Đặt vấn đề Việt Nam đƣợc biết đến là một đất nƣớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm và có mùa đông lạnh tại miền Bắc nên hệ sinh thái và thảm động thực vật rất đa dạng về số lƣợng loài. Ở Việt Nam, ngƣời ta đã tìm và phát hiện ra trên 5.000 loài cây thuốc quý có tác dụng rất lớn trong Y học và giá trị kinh tế rất cao. Tuy nhiên, trong những năm trở lại đây, dƣới sự khai thác bất hợp lý bừa bãi mà không có sự chú trọng trong việc bảo tồn nguồn gen của các loại cây thuốc quý đó nên nguồn cây dƣợc liệu của Việt Nam đang dần bị cạn kiệt. Trƣớc thực trạng trên, các biện pháp nhân giống bằng phƣơng thức truyền thống nhƣ giâm hom, chiết cây, gieo hạt hay lai tạo ra các loại giống mới đã đƣợc áp dụng và kết hợp với các biện pháp kĩ thuật nông nghiệp công nghệ cao nhằm mở rộng diện tích vùng trồng cây dƣợc liệu tại các vùng miền đƣợc rất nhiều địa phƣơng đầu tƣ nhằm bảo tồn gìn giữ và phát triển nguồn dƣợc liệu nƣớc nhà.
Cây Khôi tía (Ardisia gigantifolia Stapf) hay trong dân gian thƣờng gọi là cây Khôi nhung, cây Đơn tƣớng quân; đƣợc coi là một loài dƣợc liệu quý dùng trong Đông y dùng để chữa các bệnh liên quan đến dạ dày và tá tràng… Tuy nhiên, do bị khai thác quá mức; việc đốt, chặt phá rừng làm nƣơng rẫy cộng với việc tái sinh kém (do cây chủ yếu tái sinh bằng hạt) nên đã làm thu hẹp khu vực phân bố cây Khôi tía một cách nhanh chóng. Chính vì vậy, NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHÔI TÍA (Ardisia gigantifolia Stapf) đƣợc xem là vô cùng cấp thiết để góp phần xây dựng đƣợc quy trình nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô góp phần phục vụ cho công việc bảo tồn và phát triển loài dƣợc liệu quý này, nhằm thay thế cho những phƣơng thức nhân giống truyền thống trƣớc đây. Mụ đí Xây dựng đƣợc quy trình nhân giống in vitro cây Khôi tía (Ardisia gigantifolia Stapf) cho hệ số nhân giống cao, cung cấp số lƣợng lớn nguồn cây giống sạch bệnh, chất lƣợng cao cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen của cây. Y u ầu Xác định đƣợc loại môi trƣờng nhân nhanh cho hệ số nhân nhanh cây Khôi tía hiệu quả nhất, nhằm phục vụ các nghiên cứu chọn tạo giống sau này.
Xác định đƣợc môi trƣờng cho tỷ lệ tạo rễ và chất lƣợng của rễ là tốt nhất, nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cây Khôi tía bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro. Xác định đƣợc chế độ chăm sóc phù hợp với cây Khôi tía , bắt đầu từ giai đoạn đƣa cây ra ngoài vƣờn ƣơm, sinh trƣởng và phát triển. Ý ng ĩa k oa ọ và t t ễn ủa đề tà 1. Ý nghĩa khoa học Đánh giá đƣợc tác dụng của một số loại chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, các yếu tố nhƣ tiêu chuẩn cây, giá thể trồng… trong việc tạo nguồn cây Khôi tía giống có chất lƣợng tốt.
Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho công tác nghiên cứu, giảng dạy, bảo tồn và nhân giống cây Khôi tía. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Khôi tía giúp bảo tồn và nhân giống cây ngoài tự nhiên. 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. G t ệu ung về ây K ô 2.
Nguồn gốc và phân bố Chi Ardisia có hơn 100 loài trên thế giới, Việt Nam có 94 loài, trong đó nhiều loài đƣợc dùng làm thuốc. Cây Khôi có ở vùng phân bố tƣơng đối phổ biến ở hầu hết các tỉnh miền núi của Việt Nam nhƣ Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng Ninh, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Yên Bái, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi. Độ cao phân bố từ 400 đến 1000m (Đỗ Huy Bích và cs, 2004). Cây Khôi thuộc loài cây bụi, ƣa ẩm và ƣa bóng, thƣờng mọc dƣới tán rừng kín thƣờng xanh ẩm còn nguyên sinh hay tƣơng đối nguyên sinh.
Ở tỉnh Hà Tĩnh và Quảng Nam, cây mọc cả dƣới tán rừng xen tre nứa, đất có nhiều mùn và giàu dinh dƣỡng. Nguồn trữ lƣợng tự nhiên trƣớc kia của cây Khôi tƣơng đối dồi dào. Song qua nhiều năm khai thác liên tục trữ lƣợng đã giảm sút nhiều. Trên thế giới, Khôi có ở Trung Quốc và Lào.
Ở Trung Quốc, có thể tìm thấy Khôi ở tỉnh Quảng Tây, Giang Tây và Phúc Kiến (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) 2. Phân loại thực vật Trong hầu hết các tài liệu về Y học cổ truyền và cây dƣợc liệu, tên khoa học của Khôi đều là loài Ardisia silvestris Pitard. Tuy vậy, qua công tác điều tra và giám định lại tên khoa học, Viện Dƣợc liệu và các chuyên gia phân loại thực vật đã xác định loài Khôi đang sử dụng để nhân giống, phát triển trồng phổ biến hiện nay là loài Ardisia gigantifolia Stapf. Loài Ardisia silvestris Pitard hiện còn rất hiếm ở Việt Nam, chỉ một vài cá thể còn tồn tại ở những vùng rừng khá sâu và hẻo lánh.
Phân loại thực vật : (Danh lục cây thuốc Việt Nam,Viện Dƣợc liệu (2016)) Giới (regnum): Plantae (thực vật) Bộ (ordo) : Primunales (Anh thảo) Họ (famillia) : Myrsinaceae (Đen cơm, cơm nguội) Chi (genus) : Ardisia (cơm nguội, trọng đũa) 3 Loài (species) : Ardisia Tên khoa học: Ardisia gigantifolia Stapf 2. Đặc điểm thực vât học Cây nhỏ, cao 1,5 – 2m thân mảnh, nhẵn, ít phân nhánh, có nhiều vết sẹo xám do lá rụng để lại. Lá mọc so le, thƣờng tập trung ở ngọn thân, dài 20 – 30cm, rộng 6 – 8cm, hình mác thuôn, gốc và đầu nhọn, mép khía răng rất nhỏ, đều và sít nhau, mặt trên màu xanh mịn, mặt dƣới màu tím có nhiều chấm nhỏ, hai mặt đều có lông mịn nhƣ nhung. Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chùm dài 10 – 15cm; hoa màu hồng tím; lá bắc nhỏ hình mác; tràng 5 cánh, có nhị 5, chỉ nhị ngắn; bầu hình trứng.
Khôi ra hoa quả hàng năm, tỷ lệ hoa kết quả thấp. Quả hình cầu khi chín có màu đỏ. Khi quả chín phát tán gần, nên có thể tìm thấy những cây con xung quanh gốc cây mẹ. Cây có khả năng tái sinh chồi sau khi chặt (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Thành phần hóa học Lá của cây Khôi có chứa các thành phần hoá học chính là tanin và glucosid có công dụng trung hòa, chống viêm, làm giảm độ acid của dạ dày, giảm đau, đặc biệt có tác dụng làm se vết loét, kích thích lên da non và làm lành vết thƣơng nên đƣợc dùng để trị viêm loét dạ dày tá tràng. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Anh và đồng tác giả (1996) trong lá của cây có chứa 2-methyl-5-(Z-nonadec-14-enyl) resorcinal và 5-(Z- nonadec-14-enyl) resorcinal (Nguyễn Hoàng Anh, 1996). Saponin triterpenoid từ lá cây Khôi có cyclamiretin A 3β-O- {α-L- rhamnopyranosyl- (1 → 3) - [β-D-xylopyranosyl- (1 → 2)] - β-D-glucopyranosyl- (1 → 4) - [β -D-gluco-pyranosyl- (1 → 2)] - α-L-arabinopyranoside} (AG4) có độc tính gây ra đột ngột đối với tế bào MCF-7 (, Zheng, 2013); hợp chất AG36 đã đƣợc chứng minh là có tác dụng chống ung thƣ vú mạnh hơn AG4 (Mu, 2017). Thân rễ cây Khôi gồm 9 hợp chất, bao gồm: 11-O-galloylbergenin (1), 11- O-syringylbergenin (2), 11-O-protocatechuoylbergenin (3), 4-O-galloylbergenin (4), 11 -O-vanilloylbergenin (5), (-) -epicatechin-3-gallate (6), stigmasterol-3-O- beta-D-glucopyranoside (7), (-) -4'-hydroxy-3-methoxyphenyl-beta-D- [6-O-(4"- hydroxy-3", 5"-dimethoxybenzoyl)] -glucopyranoside (8), and beta-sitosterol (9) (Feng, 2011).
Tác dụng dược lí Theo bác sĩ chuyên khoa tiêu hóa, nếu dùng ở dạng nƣớc sắc, lá cây Khôi không chỉ có tác dụng giảm đau, giảm dịch vị xuống mức bình thƣờng ở những bệnh nhân đau dạ dày mà còn giúp bệnh nhân ăn ngon và ngủ tốt hơn. Nƣớc sắc của lá cây có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn HP rất hiệu quả. Tác dụng ức chế này tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình điều trị loét dạ dày tá tràng. Đặc biệt, lá cây Khôi kết hợp với các dƣợc liệu nhƣ nghệ vàng, hồi đầu thảo, phục linh, sa nhân, cam thảo… có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng cấp và mạn tính; giúp giảm nhanh các triệu chứng nhƣ đầy bụng, ợ hơi, 5 ợ chua, nóng rát, đau vùng thƣợng vị; giúp bổ tỳ vị, tăng cƣờng chức năng hệ tiêu hoá.
Nhân dân miền ngƣợc vùng Lang Chánh, Ngọc Lạc tỉnh Thanh Hoá thƣờng dùng lá cây Khôi chế biến, sắc uống chữa đau bụng. Hội Đông y Thanh Hoá đã kết hợp dùng lá cây Khôi (80g), lá bồ công anh (40g) và lá khổ sâm (12g) sắc uống chữa đau dạ dày; có thể gia thêm lá cam thảo dây (20g). Nhiều địa phƣơng khác ở tỉnh Nghệ An cũng dùng lá Khôi chữa đau dạ dày. Lá cây Khôi đƣợc dùng với lá vối, lá hoè nấu nƣớc tắm cho trẻ bị sài lở, hoặc giã với lá Vối trộn với dầu vừng đắp nhọt cho trẻ.
Ngƣời Dao dùng rễ cây Khôi thái nhỏ phơi khô ngâm rƣợu uống cho bổ huyết, lại dùng sắc uống chữa kiết lỵ ra máu, đau yết hầu và đau cơ. Sơ bộ nghiên cứu trên thỏ, chuột bạch và khỉ thấy có một số nhận xét nhƣ lá cây Khôi làm giảm độ axit của dạ dày khỉ, làm giảm nhu động ruột cô lập của thỏ, làm yếu sự co bóp của tim. Thí nghiệm trên chuột trắng, nó còn có tác dụng làm giảm sự hoạt động tự nhiên của chuột thí nghiệm. Về dƣợc lý lâm sàng, bệnh viện 108 đã thí nghiệm dùng lá Khôi chữa cho một số bệnh nhân đau đau dạ dày, sơ bộ thấy giảm đau và làm giảm dịch vị xuống mức bình thƣờng (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
Kinh nghiệm dân gian và các nghiên cứu trong y học cổ truyền đã khẳng định lá của Khôi là một vị thuốc có khả năng chữa bệnh dạ dày rất hiệu quả. Bởi các hoạt chất trong lá cây Khôi có tác dụng trung hoà làm giảm tiết acid dịch vị, giúp se vết loét và làm lành dạ dày một cách nhanh chóng. Dẫn xuất mới phát hiện từ thân rễ cây Khôi là bergenin đã đƣợc chúng minh là có tác dụng chống oxi hóa (Mu, 2013). Gần đây, tác dụng chống ung thƣ của Khôi đã đƣợc tập trung nghiên cứu.4 hợp chất saponin triterpenoid mới nhóm oleanane đã đƣợc phân lập từ thân rễ cây Khôi cho thấy có tác dụng ức chế Khôi u mạnh trong thí nghiệm in vitro dựa trên mô hình MTT (Wen, 2008).
Năm 2016, Quan và cs đã phân lập đƣợc chất các hợp chất resorcinol từ lá và thân cây Khôi (Guan, 2016) có tác dụng chống ung thƣ phổi rằng AGB-5 6 và AG36 chiết xuất từ thân rễ cây Khôi có tác dụng chữa bệnh ung thƣ tuyến vú ở ngƣời (Mu, 2013; 2015; 2017).