ĐẶT VẤN ĐỀ Nước mắm từ lâu đã là gia vị đặc trưng không thể thiếu trong các bữa ăn của người Việt Nam cũng như hầu hết các nước Đông Nam Á. Khoảng 86% hàm lượng nitơ tổng số là các nitơ hữu cơ và 49% là nitơ của các amino acid tự do. Hàm lượng các amino acid đạt khoảng 4g/l với sự có mặt gần như đầy đủ của các amino acid thiết yếu như valin, leucine, isoleucine, lysine, threonine, không phải amino acid thiết yếu, methionine, phenylalanine, tryptophane,… (Lopetcharat et al. Những năm gần đây một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy nước mắm đến từ châu Á chứa hàm lượng histamine cao.
Mức histamine cao trong thực phẩm nó gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kì (FDA) đã cho thấy hàm lượng 50 ppm là mức gây ngộ độc và 500ppm là mức gây nguy hiểm đến sức khỏe của người sử dụng của các sản phẩm chứa histamine (Lehane and Olley, 2000). Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn phân giải histamine là một phương pháp hữu hiệu trong việc giảm lượng histamine trong thực phẩm lên men. Một số nghiên cứu mới đây đã phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine trong các sản phẩm lên men từ cá cũng như trong nước mắm như: Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus, Bacillus amyloliquefaciens, Arthrobacter crystallopoietes, và Brevibacterium linens,… (Zaman et al., 2010, 2011; Lee et al., 2016; Tapingkae et al.
Trong nghiên cứu của Lee et al. (2015, 2016), chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine là Bacillus polymyxa D05-1 được phân lập từ cá mòi muối (salted sardine) hàm lượng histamine trong sản phẩm giảm 34% so với mẫu đối chứng. Nghiên cứu của Zaman et al. (2010) đã chỉ ra Staphylococcus carnosus phân lập từ nước mắm có khả năng phân giải được 29,1% histamine so với lượng ban đầu.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu về vi khuẩn phân giải histamine và tối ưu điều kiện nuôi cấy của chúng. Nghiên cứu của Lee et al. (2012) cho thấy Virgibacillus campisalis sp điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn này ở pH 7,5-8; nhiệt độ ở 37ºC và nồng độ muối từ 4-5%. Theo nghiên cứu của Lee et al.
(2015, 2016), chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine là Bacillus polymyxa 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com D05-1 và điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu sinh khối là 24h, nhiệt độ 25-37ºC, pH 7-9 và nồng độ NaCl 0,5-5%. Sinh khối này sẽ được bổ sung trực tiếp vào cá trước khi lên men. Tuy nhiên ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở một số nghiên cứu về khả năng sinh histamine của vi khuẩn (Dang Thao Yen Linh et al., 2018) cũng có nghiên cứu về phân lập tuyển chọn những vi khuẩn có khả năng sinh histamine được phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm ở Cát Hải; cũng như nhóm nghiên cứu của Đại học Nha Trang đã nghiên cứu xác định khả năng sinh histamine của một số vi khuẩn phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm truyền thống) tuy nhiên nghiên cứu về khả năng phân giải histamine từ vi khuẩn còn nhiều hạn chế. Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh để giảm hàm lượng histamine trong nước mắm truyền thống” với Bộ Công Thương nhóm nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được 28 chủng vi khuẩn chịu mặn từ chượp mắm ở Hải Phòng và Nam Định.
Để tìm ra các chủng có khả năng phân giải histamine và tiến hành tối ưu hóa điều kiện tăng sinh khối, nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh vật bước đầu ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm. Chính vì vậy nghiên cứu này đã tiến hành “Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả năng phân giải histamine phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm và tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối”. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1. Mục đích Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả năng phân giải histamine phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm và tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối.
Yêu cầu - Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine từ các chủng vi khuẩn chịu mặn đã được phân lập từ chượp mắm tại Hải Phòng và Nam Định; - Định danh chủng vi khuẩn phân giải histamine cao đã tuyển chọn bằng sinh học phân tử; - Ảnh hưởng của điều kiện đơn yếu tố và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn: 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Ảnh hưởng điều kiện đơn yếu tố (pH, nhiệt độ, nồng độ muối) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn; + Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về nước mắm Nước mắm theo cách hiểu thông thường là chất nước rỉ từ cá, tôm và một số động vật nước khác được ướp muối lâu ngày, nó được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực của các quốc gia Đông Nam Á như Việt Nam và Thái Lan để làm nước chấm hoặc gia vị chế biến các món ăn.
Trên phương diện khoa học, nước mắm là hỗn hợp muối với các amino acid được tạo ra từ quá trình thủy phân protein trong thịt cá nhờ tác dụng các hệ enzyme có sẵn trong ruột cá cùng với một số loại vi khuẩn kỵ khí chịu mặn. Nước mắm là mặt hàng chính của ngành đánh bắt thủy sản nước ta, tiêu thụ 40-60% tổng số cá đánh bắt được, và được sản xuất trên cả nước. Với lợi thế có đường bờ biển dài, được thiên nhiên ưu đãi hiện nay nước ta có khoảng 600 nhà máy chế biến nước mắm phân bố trong cả nước, với nhiều thương hiệu nổi tiếng như nước mắm Phú Quốc, Phan Thiết, Khánh Hòa, Cát Hải, Ninh Cơ,… (Lương Đức Phẩm, 2012). Trong đó, nguồn nguyên liệu cũng như phương pháp sản xuất ở mỗi vùng miền có những đặc điểm, công thức riêng tạo ra sản phẩm có hương vị đặc trưng cho mỗi nơi.
Quy trình sản xuất 2. Nguyên liệu sản xuất nước mắm Nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm là cá và muối. Cá Nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm được người dân lựa chọn là cá nục, cá nhâm, cá lâm, rồi cá quẩn, cá trích,… Cá là nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước mắm, do vậy chất lượng của cá sẽ quyết định chất lượng của nước mắm. Nước mắm chủ yếu được sản xuất từ các loại cá biển nhỏ và có giá trị kinh tế thấp.
Ở mỗi nơi, tuỳ thuộc vào điều kiện tự nhiên mà cá nguyên liệu đánh bắt được để sản xuất nước mắm là khác nhau vì vậy mà mỗi vùng miền mang một hương vị nước mắm riêng. - Thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm: nước, lipid, protein, glucid, muối vô cơ, vitamin. Thành phần hóa học của từng loại cá là khác nhau, tùy thuộc vào 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com giống, loài, trạng thái sinh lí, giới tính, mùa vụ, thời tiết,… Sự khác nhau về thành phần hóa học, độ tươi của nguyên liệu và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). - Cá được phân ra làm ba loại: + Cá gầy (lipid <1%) như cá cơm, cá tuyết,.
+ Cá béo vừa (lipid <10%) như cá mập, cá nhồng,. + Cá béo (lipid >10%) như cá hồi, cá trích,. Và loại cá được sử dụng thích hợp ở đây là cá nhỏ, gầy bởi chúng có hàm lượng lipid thấp. Cá nhỏ để đỡ tốn công nhân phải xử lí nguyên liệu trước khi sản xuất, đồng thời diện tích tiếp xúc của cá với muối cũng tăng thúc đẩy quá trình thuỷ phân diễn ra nhanh chóng.
- Cá được đưa và sản xuất chế biến thành nước mắm tuyệt đối không được sử dụng các loại cá có chứa chất độc như cá nóc chứa độc tố tetrodotoxin không bị phân huỷ trong quá trình lên men. - Không sử dụng nhưng loại cá ươn, cá ôi thiu vì trong các loại cá này có hàm lượng histamine cao và các loại cá có chứa tỉ lệ cơ thịt đỏ như: cá ngừ, cá thu,. vì trong phần cơ thịt đỏ có nhiều histidin dễ dàng chuyển hoá tạo thành Histamine gây ngộ độc cho con người vì thịt cá có độ bền cơ học kém vi sinh vật rất dễ phát triển. - Sau khi đánh bắt cần bảo quả một cách hợp lí ở nhiệt độ thấp và đưa đi chế biến, sản xuất trong càng sớm càng tốt để hạn chế sự chuyển hoá từ histidin thành histamine.
Muối Cũng giống như cá, muối là nguyên liệu thứ hai không thể thiếu trong quá trình lên men nước mắm. Dùng muối ăn để ướp muối cá là một phương thức bảo quản hiệu quả. Là phương pháp chế biến và bảo quả dễ dàng, rẻ tiền, nhanh chóng giải quyết kịp thời một khối lượng nguyên liệu lớn. Tác dụng của muối ăn trong sản xuất nước mắm (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990): + Bảo quản nguyên liệu, kéo dài thời gian sử dụng; 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Có tác dụng phòng thối khi bảo quản các sản phẩm thuỷ sản bằng cách ướp muối; + Muối ăn thẩm thấu vào nguyên liệu làm cho nước thoát ra, vi khuẩn thiếu nước không thể phát triển được như vậy chượp cá không bị hỏng, bị thối; + Thúc đẩy quá trình thuỷ phân diễn ra nhanh hơn trong sản xuất nước mắm; + Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế, làm giảm hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài.
Vì vậy, để chế biến chượp nhanh cần xác định lượng muối cho vào trong chượp là bao nhiêu và lượng muối này vừa đủ ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối, vừa tránh kìm hãm hoạt động của enzyme. Thông thường ở nước ta, lượng muối ăn tinh khiết cho vào khoảng 20-25% so với khối lượng cá. Các phương pháp chế biến chượp Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990) thì có 3 phương pháp chế biến chượp cổ truyền: Phương pháp đánh khuấy: -Trộn cá và muối: Cá được trộn với muối lần đầu tiên theo tỉ lệ 10-15% muối trên tổng khối lượng cá. Hỗn hợp cá trộn với muối được gọi là chượp.
-Bổ sung nước và muối + Sau khi trộn muối với cá được 2 – 3 ngày thì đổ thêm nước lã sạch theo tỷ lệ 25 - 30% so với khối lượng cá ban đầu, dùng cào gỗ đánh đảo cho thật kĩ làm cho muối đều và tan hết.