Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực, phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển.

• Tác giả: Vũ Thị Bích Huyền
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Xuân Viết
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển từ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá
• 1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio
• 1.3. Hệ gen của vi khuẩn V. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin
• 1.4. Gen rpoB và tính kháng rifampicin
• 1.5. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
• 1.6. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển. Chẩn đoán và điều trị
• 1.7. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động
• 1.8. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá
• 1.9. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương
• 1.10. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá
• 1.11. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá
• 1.12. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý
• 1.13. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học
• 1.14. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen
• 1.15. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá
• 1.16. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.17. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Sơ đồ các bước thực hiện chính
• 2.4. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh
• 2.5. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn
• 2.6. Phương pháp nhuộm Gram
• 2.7. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
• 2.8. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn
• 2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn
• 2.10. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin
• 2.11. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
• 2.12. Nhóm phương pháp sinh học phân tử
• 2.13. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.14. Phương pháp tách DNA tổng số
• 2.15. Phương pháp PCR, giải trình tự gen
• 2.16. Phương pháp tin sinh
• 2.17. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam
• 2.18. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú
• 2.19. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận
• 3.2. Phân lập vi khuẩn Vibrio
• 3.3. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập
• 3.4. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử
• 3.5. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.6. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực
• 3.8. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin
• 3.9. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực
• 3.10. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng vi khuẩn dại
• 3.11. So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại
• 3.12. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực
• 3.13. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực
• 3.14. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực
• 3.15. Xác định tính an toàn của dòng L4650
• 3.16. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở cá mú
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vắc xin và bệnh hoại tử gan thận

Bệnh hoại tử gan thận ở cá biển do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản. Bệnh này không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế mà còn ảnh hưởng đến sự phát triển bền vững của ngành. Việc phát triển vắc xin phòng bệnh là một giải pháp khả thi nhằm giảm thiểu thiệt hại do bệnh dịch. Các loại vắc xin hiện có như vắc xin bất hoạt, nhược độc, và tái tổ hợp đều có những ưu nhược điểm riêng. Vắc xin nhược độc, sử dụng vi khuẩn giảm độc lực, đang được xem là hướng đi tiềm năng nhờ khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch lâu dài cho cá.

1.1. Tình hình nghiên cứu vắc xin cho cá

Nghiên cứu về vắc xin cho cá đã được thực hiện trên toàn thế giới, tuy nhiên, việc sản xuất vắc xin cho cá biển vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực có thể tạo ra một loại vắc xin hiệu quả. Việc phát triển vắc xin này không chỉ giúp bảo vệ cá khỏi bệnh hoại tử gan thận mà còn giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, từ đó hạn chế tình trạng kháng thuốc trong nuôi trồng thủy sản.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tạo ra chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực. Các phương pháp bao gồm phân lập vi khuẩn từ cá biển, xử lý vi khuẩn bằng kháng sinh rifampicin, và phân tích gen độc tố. Việc xác định các gen như toxR, tlh, và rpoB là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và khả năng gây đáp ứng miễn dịch của vi khuẩn. Kết quả từ các phương pháp này sẽ cung cấp cơ sở cho việc phát triển vắc xin nhược độc hiệu quả.

2.1. Phân lập và xác định chủng vi khuẩn

Quá trình phân lập vi khuẩn từ các mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận được thực hiện bằng các phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn sẽ được xác định bằng phương pháp sinh học phân tử như PCR. Việc xác định chính xác chủng vi khuẩn là rất quan trọng để đảm bảo rằng vắc xin phát triển sẽ có hiệu quả trong việc phòng bệnh cho các loài cá biển khác nhau.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch cho cá mú chấm cam. Các thử nghiệm cho thấy tỷ lệ sống sót của cá sau khi tiêm vắc xin nhược độc cao hơn so với nhóm chứng. Điều này chứng tỏ rằng việc phát triển vắc xin từ vi khuẩn giảm độc lực là một hướng đi khả thi và có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản.

3.1. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc xin

Khả năng bảo hộ của dòng vi khuẩn giảm độc lực được đánh giá thông qua tỷ lệ sống sót của cá sau khi tiêm vắc xin. Kết quả cho thấy rằng vắc xin nhược độc có thể bảo vệ cá khỏi bệnh hoại tử gan thận một cách hiệu quả. Điều này không chỉ mở ra triển vọng cho việc sản xuất vắc xin thương mại mà còn góp phần nâng cao sức khỏe và sản lượng cá nuôi trong ngành thủy sản.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thêm thông tin về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vắc xin phòng bệnh cho cá biển. Việc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực để sản xuất vắc xin có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh dịch gây ra, đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm thủy sản. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển bền vững ngành nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam.

4.1. Tính ứng dụng của nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc sản xuất vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển. Việc phát triển vắc xin này không chỉ giúp bảo vệ cá mà còn góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho ngành thủy sản. Hơn nữa, nghiên cứu cũng mở ra cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo về miễn dịch và phòng bệnh cho các loài cá khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá 1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều loài thủy sản bao gồm cả tôm, cá.

Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus thuộc [56]: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài: V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, dạng hình dấu phẩy, kích thước khoảng (0,5-0,8) x (1,4-2,4) µm, không sinh bào tử, có tiên mao, có khả năng di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn và có thời gian thế hệ là 8 - 9 phút [30]. parahaemolyticus thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng biển trên thế giới, phân lập được từ cát, bùn và nước biển, cũng như ở thủy sản bị bệnh [150].

Trên môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile- Salts-Sucrose), khuẩn lạc của V. parahaemolyticus có mầu xanh đậm, dạng tròn đều và bóng với kích thước từ 2 - 3 mm [101]. Vì thế, môi trường TCBS thường được dùng để chọn lọc các loài thuộc vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, sử dụng môi trường TCBS để chọn lọc vẫn không phân biệt được V.

parahaemolyticus với Vibrio vunlnificus và Vibrio mimicus [27]. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể được phân biệt với nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype). Kiểu huyết thanh O4:K48; O1:K6; O3:K6 được phát hiện phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là vi khuẩn có kiểu huyết thanh O3:K6 [101].

Đặc điểm sinh hóa là loại chỉ tiêu rất quan trọng để định danh một loài vi khuẩn cụ thể. parahaemolyticus có các đặc điểm hóa sinh đặc trưng như: có khả năng sinh enzyme catalase, sinh enzyme oxidase, khả năng sử dụng luan an 7 lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, không sinh H2S, sinh indole và có khả năng di động (Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus [14] Các phản ứng sinh hóa V.

parahaemolyticus Sinh catalase + Sinh oxidase + Phản ứng lên men yếm khí + Phản ứng lên men hiếu khí + Sinh beta – galactosidase - Agrinine - Lysine + Ornithine - Sử dụng citrate - Sinh H2S - Sinh urease - Sinh tryptophane - Sinh indole + Phản ứng Voges - Proskauer + Sinh gelatinase + Sử dụng đường Glucose + Manitol + Inositol - Sorbotol - Rhamnose - Sucrose - Melibiose - Amygdalin + Arabinose - Lactose - Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của vi khuẩn V. parahaemolyticus là phản ứng KP (Kanagawa phenomenon). Đây là phản ứng làm tan huyết dạng β (tan huyết hoàn toàn, xuất hiện vòng ly giải trong suốt quanh khuẩn lạc) cho kết quả dương tính KP do vi khuẩn sinh độc tố haemolysin phá hủy hồng cầu trên môi trường thạch máu [101]. parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể sinh trưởng ở điều kiện có hoặc không có O2 [53].

Sự phân bố của V. parahaemolyticus trong môi trường tự nhiên có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ của môi trường nước. Vi khuẩn này có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5℃- 43℃, tối ưu ở 37℃. Ở vùng nước có nhiệt độ trên 15℃, V.

parahaemolyticus xuất hiện quanh luan an 8 năm, mật độ vi khuẩn tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [163]. Độ pH cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sự vận động của V. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được đều phát triển được trên môi trường NB (Nutrient Broth) với pH từ 4,8 đến 11; tuy nhiên, ở môi trường pH 9,0 vi khuẩn V.

parahaemolyticus không sản xuất ra haemolysin, pH tối ưu là 7,8 - 8,6 [159]. Khả năng di động bằng tiên mao của vi khuẩn V. parahaemolyticus bị hạn chế trong môi trường có tính kiềm, nhưng khả năng này không bị ảnh hưởng trong môi trường trung tính và acid. Sự sinh trưởng của vi khuẩn này bị ức chế khi có mặt acid acetic 0,1%; pH 5,1 [49].

parahaemolyticus là vi khuẩn ưa môi trường kiềm mặn, sinh trưởng được ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10% và nồng độ NaCl 3% là tối ưu cho sự phát triển [30]; không mọc được môi trường thiếu muối (0%) hoặc nồng độ muối quá cao [14, 172]. Theo Broberg và cộng sự (2011), V. parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận tốc 60 μm/s trong môi trường độ mặn thích hợp và pH 8,0 [30]. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều động vật thủy sản: bệnh hoại tử gan thận ở cá, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm, bệnh trên động vật có vỏ (nghêu, trai, hàu) và gây bệnh viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) trên người khi bệnh nhân ăn hải sản chứa vi khuẩn chưa được nấu chín.

Trên mỗi vật chủ khác nhau vi khuẩn này sẽ có cơ chế gây bệnh và những triệu chứng đặc trưng [126]. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được xác định hoàn chỉnh [21, 68, 76] bao gồm 2 nhiễm sắc thể dạng vòng: Nhiễm sắc thể I có kích thước lớn khoảng 3,2 - 3,3 Mb, chứa hơn 3.000 gen; nhiễm sắc thể II có kích thước nhỏ hơn khoảng 1,7 - 1,8 Mb, chứa hơn 1.

Phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_14, Ahn và cộng sự (2016) đã ghi nhận 2 nhiễm sắc thể dạng vòng có kích thước 3.274 gen mã hóa protein, 160 gen RNA; 01 plasmid (51.383 bp) và 01 phage (96. luan an 9 Kim và cộng sự (2016) khi phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_08 đã báo cáo hệ gen với 02 nhiễm sắc thể dạng vòng nhưng không có plasmid.

Nhiễm sắc thể I có kích thước 3.909 ORFs, 115 gen tRNA, 28 gen rRNA.513 ORFs (86,39%) mã hóa protein chức năng và 539 ORFs mã hóa cho các protein chưa xác định được. Nhiễm sắc thể II có kích thước 1.036 bp chứa 1585 ORFs, 14 gen mã hóa tRNA và rRNA.245 ORFs mã hóa các protein chức năng và 340 ORFs mã hóa các protein giả định [68]. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin Độc tố tan huyết (haemolysin) là một trong những ngoại độc tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ.

Haemolysin có khả năng bám lên màng tế bào hồng cầu của vật chủ, gây thủng màng và giải phóng haemoglobin, kết quả là tạo ra hiện tượng tan huyết (β-haemolysin). Phân tử β- haemolysin có khả năng phân hủy sphingomyelin, một loại phospholipid màng tế bào hồng cầu của cừu. Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của haemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào đa nhân làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô. Hầu hết các vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm đều có khả năng gây hiện tượng tan huyết, trong khi chỉ 1 - 5% các chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường là có khả năng gây hiện tượng tan huyết [63].

Do vậy, haemolysin được coi là một trong những độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để nhận biết các chủng độc hại. parahaemolyticus có thể sản sinh 3 loại protein haemolysin: TDH bền nhiệt (thermostable direct haemolysin), TRH (TDH-related haemolysin) và TLH không bền nhiệt (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen lần lượt tương ứng là tdh, trh và tlh [149]. Gen tdh và trh tham gia vào quá trình gây độc của vi khuẩn V. Haemolysin TDH tồn tại dạng bốn cấu tử (tetramer) trong dung dịch và có hoạt tính tan huyết cao.

Dạng tetramer của luan an 10 TDH có một lỗ trung tâm với đường kính là 23 Å và sâu 50 Å [169]. Gen trh mã hóa cho TRH không bền nhiệt, loại haemolysin này dễ dàng bị biến tính ở điều kiện nhiệt độ 60℃ trong thời gian 10 phút. Các gen độc tố này được phát hiện trong hệ gen của V. parahaemolyticus bằng kĩ thuật PCR.

Tuy nhiên, sản phẩm PCR khuếch đại gen tdh, trh đã được công bố cho đến nay là không thống nhất, tùy thuộc cặp mồi đã được thiết kế và sử dụng. Cụ thể: sản phẩm PCR khuếch đại từ gen tdh có kích thước 223 bp [45]; 247 - 251 bp [50, 96, 99]; 269 bp [134]; 460 bp [141] và 668 bp [171]. Tương tự, sản phẩm PCR khuếch đại từ gen trh cũng có kích thước rất khác nhau: 250 bp [24]; 354 bp [50]; 500 bp [33] và 623 bp [141]. Paria và cộng sự (2019) dựa trên các trình tự ở hệ gen của các chủng V.

parahaemolyticus khác nhau đã công bố xác định được kích thước 189 amino acid tương ứng với kích thước gen trh hoàn chỉnh là 570 nucleotide, đồng thời xây dựng được cấu trúc không gian của phân tử protein TRH [118]. Các kết quả công bố cũng đã chỉ ra rằng, không phải bất cứ chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus nào cũng đều mang gen tdh, trh. Theo Nishibuchi và cộng sự (1995), chỉ có 1 - 5% các chủng V.

parahaemolyticus mang các gen này [111]. Tương tự, Rojas và cộng sự (2011) cũng nhận định trong các mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên con trai và con hàu chỉ có 10,5% mẫu được phát hiện có gen tdh và không được phát hiện thấy gen trh [134]. parahaemolyticus phân lập từ hàu, Deepanjali và cộng sự (2005) báo cáo chỉ có 3/49 (chiếm 6,1%) phát hiện có gen tdh [43].

Xie và cộng sự (2005) phân lập được 7 chủng V. parahaemolyticus từ tôm, cá mắc bệnh và nước biển thuộc đầm nuôi thủy sản tại Quảng Tây (Trung Quốc). Bẩy chủng vi khuẩn phân lập này cùng 01 chủng V. parahaemolyticus VPL4-90 được cung cấp từ viện Vi sinh học Quảng Đông (Trung Quốc) đều không phát hiện được sự có mặt của hai gen độc tố tdh và trh [166].

Gen tdh cũng không được phát hiện trong 23 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus do Chakraborty và cộng sự (2008) phân lập được từ mẫu cá da trơn, động vật thân mềm dạng chân đầu (cephalopod), động vật có vỏ. Chỉ duy nhất 01 mẫu trong số đó là có chứa gen trh [33]. Trong 39 mẫu vi khuẩn V.

luan an 11 parahaemolyticus phân lập từ cá tại vùng Chengicherla, Hyderabad (Ấn Độ), chỉ có 5,7% và 26,6% chứa tương ứng lần lượt gen tdh và trh [109]. Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012) báo cáo sự vắng mặt của hai gen độc tố trh và tdh trong hệ gen của 05 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên thủy sản ở Nha Trang [3]. Gen tlh mã hóa haemolysin TLH có trình tự amino acid bảo thủ đặc trưng cho Vibrionaceae.

Sản phẩm PCR khuếch đại gen này có kích thước 450 bp [70, 170], hoặc 113 bp [52]. Phân tích trình tự genome của V.