Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Giới thiệu khái quát về cây Lõi thọ 1. Đặc điểm hình thái, phân loại và giá trị sử dụng Lõi thọ có tên khoa học học là: Gmelina arborea Roxb thuộc họ Tếch (Verbenaceae) là cây gỗ lớn có thể cao 35m, đường kính 100cm. Vỏ cây màu xám nâu nhiều lỗ bì lớn, bong mảng.
Cành non mọc gần đối hơi vuông cạnh, nhiều đốm xám trắng nhỏ. Lá đơn mọc đối hình trứng gần tròn, đầu nhọn dần, đuôi nêm rộng. Phiến lá dài 10 - 25cm, rộng 5 - 18cm, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới xanh hay vàng nhạt, phủ lông mịn mép lá nguyên hoặc hơi gợn sóng. Có 3 - 5 gân gốc, nách gân gốc mặt dưới có tuyến nhỏ xanh bóng.
Cuống lá dài 4 - 5cm phủ lông màu nâu nhạt, không có lá kèm. Hoa tự chùm hoặc xim viên chùy phủ dầy lông nâu vàng. Hoa tương đối lớn, đài hình chuông mép có 5 răng nhỏ hình tam giác. Tràng hoa không đều có 2 môi, môi trên nguyên hoặc hơi lõm ở đỉnh, môi dưới xẻ 3, màu vàng, phía trong phớt tím.
Nhị 4, có 2 nhị dài trội lộ ra ngoài, bầu hình cầu, nhẵn, đầu nhuỵ xẻ đôi. Quả hạch đường kính 2 - 2,5cm khi chín màu vàng sau nâu đen, hạch có 4 ô, chỉ có 1 hạt. Vỏ hạch cứng, đỉnh có lỗ nhỏ. Mỗi kg hạt có từ 700 - 1400 hạt.
Gỗ có giác mỏng màu vàng nhạt, lõi nâu vàng, kết cấu mịn dễ làm, ít biến dạng, không bị mối mọt. Gỗ có trọng lượng riêng từ 0,42 – 0,64. Có thể dùng gỗ Lõi thọ đóng thuyền, làm nhà, làm giấy, làm gỗ dán lạng. Lá và quả loài Lõi thọ được sử dụng nhiều ở Ấn Ðộ, một trong những bộ phận đó có giá trị làm thuốc[2].
Đặc tính sinh học, sinh thái và phân bố Lõi thọ phân bố ở vùng Nam và Đông Nam Châu Á từ Pakistan và Sri Lanka tới Myanma và chủ yếu ở các quốc gia Bangladesh, Myanma, Thái Lan, nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia và Philippines (Jensen, 1995). Có 4 thể tìm thấy loài này ở vùng nhiệt đới thuộc Châu Phi và các quốc gia Mỹ Latin (Evans 1982). Ở Việt Nam Lõi thọ mọc rải rác ở trong rừng và phát triển tốt ở các tỉnh phía Bắc, Trung du, và vùng núi thấp như: Tuyên Quang, Lạng Sơn, Phú Thọ, Hà Giang (theo tạp chí Kinh tế VAC, số 25). Theo Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Lõi thọ phân bố rãi rác ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, là loài cây mọc nhanh, rụng lá vào mùa khô, ra lá trước khi ra hoa.
Ra hoa vào tháng 5 - 6. Quả chín vào tháng 11 - 12. Lõi thọ là loài cây ưa sáng, mọc tự nhiên ở vùng có khí hậu nhiệt đới mưa mùa, có mùa khô tương đối dài, lượng mưa thích hợp 1700 – 2200 mm/năm; nhiệt độ cao nhất tuyệt đối 37 – 480C, thấp nhất tuyệt đối 1 - 160C. Có thể sống được trên nhiều loại đất kể cả đất đá ong, đất đá vôi.
Trên đất cát hoặc sỏi cây sinh trưởng chậm, khả năng tái sinh hạt và chồi tốt[2]. Nhân giống cây trồng in vitro 1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên.
Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống.
5 Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ (Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy.
Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ (Brown &Thorpe, 1986). Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật Tính toàn năng cùng với sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào là cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào thực vật Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Sự trẻ hóa Vào thế kỷ XVII, XVIII người ta cho rằng các dòng vô tính bị thoái hóa đi theo tuổi và chỉ có thể trẻ hóa thông qua sinh sản bằng hạt. Song thực 6 tế cho thấy đời sống của một dòng vô tính là vô hạn nếu như nó sống trong môi trường thích hợp và liên tục đổi mới bằng sinh sản sinh dưỡng.
Khả năng tái sinh là một dấu hiệu quan trọng xác định sự chuyển giai đoạn từ non trẻ sang trưởng thành. Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Nuôi cấy các bộ phận non trẻ sẽ ra chồi, ra rễ tốt hơn các bộ phận trưởng thành. Vì vậy, việc trẻ hóa là một biện pháp quan trọng nhất trong nhân giống sinh dưỡng [1], [7].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitro thực chất là kết quả của phân hóa và phản phân hóa tế bào. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Quá trình phân hóa tế bào có thể bảng thị như sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình.
Trong trường hợp cần thiết và có điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Về bản chất thì quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào là do điều hòa hoạt động của gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động.
Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào. 7 Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân hóa sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn[1], [7]. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ.
Giống như nhân giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh.
Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương thức nuôi cấy mô tế bào thực vật như sau: 1.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). 8 Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp,… Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường.
Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hoá của tế bào đã phân hoá. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin.