Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1. Khái niệm - Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng [5]. - Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên 2 nguyên tắc [5]: + Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, do trong tế bào có chứa bộ ADN (NST) hoàn chỉnh, chứa toàn bộ thông tin di truyền cho 1 chu kì sống hoàn chỉnh.
+ Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa. Phân hóa: 1 Tế bào hay 1 khối tế bào phân hóa tạo mô, cơ quan, hệ cơ quan. Phản phân hóa: Khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây trồng 1.
Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây trồng ở thế giới Cuối thế kỷ 19, nhà khoa học người Đức Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó. Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [3]. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum 3 esculentum) với một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men.
Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau [6]. Overbeck ở Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura). Sau đó năm 1948 Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt.
trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhận tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công [3]. Trong thời gian từ 1954-1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác, đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách đưa lắc trên máy lắc. Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo tế bào cà rốt khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định [15].
Vào đầu những năm 1960, Morel là người đầu tiên áp dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống Lan trong ống nghiệm. Morel và Martin (1952) đã tạo được cây Thược dược sạch virut bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy. Năm 1960 Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulase để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc, gọi là protoplast. Từ năm 1980-1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật được công bố.
Nhờ có plasmid, phân tử ADN vòng thường có trong tế bào vi khuẩn, được lắp ghép cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thực hiện thành công, hàng loạt công trình chuyển gen ngoại lai vào thực vật [4]. 4 Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách của cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn không còn hạn chế ở cây cảnh mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả, cây cảnh,… Và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới [12]. Hiện nay, rất nhiều loài hoa như: hoa Lan, Cúc, Đồng tiền.và các loài cây cảnh có giá trị khác cũng được nhân giống theo phương pháp nuôi cấy mô.
Hiện có khoảng 30 chi phong Lan được nhân giống phổ biến theo con đường nuôi cấy mô. Ở Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan,… việc nhân giống theo con đường này đã trở nên rất phổ biến trên các đối tượng là hoa nhằm mục đích thương mại, điển hình như: - Hà Lan là Quốc gia có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phát triển, nước này đã ứng dụng lĩnh vực này vào việc nhân và lai tạo các giống cây trồng mới đặc biệt là các loài hoa với đa dạng về chủng loại và màu sắc. - Thái Lan đã sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân, tạo các loại giống hoa Phong Lan rất thành công [11]. Tình hình phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây trồng ở Việt Nam Việc nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam chỉ mới bắt đầu từ năm 1975.
Ý thức được triển vọng to lớn của ngành công nghệ sinh học trong chọn giống và nhân giống cây trồng, nhiều cơ quan làm công tác giống cây trồng bắt đầu ứng dụng công nghệ này. Trong những năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam cũng đã đạt được những thành tựu nhất định, có rất nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bước đầu đã nhân giống thành công một số loài hoa như: Cúc, Đồng tiền, Lan, Hồng,. có hệ số nhân giống cao và cây con có chất lượng tốt.
5 Năm 2008 ở nước ta công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới. Một số địa phương nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô để thương mại, ngoài ra còn khôi phục nhiều loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng như các loài Lan rừng quý hiếm (Lan Hài hồng) tại phân viên sinh học Đà Lạt [10]. Đà Lạt là địa phương có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào phát triển rất mạnh. Việc lai tạo giống thông qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào được phổ biến khá rộng rãi.
Tại đây các cơ sở nuôi cấy mô của nhà nước và tư nhân đều phát triển mạnh và nuôi cấy rất nhiều giống cây khác nhau, trong đó chủ yếu là các loại hoa, hầu như nông dân trồng hoa ở Lâm Đồng đều sử dụng cây con giống từ cây nuôi cấy mô và đã trồng hoa với các kỹ thuật mới nên đem lại lợi nhuận kinh tế rất cao [10]. Tại những tỉnh thành khác của cả nước cũng đã tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm các giống cây bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và bước đầu thu được một số kết quả đáng kể, cụ thể như [7]: + Phòng nuôi cấy mô của Trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng tỉnh Phú Yên hằng năm có thể tạo ra hơn 100.000 cây chuối cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. + Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống bạch đàn nuôi cấy mô. + Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ khoa học công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công việc nhân giống cây Lô Hội bằng phương pháp nuôi cấy mô đây là một loại được liệu quý của địa phương.
+ Viện sinh học Nông nghiệp của Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong 50 cơ sở chuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật, bước đầu cơ sở này đạt được những kết quả tốt như nuôi cấy các loài Phong Lan, Dứa Cayen, khoai tây sạch bệnh, đặt biệt là các loài hoa có giá trị (Lan, Đồng tiền, Cúc,…). Hiện nay công nghệ sinh học tế bào ở Hà Nội đang có bước phát triển nhảy vọt để phục vụ cho nền Nông nghiệp. + Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ tỉnh Bình Định luôn đẩy mạnh việc triển khai ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học về nuôi cấy 6 mô thực vật để nhân giống phục vụ công tác giống cây trồng tại địa phương. Trung tâm đã nghiên cứu và hoàn thiện được nhiều quy trình vi nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô các giống cây ăn quả, cây công nghiệp, cây hoa cảnh có giá trị kinh tế cao, phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Định và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, như: chuối, đu đủ; dứa, mía, bạch đàn, keo lai, … và một số loại phong lan (Dendrobium, hồ điệp, ngọc điểm), lay ơn, hoa cúc, hoa huệ, đồng tiền,… So với các nước phát triển trên thế giới, công nghệ sinh học của Việt Nam còn một khoảng cách khá xa.
Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó, đang phát triển có những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn phát triển ngành Nông-Lâm nghiệp của nước nhà.