Luận văn thạc sĩ: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định đặc tính enzym

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Phạm Thị Xoè
• Người hướng dẫn: Gs. Ts Nguyễn Đình Quyến
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. SƠ LƯỢC VỀ KITIN
• 1.1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên
• 1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của kitin
• 1.1.3. Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin
• 1.1.4. Một số quy trình sản xuất kitin
• 1.1.4.1. Quy trình sản xuất kitin của Hackman
• 1.1.4.2. Phương pháp điều chế kitin của Capozza
• 1.1.4.3. Quy trình sản xuất kitin của tác giả Trần Thị Luyến
• 1.1.5. Một số ứng dụng của kitin
• 1.2. SƠ LƯỢC VỀ KITINAZA
• 1.2.1. Phân loại kitinaza
• 1.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 1.3.1. Hoá chất, dụng cụ
• 1.3.2. Môi trường
• 1.3.3. Phương pháp
• 1.3.3.1. Phân lập vi khuẩn
• 1.3.3.2. Xác định khả năng sinh kitinaza
• 1.3.3.3. Phương pháp xác định số lượng tế bào
• 1.3.3.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh kitinaza của các chủng lựa chọn
• 1.3.3.5. Xác định khả năng kháng nấm
• 1.3.3.6. Một số đặc tính sinh học của các chủng lựa chọn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH KITINAZA
• 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KITINAZA CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN
• 3.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy
• 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.2.3. Ảnh hưởng của pH
• 3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
• 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản
• 3.3. HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU
• 3.4. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn sản xuất kitinaza

Nghiên cứu về vi khuẩn sản xuất kitinaza đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Kitinaza là enzym có khả năng phân giải kitin, một polysaccarit quan trọng trong tự nhiên. Việc tìm hiểu về vi khuẩn sản xuất kitinaza không chỉ giúp hiểu rõ hơn về quá trình sinh học mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong công nghiệp và nông nghiệp.

1.1. Kitin và vai trò của nó trong tự nhiên

Kitin là một polysaccarit phổ biến, đứng thứ hai sau xenlulôzơ. Nó có mặt trong vỏ của nhiều loài động vật như tôm, cua và nấm. Kitin đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và chức năng của các sinh vật này.

1.2. Tại sao nghiên cứu kitinaza lại quan trọng

Nghiên cứu về kitinaza giúp hiểu rõ hơn về khả năng phân giải kitin, từ đó có thể ứng dụng trong việc xử lý chất thải từ nông nghiệp và công nghiệp, cũng như phát triển các sản phẩm sinh học mới.

II. Thách thức trong việc phân lập vi khuẩn sản xuất kitinaza

Việc phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất kitinaza gặp nhiều khó khăn. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất đều ảnh hưởng đến khả năng sinh kitinaza của vi khuẩn. Điều này đặt ra thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu trong việc tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kitinaza

Nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym kitinaza. Việc xác định các điều kiện tối ưu là rất quan trọng để nâng cao hiệu suất sản xuất.

2.2. Khó khăn trong việc xác định chủng vi khuẩn

Việc xác định các chủng vi khuẩn có hoạt tính kitinaza cao không chỉ phụ thuộc vào phương pháp phân lập mà còn vào khả năng sinh enzym của chúng trong các điều kiện khác nhau.

III. Phương pháp phân lập vi khuẩn sản xuất kitinaza hiệu quả

Để phân lập vi khuẩn có khả năng sản xuất kitinaza, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định hoạt tính enzym.

3.1. Quy trình nuôi cấy vi khuẩn

Quy trình nuôi cấy vi khuẩn cần được tối ưu hóa để đảm bảo rằng các vi khuẩn có khả năng sản xuất kitinaza được phát triển tốt nhất. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp là rất quan trọng.

3.2. Kỹ thuật xác định hoạt tính kitinaza

Sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định hoạt tính của enzym kitinaza giúp tiết kiệm thời gian và nâng cao độ chính xác trong việc phân lập các chủng vi khuẩn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kitinaza trong công nghiệp

Kitinaza có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực xử lý chất thải và sản xuất các sản phẩm sinh học. Việc ứng dụng kitinaza không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các sản phẩm có giá trị.

4.1. Ứng dụng trong xử lý chất thải

Sử dụng kitinaza trong xử lý chất thải từ nông nghiệp và công nghiệp giúp phân giải kitin, từ đó giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra các sản phẩm hữu ích.

4.2. Sản xuất sản phẩm sinh học từ kitinaza

Kitinaza có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm sinh học như glucozamin và kitosan, có nhiều ứng dụng trong y học và mỹ phẩm.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu kitinaza

Nghiên cứu về kitinaza và vi khuẩn sản xuất enzym này đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực sinh học và công nghệ. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng kitinaza sẽ góp phần quan trọng vào việc phát triển bền vững trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kitinaza

Nghiên cứu về kitinaza sẽ tiếp tục được mở rộng, với nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp và nông nghiệp. Việc phát triển các công nghệ mới sẽ giúp nâng cao hiệu suất sản xuất và ứng dụng của enzym này.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp phân lập và xác định hoạt tính kitinaza, cũng như ứng dụng thực tiễn của enzym này trong các lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp chế biến thủy sản tại Việt Nam tạo ra nguồn phế liệu giáp xác khổng lồ nhưng cũng kéo theo áp lực ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Theo thống kê của ngành thủy sản, chỉ riêng sản lượng tôm năm 2003 đã đạt khoảng 193.973 tấn, trong đó lượng phụ phẩm đầu và vỏ tôm chiếm từ 40% đến 70% tổng khối lượng nguyên liệu. Phần lớn lượng phế liệu giàu polyme sinh học này chưa được tái chế triệt để, hoặc bị xử lý bằng phương pháp hóa học dùng axit clohiđric và kiềm đặc, gây hủy hoại nguồn nước và phát sinh mùi hôi nồng nặc trong khu dân cư.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học mã số 60 42 40 đã tập trung giải quyết bài toán tái chế phụ phẩm bằng công nghệ sinh học thân thiện với môi trường. Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là phân lập các chủng vi khuẩn bản địa có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza hoạt tính cao từ nguồn đất tự nhiên, đồng thời xác định các đặc tính hóa lý tối ưu nhằm tạo tiền đề sản xuất chế phẩm sinh học quy mô lớn.

Phạm vi nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trên các mẫu đất canh tác và đất bổ sung cơ chất tại huyện Ninh Giang, tỉnh Hải Dương trong giai đoạn 2011 đến 2012. Kết quả phân lập thành công các chủng vi sinh vật ưu việt không chỉ bổ sung nguồn gen quý cho ngân hàng giống vi sinh vật Việt Nam mà còn mở ra giải pháp chuyển hóa phụ phẩm tôm cua thành glucosamine, thức ăn chăn nuôi giàu protein và chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học an toàn, nâng cao giá trị gia tăng cho chuỗi cung ứng thủy sản nội địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân giải sinh học polyme tự nhiên và cơ chế xúc tác của hệ enzym ngoại bào. Kitin là polyme sinh học dồi dào thứ hai trên Trái Đất sau xenlulôzơ, có công thức tổng quát là (C8H15O5N)n với cấu trúc chuỗi thẳng gồm các đơn phân N-acetyl-D-glucosamine liên kết qua cầu nối beta-1,4-glicozit. Trong tự nhiên, kitin tồn tại dưới 3 dạng cấu trúc dị hình chính là alpha, beta và gamma-kitin; trong đó alpha-kitin có mạng lưới liên kết hydro đối song song cực kỳ bền vững, chiếm ưu thế trong vỏ giáp xác.

Quá trình phân hủy kitin dựa trên hệ thống phân loại enzym quốc tế Glycosyl Hydrolase họ 18 và 19. Hệ enzym kitinaza bao gồm endo-kitinaza (EC 3.2.1.14) cắt ngẫu nhiên các liên kết nội mạch tạo chitooligosaccarit, exo-kitinaza giải phóng chitobiose từ đầu không khử, và beta-N-acetylhexosaminidaza (EC 3.2.1.52) phân giải chitobiose thành đơn phân N-acetyl-D-glucosamine. Bên cạnh đó, mô hình sinh lý học của chi vi khuẩn hình que Gram dương Bacillus có khả năng tạo nội bào tử chịu nhiệt được ứng dụng làm khung phân loại sinh học chính nhờ khả năng tiết lượng lớn enzym ngoại bào vào môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ quy trình phân lập có kiểm soát trên cỡ mẫu 66 chủng vi khuẩn đất. Phương pháp chọn mẫu bao gồm 2 nhóm: nhóm mẫu đất đối chứng tự nhiên thu thập 31 chủng và nhóm mẫu đất được làm giàu nhân tạo bằng cách vùi ủ vỏ tôm cua giáp xác trong 30 ngày thu thập 35 chủng. Kỹ thuật chọn mẫu có định hướng này giúp tăng mật độ vi sinh vật thích nghi cơ chất một cách vượt trội.

Quy trình đánh giá hoạt tính enzym kitinaza được thực hiện thông qua phương pháp đặt thỏi thạch và phương pháp đục lỗ khuếch tán dịch chiết enzym thô trên môi trường thạch bổ sung 0,5% kitin tinh chế hoặc kitin thô. Hoạt tính phân giải được lượng hóa chính xác bằng chỉ số H = D - d (tính bằng milimet), trong đó D là tổng đường kính vòng phân giải và d là đường kính lỗ thạch sau khi hiện màu bằng thuốc thử Lugol iốt. Mật độ vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc pha loãng bậc 10 (từ nồng độ 10^-1 đến 10^-6) trên đĩa thạch dinh dưỡng sau 24 giờ ủ ấm ở 35 độ C. Đặc tính sinh học và hình thái tế bào được kiểm tra thông qua kỹ thuật nhuộm Gram, soi kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu 100X) và thử nghiệm sức sống nội bào tử ở 80 độ C trong 10 phút.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc vi sinh vật đất đã chứng minh hiệu quả vượt trội của phương pháp làm giàu cơ chất. Trong tổng số 31 chủng phân lập từ đất thường, chỉ có 7 chủng (tỷ lệ 22,58%) thể hiện hoạt tính phân giải kitin với đường kính vòng phân giải từ 9 mm đến 25 mm. Ngược lại, mẫu đất làm giàu thu được 11 chủng có hoạt tính trên tổng số 35 chủng phân lập (tỷ lệ 31,43%), đồng thời mật độ tế bào chủng HD1 đạt 12 khuẩn lạc trên đĩa ở độ pha loãng 10^-5, cao hơn 140% so với mật độ 5 khuẩn lạc của chủng NG1 ở cùng nồng độ.

Từ 11 chủng tuyển chọn, hai chủng vi khuẩn thể hiện hoạt tính mạnh nhất được ký hiệu là HD1 và HD5. Trên môi trường nuôi cấy tối ưu số 1 chứa 0,7% pepton và 0,1% cao nấm men, chủng HD1 tạo vòng phân giải đạt 31 mm đối với kitin tinh sạch và 27 mm đối với kitin thô. Chủng HD5 đạt kích thước vòng phân giải lần lượt là 29 mm và 26 mm.

Thử nghiệm các yếu tố môi trường xác định nhiệt độ tối ưu cho chủng HD1 sinh tổng hợp enzym là 40 độ C (hoạt tính 31 mm, mật độ đạt khoảng 30 x 10^8 CFU/ml), trong khi chủng HD5 đạt đỉnh hoạt tính ở 35 độ C (vòng phân giải 27 mm). Về độ pH, chủng HD1 hoạt động tối ưu tại pH trung tính 7,0 (hoạt tính 29 mm), còn chủng HD5 đạt cực đại tại pH kiềm nhẹ 7,5 (hoạt tính 28 mm). Cả hai chủng đều thể hiện động học enzym tương thích khi hoạt tính tăng tuyến tính từ nồng độ cơ chất 5 phần nghìn đến 15 phần nghìn (đạt vòng phân giải cực đại 35 mm ở HD1 và 34 mm ở HD5) trước khi đạt trạng thái bão hòa ở nồng độ 20 đến 25 phần nghìn. Ngoài ra, dịch enzym thô duy trì độ bền sinh học xuất sắc sau 4 tuần bảo quản ở 4 độ C với hoạt tính chỉ giảm nhẹ từ 24 mm xuống 22 mm. Đáng chú ý, cả HD1 và HD5 đều thể hiện khả năng ức chế mạnh nấm ký sinh cánh cứng với đường kính vòng kháng nấm đạt lần lượt 25 mm và 28 mm.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thực nghiệm hoàn toàn phù hợp với lý thuyết động học enzym Michaelis-Menten. Sự gia tăng nồng độ cơ chất từ 5 phần nghìn lên 15 phần nghìn giúp các phân tử kitin nhanh chóng lấp đầy các trung tâm hoạt động tự do trên bề mặt enzym kitinaza. Khi toàn bộ vị trí liên kết xúc tác đạt trạng thái bão hòa ở nồng độ trên 15 phần nghìn, tốc độ phản ứng thủy phân đạt vận tốc tối đa và kích thước vòng phân giải duy trì mức bình nguyên ổn định khoảng 33 mm đến 35 mm.

Dữ liệu thực nghiệm về nhiệt độ và pH có thể được biểu diễn trực quan qua biểu đồ đường dạng chuông parabol đối xứng. Hoạt tính enzym suy giảm dần khi nhiệt độ vượt quá 45 độ C hoặc pH hạ xuống dưới 5,5 do hiện tượng biến tính cấu trúc bậc ba của protein enzym ngoại bào. So với các chủng chịu nhiệt cực hạn như Bacillus licheniformis phân lập từ suối nước nóng hoạt động ở 80 độ C, hai chủng HD1 và HD5 thích nghi hoàn hảo với dải nhiệt độ canh tác nông nghiệp nhiệt đới từ 30 độ C đến 40 độ C tại miền Bắc Việt Nam. Sự chênh lệch hoạt tính khoảng 15% đến 20% giữa cơ chất kitin tinh sạch và kitin thô phản ánh sự hiện diện của một số khoáng chất vi lượng và protein tồn dư trong bột vỏ tôm tự chế đóng vai trò như chất ức chế cạnh tranh nhẹ, tuy nhiên mức hoạt tính thu được trên kitin thô vẫn hoàn toàn đáp ứng yêu cầu xử lý rác thải sinh học thực tế với chi phí sản xuất cực thấp.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các thông số kỹ thuật thu được từ luận văn, bốn giải pháp trọng tâm được đề xuất nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất:

1. Chuẩn hóa quy trình nuôi cấy lên men bán công nghiệp cho hai chủng vi khuẩn HD1 và HD5 ở thể tích 500 đến 1000 lít. Nhóm nghiên cứu thuộc các viện công nghệ sinh học và trường đại học cần hoàn thiện quy trình kiểm soát tự động nhiệt độ ở mức 35 đến 40 độ C, pH ổn định 7,0 đến 7,5 trong khung thời gian 12 tháng tới, hướng tới nâng cao năng suất sinh enzym ngoại bào thêm 25% so với quy mô phòng thí nghiệm.
2. Ứng dụng kỹ thuật cố định enzym kitinaza trên chất mang sinh học xốp (như alginate hoặc than hoạt tính) để tái sử dụng dịch xúc tác nhiều chu kỳ. Mục tiêu trong giai đoạn 2026-2027 là đạt hiệu suất thu hồi enzym trên 85% sau 5 lần tái sử dụng, giúp giảm 50% chi phí hóa chất trong quy trình sản xuất oligomer glucosamine.
3. Phát triển công thức chế phẩm sinh học dạng bột khô hoặc dịch lỏng chứa bào tử vi khuẩn HD1 và HD5 kết hợp hệ đệm dinh dưỡng để đối kháng nấm bệnh cây trồng. Doanh nghiệp sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học cần phối hợp đăng ký thử nghiệm đồng ruộng trong vòng 18 tháng, đặt mục tiêu giảm thiểu ít nhất 40% lượng thuốc trừ nấm hóa học trên cây ăn quả và rau màu.
4. Xây dựng mô hình tuần hoàn xử lý phụ phẩm vỏ tôm cua tại chỗ cho các hợp tác xã và nhà máy chế biến thủy sản ven biển. Chính quyền địa phương và các doanh nghiệp chế biến thủy sản cần triển khai lắp đặt hệ thống ủ sinh học sử dụng chủng HD1 với công suất xử lý 5 đến 10 tấn phế liệu mỗi ngày trước năm 2028, giải quyết triệt để tình trạng ô nhiễm nước thải và không khí.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng cao cho bốn nhóm độc giả chính:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học thực nghiệm và Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình chi tiết từ khâu làm giàu đất, phân lập thuần khiết, xác định số lượng tế bào CFU đến phương pháp định tính và định lượng hoạt tính enzym bằng kỹ thuật đục lỗ thạch và khuếch tán đĩa.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các trường đại học: Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị phục vụ thiết kế bài giảng chuyên đề Enzym học ứng dụng, Công nghệ lên men vi sinh vật và Quản lý phụ phẩm nông - thủy sản.
• Kỹ sư nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các doanh nghiệp sinh học nông nghiệp: Cung cấp số liệu tin cậy về điều kiện pH, nhiệt độ tối ưu và khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng để xây dựng công thức chế phẩm sinh học thương mại.
• Cán bộ quản lý môi trường và doanh nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu: Tham khảo giải pháp sinh học thay thế phương pháp hóa học truyền thống trong xử lý vỏ tôm cua, hướng tới phát triển mô hình kinh tế tuần hoàn và đạt các chứng chỉ xanh trong chế biến xuất khẩu.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao phương pháp làm giàu đất bằng vỏ tôm lại tăng hiệu suất phân lập vi khuẩn sinh kitinaza?

Phương pháp vùi ủ vỏ tôm cua trong 30 ngày tạo ra môi trường chọn lọc tự nhiên với nguồn carbon và nitơ duy nhất là kitin. Điều này kích thích các loài vi khuẩn có khả năng tiết enzym ngoại bào tăng sinh nhanh chóng, giúp nâng tỷ lệ chủng có hoạt tính từ 22,58% ở đất thường lên 31,43% ở đất làm giàu và tăng mật độ khuẩn lạc lên gấp 2,4 lần.

Khác biệt cơ bản giữa việc thử nghiệm enzym trên kitin tinh sạch và kitin thô là gì?

Kitin tinh sạch đã được loại bỏ hoàn toàn protein và khoáng chất canxi cacbonat nên enzym dễ dàng tiếp xúc trực tiếp liên kết beta-1,4-glicozit, cho đường kính vòng phân giải lớn hơn từ 4 đến 6 mm. Tuy nhiên, kitin thô tự chế từ vỏ tôm ngâm axit clohiđric 5% có giá thành rẻ hơn hàng chục lần nhưng vẫn phản ánh chính xác các ngưỡng nhiệt độ và pH tối ưu của vi khuẩn.

Enzym kitinaza của chủng HD1 và HD5 có ưu điểm nhiệt độ ra sao khi ứng dụng thực tế?

Chủng HD1 đạt hoạt tính cao nhất ở 40 độ C và chủng HD5 ở 35 độ C, đồng thời cả hai duy trì hoạt tính ổn định trong khoảng 25 đến 50 độ C. Dải nhiệt độ này hoàn toàn trùng khớp với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa tại Việt Nam, cho phép vận hành hệ thống xử lý sinh học ngoài trời mà không tốn chi phí gia nhiệt phức tạp.

Cơ chế nào giúp dịch kitinaza thô có thể ức chế sự phát triển của nấm gây hại?

Thành tế bào của đa số các loài nấm sợi phytopathogen gây bệnh thực vật và nấm ký sinh côn trùng có cấu tạo cơ bản từ các lớp vi sợi kitin. Khi tiếp xúc với dịch nuôi cấy chứa enzym kitinaza của chủng HD1 và HD5, cấu trúc thành tế bào nấm bị thủy phân liên kết beta-1,4-glicozit, làm tan màng tế bào và tạo vòng kháng nấm có kích thước lên đến 28 mm.

Độ bền bảo quản ở 4 độ C trong 4 tuần mang lại lợi thế gì cho thương mại hóa chế phẩm?

Hoạt tính phân giải của dịch enzym thô chỉ suy giảm khoảng 8% sau 28 ngày lưu trữ ở 4 độ C (từ 24 mm xuống 22 mm ở chủng HD1). Tính ổn định sinh học cao này chứng minh enzym ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập có cấu trúc phân tử bền vững, rất thuận lợi cho việc đóng chai, vận chuyển và kéo dài hạn sử dụng của chế phẩm vi sinh thương mại.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công 11 chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh kitinaza từ đất làm giàu cơ chất tại Hải Dương, trong đó chọn lọc được 2 chủng ưu việt là HD1 và HD5 với đường kính phân giải đạt tới 31 mm và 29 mm.
• Xác định chính xác các thông số môi trường tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzym: môi trường số 1 bổ sung 0,7% pepton và 0,1% cao nấm men, nhiệt độ 35 đến 40 độ C, pH từ 7,0 đến 7,5 và nồng độ cơ chất bão hòa tại 15 phần nghìn.
• Chứng minh enzym kitinaza thô có độ bền sinh học cao sau 4 tuần bảo quản lạnh ở 4 độ C và sở hữu hoạt tính ức chế nấm gây hại mạnh mẽ với vòng kháng nấm đạt 25 đến 28 mm.
• Khẳng định tính khả thi của việc thay thế kitin tinh sạch nhập khẩu đắt tiền bằng bột kitin thô tự chế từ phế liệu vỏ tôm trong công tác sàng lọc vi sinh vật và định tính hoạt tính sinh học.
• Kế hoạch tiếp theo cần tập trung giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chính xác phân loại loài cho hai chủng HD1, HD5 và tiến hành thử nghiệm lên men quy mô pilot trong vòng 12 đến 24 tháng tới. Hãy liên hệ với các đơn vị chuyển giao công nghệ sinh học ngay hôm nay để cùng hợp tác phát triển các dòng chế phẩm vi sinh xử lý rác thải thủy sản và bảo vệ mùa màng bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lƣợng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay ngƣời ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và đƣợc ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nhƣ hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền và có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp. Nhiều enzym đƣợc khai thác từ vi sinh vật đƣợc tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thời gian qua nhƣ proteaza, amylaza, cellulaza,….

Những năm sau này ngƣời ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzym khác đó là kitinaza, đây là enzym thủy phân kitin. Kitinaza rất phổ biến trong cuộc sống và đƣợc tìm thấy ở các loài bao gồm vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Kitinaza phân huỷ kitin, đó là polysaccarit dồi dào thứ hai trong tự nhiên sau khi xenlulôzơ. Do đó, kitinaza rất quan trọng để duy trì một sự cân bằng giữa cacbon và nitơ bị mắc kẹt trong kitin, dạng không hòa tan.

Vì vậy, kitinaza là công nghệ sinh học lớn đang rất đƣợc giới khoa học quan tâm bởi các lý do: thứ nhất, các enzym này có thể đƣợc sử dụng để chuyển đổi phế liệu giàu kitin thành các sản phẩm hữu ích; thứ hai, có thể khai thác kitinaza dùng cho sự kiểm soát của mầm bệnh nấm và côn trùng; thứ ba, kitinaza chất ức chế khả năng tăng trƣởng có chứa kitin (thực vật) mầm bệnh và côn trùng bệnh dịch hạch cần kitinaza cho sự phát triển bình thƣờng. [12, 19] Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những nƣớc có điều kiện thiên nhiên ƣu đãi đặc biệt cho ngành nuôi trồng thuỷ sản. Trong những năm qua đã có những Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học phát triển vƣợt bậc và song song với sự phát triển đó, hàng năm các nhà máy chế biến thuỷ sản của nƣớc ta thải ra một lƣợng phế liệu giàu kitin khá lớn. Nguồn phế liệu thuỷ sản này một phần đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc số còn lại chỉ một phần nhỏ sử dụng để sản xuất kitin còn chủ yếu thải ra gây ô nhiễm môi trƣờng.

Vì vậy nghiên cứu công nghệ tạo ra các sản phẩm hữu ích từ nguồn phế liệu này là một vấn đề không chỉ có ý nghĩa lí luận mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất thiết thực. Tuy nhiên việc ứng dụng kitin và kitinaza cho sản xuất các sản phẩm có ý nghĩa là một việc không mấy dễ dàng. Dù kitin đƣợc sản xuất hàng năm với con số lớn nhƣng khó tinh chế bởi sự có mặt của prôtêin và CaCO3. Thêm vào đó trong quá trình xử lý cần trung hoà bằng bazơ hoặc axit, quá trình tẩy rửa gây ô nhiễm môi trƣờng nƣớc.

Vì vậy sử dụng quá trình sinh học để tách chiết kitin là điều hết sức cần thiết [40]. Thêm vào đó vi sinh vật phân giải kitin thì có nhiều nhƣng việc phân lập và xác định hoạt tính kitinaza của chúng còn nhiều khó khăn đặc biệt là việc xác định các điều kiện tối ƣu. Trong quá trình xác định hoạt tính có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng, đồng thời khoảng giới hạn hoạt động của các yếu tố ảnh hƣởng đó thƣờng lớn và thay đổi ở mỗi loài vi sinh vật. Với ý nghĩa thực tiễn đó tôi thực hiện đề tài “ Phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym” nhằm góp phần cung cấp thêm vào bảo tàng giống một số chủng vi khuẩn có hoạt tính kitinaza cao, nghiên cứu một số đặc tính của chúng để có thể ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tạo ra các chế phẩm vi sinh có hiệu quả cao mang lại lợi ích cho con ngƣời.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ KITIN 1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên Kitin là một polysaccarit tồn tại trong tự nhiên với sản lƣợng rất lớn (đứng thứ 2 sau xenlulôzơ). Kitin rất phổ biến trong tự nhiên và nó đƣợc tìm thấy nhƣ một vật liệu cấu trúc của các loài sinh vật sống hiện nay [41]. Ở một số động vật nguyên sinh có tiêm mao, roi và amip kitin cấu tạo nên vỏ bào xác. Một số tảo (nhƣ tảo silic, tảo cát) và nấm (nhƣ Candida albicans, Neurospora crassa,…) kitin là thành phần chính của thành tế bào.

Động vật không xƣơng sống nhƣ giun tròn, chân đốt, thân mềm và côn trùng,…kitin là thành phần chủ yếu của bộ xƣơng ngoài. Trong động vật bậc cao monome của kitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và găn liền các vết thƣơng ở da. [29, 44] Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lƣợng kitin khá cao. Vì vậy, vỏ tôm, cua, ghẹ thƣờng là nguyên liệu chính để sản xuất kitin.

Kitin có khối lƣợng phân tử lớn, cấu trúc phức tạp, là tập hợp các monosaccarit ( N-acetyl- β-D-glucôzamine) liên kết với nhau bởi cầu nối glucôzit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa, rất hiếm khi kitin tồn tại ở trạng thái tự do và hầu nhƣ luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị với các prôtêin, CaCO3 và các hợp chất phản ứng khác.[29, 44] Về mặt lịch sử, kitin dƣợc Henry Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Năm 1823 Galier phân lập đƣợc một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là kitin. Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học 1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.

Cấu trúc của kitin. Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc ngƣời ta thấy kitin là một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin đƣợc tạo lên bởi mối liên kết β (1-4) glicozit với công thức tổng quát (C8H15O5N)n. Các chuỗi kitin riêng rẽ có thể dạng xoắn vì mỗi phân tử đƣờng bị đảo ngƣợc so với những phân tử đƣờng cạnh, dẫn đến sự ổn định về cấu trúc của chúng. Chính sự khác biệt này đã tăng cƣờng liên kết hiđrô giữa polyme liền kề, do đó tăng độ bền trong ma trận kitin.

Cấu trúc hoá học kitin đƣợc thể hiện qua hình 1. Cấu trúc hoá học của kitin Bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X ngƣời ta đã chứng minh đƣợc kitin có ba dạng cấu trúc dị hình là α, β và γ- kitin trong đó dạng phổ biến nhất là α - kitin. Các dạng này của kitin do sự sắp xếp khác nhau về hƣớng của mỗi mắt xích (N- acetyl- Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học D glucozamin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm (- CH2OH), phần đuôi mũi tên chỉ nhóm ( - NHCOCH3), thì các cấu trúc α, β và γ kitin đƣợc mô tả nhƣ sau.[13, 28, 36, 45] Dạng α- kitin Dạng β- kitin Dạng γ- kitin Dạng α- kitin đƣợc tìm thấy trong khoang của thuỷ tức,bộ xƣơng ngoài của động vật chân đốt, vỏ giun tròn, răng bào của động vật thân mềm.

Do cách sắp xếp nhƣ vậy, ngoài có liên kết hiđrô trong mỗi lớp còn có liên kết hiđrô giữa các lớp, sự sắp xếp theo nguyên tắc đối song song đó đã tạo ra tấm kitin rất bền vững. Dạng β- kitin tìm thấy trong tảo silic, bộ xƣơng ngoài côn trùng, kén và là thành phần chính của thành tế bào nấm, vỏ động vật thân mềm và một số động vật chân đốt. Dạng γ- kitin là hỗn hợp của hai dạng α và β- kitin có trong dạ dày của mực ống, hai dạng β và γ- kitin sắp xếp chiều các monome khác biệt so với dạng α- kitin nhƣ miêu tả trên dẫn đến là dạng kém bền và dễ thoái hoá.2 Đặc tính của kitin.[29] Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, không mùi, không vị, không tan trong nƣớc, trong môi trƣờng kiềm, axít loãng và các dung môi hữu cơ nhƣ rƣợu, ete,…nhƣng tan trong một số dung dịch kiềm đặc nóng. Kitin ổn định với chất ôxi hoá mạnh nhƣ thuốc tím( KMnO4) ôxi già (H2O2), nƣớc ja ven,…lợi dụng tính chất này ngƣời ta sử dụng các chất oxi hoá trên để khử màu cho kitin.

Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40-50%) ở nhiệt độ cao kitin bị mất gốc acetyl và trở thành kitosan hoặc trong dung dịch HCl đậm đặc kitin bị cắt mạch thu đƣợc glucozamin. Kitin dễ dàng bị phân huỷ bằng việc phân cắt liên kết glicôzit dƣới tác dụng của kitinaza đƣợc tiết ra bởi một số vi sinh vật, thực vật và động vật. [7, 16, 2014] Kitin Kitinaza Kitin Deacetylaza (GlcNAc)2 Kitosan N- Acetyl Glucozamindaza kitosanaza GlcNAc (GlcN)2 Deacetylaza Glucozamindaza GlcN Hình 2: Con đƣờng phân giải kitin Học viên: Phạm Thị Xoè – CN: Vi sinh vật học 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học 1.3 Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin Xuất khẩu thuỷ sản đã và đang là ngành kinh tế thu đƣợc lợi nhuận cao không chỉ cho nền kinh tế nƣớc ta mà còn cho nền kinh tế thế giới. Tuy nhiên, một thực trạng đáng báo động hiện nay là song song với sự gia tăng kinh tế thì vấn đề ô nhiễm môi trƣờng do chất thải rắn (vỏ tôm, cua, ghẹ…) của các nhà máy chế biến thuỷ sản xuất khẩu thải ra môi trƣờng cũng tăng lên đáng kể.

Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lƣợng tôm năm 2003 là 193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lƣợng nguyên liệu. Tƣơng ứng với sản lƣợng tôm hàng năm sẽ có khối lƣợng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm đƣợc tạo ra.