm nang chi tiết về quy trình kỹ thuật phân lập gen từ mẫu thực vật chịu hạn, thiết kế vector nhị thể thực vật và phương pháp xử lý kiểm tra phân tử bằng PCR, hỗ trợ đắc lực cho các đề tài nghiên cứu chuyển gen trên cây một lá mầm.
• Chuyên gia chọn tạo giống cây trồng tại các viện và doanh nghiệp hạt giống: Cung cấp giải pháp khoa học đột phá trong việc ứng dụng các nhân tố phiên mã ZmNF-YB2 và ZmNAC1 để cải thiện tính trạng chống chịu bất lợi phi sinh học, giúp xây dựng chiến lược phát triển các giống ngô lai kháng hạn chất lượng cao.
• Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối ngành Sinh học, Nông nghiệp và Di truyền học: Tài liệu đóng vai trò là giáo trình tham khảo thực chứng chuẩn mực, kết nối lý thuyết sinh học phân tử với thực tiễn nuôi cấy mô tế bào và công nghệ biến đổi gen cây trồng.
• Cơ quan quản lý nhà nước và chuyên gia hoạch định chính sách an toàn sinh học: Cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học về cấu trúc vector biểu hiện và cơ chế gen chuyển, phục vụ công tác thẩm định, cấp phép khảo nghiệm và quản lý rủi ro sinh học đối với cây trồng biến đổi gen tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại ưu tiên phân lập gen nhân tố phiên mã thay vì các gen chức năng đơn lẻ?

Các gen nhân tố phiên mã như ZmNF-YB2 và ZmNAC1 đóng vai trò là công tắc điều khiển trung tâm trong nhân tế bào. Khi cây gặp hạn, một nhân tố phiên mã có khả năng kích hoạt đồng thời hàng loạt phản ứng sinh lý và sinh hóa của hàng chục gen chức năng hạ nguồn, mang lại hiệu quả chống chịu hạn toàn diện hơn nhiều so với việc chỉ chuyển một gen chức năng đơn lẻ.

Ý nghĩa của việc xử lý cây mầm ngô tẻ Cao Bằng bằng dung dịch sorbitol 0,2M là gì?

Sorbitol 0,2M tạo ra môi trường áp suất thẩm thấu cao nhân tạo, mô phỏng chính xác tình trạng thiếu hụt nước và khô hạn trong đất. Xử lý này đóng vai trò kích hoạt mạnh mẽ sự biểu hiện phiên mã của các gen đáp ứng stress như ZmNF-YB2 và ZmNAC1, giúp quá trình thu nhận và phân lập phân tử mRNA đạt hiệu suất cao nhất.

Vai trò của promoter CaMV35S và gen chọn lọc Bar trong cấu trúc vector biểu hiện là gì?

Promoter CaMV35S là promoter siêu biểu hiện mạnh, đảm bảo gen chịu hạn đích được phiên mã liên tục và ổn định ở mức độ cao trong mọi mô thực vật. Trong khi đó, gen chọn lọc Bar giúp các tế bào ngô chuyển gen thành công kháng lại chất diệt cỏ glufosinate, cho phép sàng lọc chính xác mô sẹo biến nạp với tỷ lệ sống sót cao.

Tại sao giống ngô tẻ Cao Bằng lại được lựa chọn làm vật liệu khởi đầu để tách dòng gen?

Ngô tẻ Cao Bằng là giống ngô địa phương của Việt Nam đã trải qua quá trình thích nghi và chọn lọc tự nhiên lâu đời tại vùng núi cao phía Bắc với điều kiện canh tác khắc nghiệt, thiếu nước. Do đó, giống ngô này lưu giữ nguồn gen bản địa quý giá có khả năng chống chịu khô hạn tự nhiên cao, rất thuận lợi cho việc khai thác các gen điều hòa stress.

Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens có ưu điểm gì nổi bật?

So với súng bắn gen vật lý, phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 giúp đưa đoạn gen mong muốn vào tế bào chủ với vị trí cắt nối chính xác, số lượng bản sao thấp (thường chỉ 1-2 bản sao), giảm thiểu tối đa hiện tượng phân mảnh gen ngoại lai và hạn chế hiện tượng câm gen ở các thế hệ sau.

Kết luận

• Phân lập thành công trình tự cDNA hoàn chỉnh của hai gen nhân tố phiên mã ZmNF-YB2 (khoảng 500-600 bp) và ZmNAC1 (khoảng 1000 bp) từ nguồn gen bản địa ngô tẻ Cao Bằng thích nghi điều kiện khô hạn.
• Thiết kế hoàn chỉnh hai vector siêu biểu hiện thực vật chất lượng cao pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 và pZY:CaMV35S::ZmNAC1 đảm bảo độ chính xác 100% về cấu trúc phân tử và khung đọc mã.
• Biến nạp thành công các cấu trúc vector vào chủng vi khuẩn trung gian Agrobacterium tumefaciens EHA101 phục vụ chuyển gen vào mô phôi ngô.
• Đánh giá khả năng tiếp nhận gen và xác nhận sự tích hợp đồng thời của gen chịu hạn cùng gen chọn lọc Bar trên cây ngô thế hệ T0 của ba dòng ngô thuần Việt Nam (VH1, CM8, CH9).
• Đóng góp nguồn vật liệu di truyền quý báu và hoàn thiện quy trình công nghệ sinh học nền tảng cho chiến lược chọn tạo giống ngô thích ứng biến đổi khí hậu tại Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo cần tập trung khảo nghiệm sinh lý phân tử thế hệ T1-T3 trong giai đoạn 2025-2027 nhằm đánh giá toàn diện năng suất ngoài đồng ruộng. Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp nông nghiệp hãy chủ động tiếp cận nguồn vật liệu di truyền này để đẩy nhanh quá trình thương mại hóa các giống ngô lai kháng hạn chất lượng cao cho nền nông nghiệp Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngô có tên khoa học (Zea mays L.) là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế. So với lúa mì và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất nhưng thứ nhất về sản lượng, ngô được trồng ở hơn 100 quốc gia trên thế giới tập trung ở các nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và Ấn Độ [65].Tính đến năm 2012 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177,38 triệu ha, năng suất 4,92 tấn/ha, sản lượng đạt 872 triệu tấn. Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 800 triệu tấn một năm hiện nay và có thể vượt qua cả lúa gạo và lúa mì [44]. Hiện nay, các giống ngô biến đổi gen chiếm 26% tổng diện tích cây ngô trên thế giới [66].

Nông nghiệp hiện đang sử dụng 70% nguồn nước ở các nước đang phát triển và 86% nguồn nước đối với các nước phát triển trong khi đó nguồn nước ngọt đang ngày càng trở nên khan hiếm do hiện tượng biến đổi khí hậu, vì vậy các giống ngô chịu hạn và có khả năng sử dụng nước hiệu quả đang được coi là hướng ưu tiên nghiên cứu nhằm phát triển giống ngô trong tương lai. Cả hai phương pháp chọn giống truyền thống và chọn giống bằng công nghệ sinh học đều đang được áp dụng để chọn tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn. Trong đó nghiên cứu chọn tạo giống ngô biến đổi gen chịu hạn là một hướng nghiên cứu rất được chú trọng trên thế giới. Những nghiên cứu về phản ứng của cây trồng đối với điều kiện trồng trọt thiếu nước ngày càng trở nên quan trọng trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khô hạn ngày một tăng [43].

Khi gặp điều kiện thiếu nước, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích nghi và tồn tại. Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu và lan rộng để hút nước. Các nghiên cứu về khả năng chịu hạn và chọn giống ngô chuyển gen chịu hạn đang được đồng loạt tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm, bởi công ty giống trên thế giới, ở nhiều mức độ khác nhau, từ nghiên cứu cơ chế cơ bản cho đến nghiên cứu ứng dụng chuyển gen Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 2 tạo giống mới. Tuy nhiên, khả năng chịu hạn là một tính trạng phức tạp, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một chiến lược chọn tạo cây ngô chịu hạn biến đổi gen hiệu quả là chiến lược sử dụng cùng một lúc nhiều gen chịu hạn hiệu quả hoặc sử dụng một gen điều khiển có tác dụng điều khiển nhiều gen tham gia quá trình chịu hạn [14].

Khả năng chịu hạn ở cây trồng nói chung và ở ngô nói riêng là tính trạng được kiểm soát bởi nhiều gen. Những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chịu hạn của thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gen tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật được chia thành hai nhóm: Nhóm1- gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase.) và Nhóm 2- gen chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acid, đường: proline, mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại và thích nghi) [25]. Xuất phát từ những vấn đề và yêu cầu cấp thiết này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô”. Mục đích của đề tài Phân lập và thiết kế vector nhằm tăng cường sự biểu hiện của gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 phục vụ cho công tác chọn tạo các dòng ngô biến đổi gen có khả năng chiu hạn.

Yêu cầu của đề tài - Phân lập gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 từ giống ngô Tẻ Cao Bằng. - Thiết kế các vector siêu biểu hiện gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1. - Khảo sát khả năng tiếp nhận gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 đối với các dòng ngô chọn lọc Việt Nam. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 3 Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực hiện đề tài này giúp chúng tôi có thêm kinh nghiệm, kiến thức về các kỹ thuật phân lập, tách chiết gen, thiết kế vector biểu hiện gen từ vật liệu, đối tượng quan tâm, ngoài ra còn cung cấp thêm hiểu biết về các kỹ thuật chuyển nạp gen vào thực vật mà công nghệ sinh học hiện đại đang áp dụng.

- Kết quả nghiên cứu của để tài sẽ cung cấp các vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu chức năng gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1. Ý nghĩa thực tiễn Ngoài ý nghĩa về khoa học, vấn đề nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi còn có ý nghĩa trong thực tiễn. Việc thiết kế thành công các vector biểu hiện mang gen ZmNF-YB2 và ZmNAC1 phục vụ cho việc chuyển gen vào các giống ngô Việt Nam bước đầu tạo thuận lợi cho công tác chọn tạo giống ngô chống chịu các bất lợi phi sinh học nói chung ở Việt Nam. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 4 Chƣơng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về cây ngô 1. Nguồn gốc địa lý của cây ngô Căn cứ vào những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng của Vavilov (1926) đã chứng minh rằng: Miền Trung Nam Mexico là Trung tâm phát sinh thứ nhất và vùng núi Andet thuộc Peru là Trung tâm phát sinh thứ 2 của cây ngô [59]. Năm 1948 người ta đã tìm thấy hóa thạnh của phấn ngô được khai quật ở Bellar Arter – Mexico, điều này đã khẳng định những nhận định của Vavilov là đúng đắn.

Từ đây, bằng nhiều con đường ngô đã phân bố ra hầu hết các nước thuộc Châu Mỹ, lên phía Bắc, sang phía Tây của Hoa Kỳ và vượt đại dương đến các đảo thuộc vịnh Caribe. Dưới sự tác động mạnh mẽ của con người trong công tác chọn tạo giống, cây ngô đã nhanh chóng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau và đã hình thành một vùng “vành đai ngô” nổi tiếng của Mỹ với các giống ngô lai đầu tiên. Từ Peru cây ngô đã lan truyền xuống phía Nam Chile, đến Ecuador, Columbia và nhiều vùng thuộc nước Brazil. Cây ngô được đưa vào Châu Âu từ sau chuyến thám hiểm của Colombus năm 1493.

Ở đây người ta đã nhanh chóng nhận ra giá trị lương thực của nó, nên cây ngô đã được trồng rộng rãi và nhanh chóng lan truyền ra các nước trong châu lục. Vào khoảng 1521 cây ngô được đưa vào Ấn Độ, Indonesia và năm 1575 ngô được nhập vào Trung Quốc. Theo nhà bác học Lê Quý Đôn, cây ngô được đưa vào Việt Nam từ cuối thế kỷ 17 (thời Khang Hy) do ông Trần Thế Vinh đi sứ Trung Quốc về và được trồng đầu tiên ở Sơn tây và gọi là “ngô”. Nhờ những đặc điểm quý cây ngô sớm được người Việt Nam chấp nhận và mở rộng sản xuất, coi như là một trong các cây lương thực chính chỉ sau cây lúa nước về mặt diện tích nhưng lại là cây năng suất và giá trị kinh tế cao nhất.

Cây ngô có khả năng thích ứng rộng, có thể trồng được nhiều vụ trong năm và trồng được hầu hết các vùng sinh thái khác nhau trong nước, đặc biệt là vùng đất cao không có khả năng tưới tiêu. Đối với vùng núi phía Bắc và Tây Nguyên ngô là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc. Trải qua các Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 5 giai đoạn phát triển, cây ngô ở Việt Nam ngày càng được hoàn thiện và tăng mạnh về diện tích cũng như năng suất. Việc mở rộng diện tích trồng ngô, cùng với sử dụng những giống cho năng suất cao đã góp phần to lớn trong giải quyết nhu cầu lương thực, thực phẩm, làm thức ăn gia súc và sử dụng trong các ngành công nghiệp [7].

Nguồn gốc di truyền của cây ngô Không giống các cây ngũ cốc khác như lúa mỳ và đại mạch, ngô là những cây được thuần dưỡng và tiến hóa từ cây hoang dại làm cây lương thực từ thời cổ đại, cây ngô không có dạng hoang dại nào được tìm thấy ngày nay. Các nhà khoa học đã chỉ ra ngô là cây trồng cho năng suất cao với cấu trúc sinh sản như hiện nay không thể tồn tại trong điều kiện tự nhiên quá 2 năm. Muốn sống sót trong điều kiện chọn lọc tự nhiên đòi hỏi phải có cơ chế phát tán hạt giống, như kiểu quả dễ vỡ, cấu trúc hình thái kiểu lông cứng dễ vướng vào lông thú hay cấu trúc và kích thước cho phép chuyển động, phát tán theo gió. Nhưng ở ngô không có kiểu cấu tạo vậy.

Hạt trưởng thành được giấu kín trong lá bi, khi chúng rơi xuống đất hoặc bị phân hủy hoặc nảy mầm mọc thành cụm, những cụm này có thể không tạo ra con cháu vì độ cạnh tranh giữa các cá thể quá cao. Nếu bị muông thú ăn, hạt dễ dàng bị tiêu hóa mà không được cơ thể động vật thải ra nguyên hạt để nảy mầm, mọc, rồi sinh sản vì những hạt này không được bảo vệ trong vỏ cứng. Nếu không có sự chăm sóc của con người, cây ngô sẽ bị tuyệt chủng qua vài thế hệ [6]. Nguồn gốc di truyền của cây ngô là một đề tài được tranh luận sôi nổi trong suốt 50 năm qua, cho đến nay có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền cây ngô và được tóm lược như sau [6]: 1).

Là con lai giữa teosinte và thành viên không rõ thuộc chi Andropogoneae. Là con lai nhị bội tự nhiên giữa các loài Á châu thuộc chi Maydeae và Andropogoneae. Là con lai giữa ngô bọc, teosinte và tripsacum. Là con lai của ngô bọc Nam Mỹ và tripsacum Trung Mỹ với teosinte.

Ngô, teosinte và tripsacum bắt nguồn riêng từ một dạng tổ tiên chung. Teosinte là nguồn gốc của ngô sau một hoặc nhiều đột biến. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc điểm như chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng với các điều kiện ngoại cảnh khác nhau.

Song cây ngô có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu. Các bộ phận của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ) và hạt.