Đặt vấn đề -Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa saccharide, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside galactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậc hai. Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật, động vật và người. Trong đó, -galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao. -Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa.
Với 75% dân số trên thế giới thiếu hụt enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là một ứng dụng quan trọng của -galactosidase trong ngành công nghiệp này. Ngoài ra - galactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh của lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm. Đặc biệt gần đây, - galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng là tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trong quá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide. GOS được sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn hữu ích đã hiện diện trong đường ruột.
Để đáp ứng nhu cầu trong ngành công nghiệp này, -galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khai thác. Trong số này -galactosidase từ B. subtilis cũng rất được chú ý bởi khả năng hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40C rất thích hợp cho ứng dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác từ sữa. Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực khác và B.
subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. 2 Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứng dụng, ngoài việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzyme mới có hiệu suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của công nghệ DNA cũng cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biến protein/enzyme để nâng cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme. Phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng với việc lựa chọn di truyền và phương pháp sàng lọc nhanh, là những công cụ mạnh để phát triển enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm định hướng”.
Mục đích nghiên cứu - Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của -galactosidase (LacA) từ B. subtilis VTCC-DVN-12-01. - Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu. Nội dung nghiên cứu - Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa -galactosidase từ B.
subtilis VTCC DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA (error prone rolling circle amplification, sao chép lỗi DNA vòng) và sàng lọc các dòng mang gen lacA đột biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bền nhiệt độ so với LacA ban đầu. - Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh trình tự axit amin với các -galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủy phân cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các LacA có các tính chất mới so với enzyme ban đầu. Những đóng góp mới của luận án (i) Xây dựng được thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa beta- galactosidase của B. subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA với tần suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb.
(ii) Xác định được 6 vị trí axit amin quyết định đến hoạt tính của LacA gồm Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 và His374. (iii) Xác định được một số thay đổi axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ bền LacA và một số thay đổi tại vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động của LacA. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen bằng phương pháp lỗi DNA vòng, đột biến điểm suy biến. Kết quả cũng cung cấp thông tin về vai trò quan trọng của một số axit amin của -galactosidase từ B.
subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng đến hoạt tính và tính chất của enzyme. Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được có thể áp dụng để cải biến các β-galactosidase khác trong cùng họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42 (Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thông tin chung về -galactosidase 1.1 Định nghĩa -Galactosidase (-D-galactohydrolase, E.23), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa saccharide trong họ các enzyme thủy phân, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside (CAZy, http://www. Ngoài ra, β-galactosidase còn được gọi là enzyme tiêu hóa lactose hay lactase có mặt trong ruột non ở hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose (Järvelä et al.2 Nguồn gốc và phân loại 1.1 Nguồn gốc -Galactosidase phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, thực vật, động vật và người.
Ở thực vật enzyme này có thể ở dạng hòa tan hoặc bám vào thành tế bào ở một số mô, chúng phân giải các cơ chất như glycoprotein, glycolipid, flavonoid và alkaloid. -Galactosidase đầu tiên ở thực vật được tìm thấy là ở những cây họ hoa hồng như mơ, đào, táo (Wallenfels and Malhotra, 1961). Gần đây, người ta cũng tìm thấy enzyme này ở một số hệ thực vật khác và các gen mã hóa tương tự nhau hoặc có độ tương đồng cao. Một số nghiên cứu về các quá trình sinh học đã cho thấy β- galactosidase tham gia vào sự sinh trưởng của tế bào (Dopico et al., 1990; Gomez et al., 1995), quá trình chín của quả (Ali et al., 1995; Carey et al., 1995) và huy động khả năng dự trữ, nảy mầm của hạt (Buckeridge and Reid, 1994; Alcântara et al., 1999; Kim et al.
Chúng cũng liên quan đến việc giải phóng năng lượng dự trữ trong quá trình sinh trưởng nhanh, giải phóng galactose tự do trong chu trình chuyển hóa bình thường của galactolipid, glycoprotein và trong việc tạo thành của tế bào (Smith and Gross, 2000). 5 Ở động vật, người ta tìm thấy β-galactosidase ở ruột cá rô phi (Taniguchi and Takano, 2004), ở động vật có vú như dê (Gaur et al., 2000) và người. Chúng có nhiều ở thành ruột non của hầu hết động vật có vú và người, đặc biệt là ở trẻ em hàm lượng enzyme cao hơn vì chức năng chính là phân giải lactose. Ở vi sinh vật, β-galactosidase được tìm thấy ở nấm men, nấm mốc và vi khuẩn.
Nguồn enzyme từ vi khuẩn có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao. Một lượng lớn các loài vi sinh vật đã được biết đến như một nguồn cung cấp β-galactosidase thương mại tiềm năng (Bảng 1.1) (Panesar et al. β-Galactosidase có thể được tổng hợp ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau, nhưng trong đó Streptococcus thermophilus và Bacillus stearothermophilus được coi như nguồn enzyme tiềm năng. Ở nấm mốc β-galactosidase thường hoạt động tối ưu trong khoảng pH từ 2,5 đến 5,4.
Do đó, chúng rất thích hợp cho công nghệ sản xuất các sản phẩm sữa lên men. Nhiệt độ tối ưu cho các enzyme này rất cao và có thể được ứng dụng trong điều kiện sản xuất ở nhiệt độ lên tới 50C. Một số nguồn enzyme từ nấm mốc như Asperilus niger và Asperilus oryae đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. Đặc biệt enzyme từ Crytococcuss laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển gốc galactosyl cao do vậy được ứng dụng để sản xuất galacto-oligosaccaride từ lactose (Panesar et al.
Nấm men được coi là một trong những nguồn tổng hơp -galactosidase quan trọng trong ngành công nghiệp. Với pH tối ưu trung tính, đây là điều kiện rất thích hợp cho quá trình thủy phân lactose trong sữa và được chấp nhận rộng rãi vì tính an toàn khi sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất -galactosidase từ các chủng nấm men khác nhau được thực hiện vì tiềm năng ứng dụng cao của nó. Các sản phẩm thương mại -galactosidase từ nguồn nấm men như Maxilact (Hà Lan), Lactase (Ý) được tách chiết từ Kluyveromyces lactis và Lactozym (Đan Mạch) từ Kluyveromyces fragilis (Roy and Gupta, 2003).
Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật Nguồn: (Panesar et al., 2010) Nguồn Vi sinh vật Alicyclobacillus acidocaldarius, Arthrobacter sp. stearothermophilus Bacteriodes polypragmatus Bifidobacterium bifidum, B. infantis Clostridium acetobutylicum, C. thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E.
cloaceae, Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus, L. helviticus, Vi khuẩn L. themophilus, Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, P. pento Propioionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, S.
thermophius Sulfolobus solfatarius Thermoanaerobacter sp. aquaticus Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris Alternaria alternate, A. palmi Aspergillus foelidis, A. oryzae Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis Fusarium monilliforme, F.
oxysporum Nấm mốc Mucor meihei, M. pusillus Neurospora crassa Penicillum canescens, P. expansum Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp. Streptomyces violaceus Bullera singularis Candida pseudotropicalis Nấm men Saccharomyces anamensis, S.
fragilis Kluyveromyces bulgaricus, K.2 Phân loại Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - NC-IUBMB), enzyme được phân lớp (EC – Enzyme Classification) dựa vào phản ứng hóa học và đặc hiệu cơ chất của enzyme. Theo tiêu chí này, β-galactosidase thuộc phân lớp EC 3.23: - Lớp: enzyme thủy phân (3), - Phân lớp: glycosylase (2), - Dưới phân lớp: glycosidase - hydrolysing O-glycosyl (1), - Enzyme: -glycoside (23). Tuy nhiên, hệ thống EC không sử dụng cấu trúc hoặc thông tin tiến hóa và ít sử dụng cho phân loại enzyme khi cơ chất phù hợp chưa biết. Do đó Henrissat đã đưa ra một hệ thống phân loại dựa vào trình tự axit amin, tính kỵ nước và cơ chế phản ứng (Henrissat, 1991).
Theo tiêu chí này, β-galactosidase hiện nay được chia thành 4 họ thủy phân glycoside (GHF, Glycoside Hydrolase Family) là 1, 2, 35 và 42 dựa vào sự tương đồng về chức năng.