Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật MLPA Xác Định Đột Biến U Nguyên Bào Thận

• Tác giả: Đỗ Thị Ngọc Thùy
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Chí Bảo
• Trường học: Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật MLPA Trong Xác Định Đột Biến U Nguyên Bào Thận
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT - ANH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. U nguyên bào thận
• 1.1.1. Đại cương
• 1.2. Gen và sinh học phân tử
• 1.3. Đặc điểm giải phẫu bệnh của u nguyên bào thận
• 1.4. Phân loại u nguyên bào thận
• 1.5. Điều trị u nguyên bào thận
• 1.6. Kỹ thuật MLPA
• 1.6.1. Nguyên tắc của kỹ thuật MLPA
• 1.6.2. Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại đoạn dò trên mẫu mô vùi nến u nguyên bào thận
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.3. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.4.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.4.3. Quy trình nghiên cứu
• 2.4.4. Các quy trình kỹ thuật
• 2.5. Dụng cụ, thiết bị
• 2.6. Hóa chất nghiên cứu
• 2.7. Thu thập số liệu
• 2.7.1. Kiểm soát sai lệch
• 2.7.2. Kiểm soát sai lệch chọn lựa
• 2.7.3. Kiểm soát sai lệch thông tin
• 2.8. Kiểm soát chất lượng trong kỹ thuật MLPA
• 2.9. Phương pháp quản lý và phân tích số liệu
• 2.10. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.10.1. Thời gian nghiên cứu
• 2.10.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.11. Xử lý số liệu
• 2.12. Đạo đức nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.1.1. Đặc điểm về tuổi
• 3.1.2. Đặc điểm về giới tính của bệnh nhân
• 3.1.3. Đặc điểm phân bố vị trí khối u
• 3.2. Phân loại u theo giai đoạn bệnh dựa trên tổn thương mô học
• 3.3. Đặc điểm mô học
• 3.4. Kết quả thực hiện phản ứng MLPA
• 3.4.1. Kết quả chiết tách DNA
• 3.4.2. Kết quả thực hiện MLPA
• 3.4.3. Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p và/hoặc 16p
• 3.4.4. Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p
• 3.4.5. Tỷ lệ mất đoạn exon tại 16p
• 3.4.6. Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p và 16q
• 3.4.7. Tỷ lệ tăng đoạn exon tại 1q
• 3.4.8. Một số gen có liên quan khác được phát hiện bằng kỹ thuật MLPA
• 4. CHƯƠNG 4: ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đặc điểm về tuổi
• 4.2. Đặc điểm về giới tính của bệnh nhân
• 4.3. Phân bố u theo vị trí
• 4.4. Phân loại u theo giai đoạn bệnh dựa trên tổn thương mô học
• 4.5. Phân loại mô học
• 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng MLPA
• 4.6.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô vùi nến
• 4.6.2. Kết quả thực hiện MLPA
• 4.6.3. Tỷ lệ mất đoạn exon
• 4.6.4. Tăng số lượng bản sao trên 1q
• 4.6.5. Bất thường ở gen TP53
• 4.6.6. Bất thường ở gen WT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu MLPA và U Nguyên Bào Thận

U nguyên bào thận (UNBT), hay còn gọi là u Wilms, là một loại ung thư thận phổ biến ở trẻ em, đặc biệt là dưới 5 tuổi. Bệnh có liên quan mật thiết đến các dị tật bẩm sinh và sự phát triển khối u. Việc điều trị UNBT phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi, giai đoạn bệnh, và đặc điểm mô bệnh học. Các dấu ấn sinh học phân tử, như mất đoạn dị hợp tử trên nhiễm sắc thể số 1 hoặc 16, cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại và tiên lượng bệnh. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là một phương pháp hiệu quả để phát hiện các thay đổi về số lượng bản sao gen, như mất đoạn hoặc lặp đoạn, với ưu điểm là nhanh chóng, độ nhạy cao và yêu cầu lượng mẫu nhỏ. Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng kỹ thuật MLPA để xác định các kiểu đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân u nguyên bào thận tại Việt Nam.

1.1. Dịch Tễ Học và Đặc Điểm Lâm Sàng U Nguyên Bào Thận

U nguyên bào thận thường gặp ở trẻ dưới 15 tuổi, với tần suất khoảng 1/10.000 trẻ. Trẻ dưới 5 tuổi chiếm phần lớn các trường hợp. Bệnh chiếm khoảng 5-6% trong các loại ung thư ở trẻ em. Khoảng 5-10% trường hợp có u ở cả hai bên thận. Các nghiên cứu tại Việt Nam cũng cho thấy UNBT chiếm tỷ lệ đáng kể trong số các bệnh nhi ung thư. Đặc điểm lâm sàng, tuổi, giai đoạn bệnh và đặc điểm mô bệnh học giải phẫu bệnh khá đa dạng có thể ảnh hưởng đến cách thức điều trị và điều này đã được chứng minh trong nhiều công trình nghiên cứu.

1.2. Vai Trò Của Kỹ Thuật MLPA Trong Chẩn Đoán Đột Biến Gen

Kỹ thuật MLPA là một phương pháp multiplex PCR dựa trên phản ứng nối, cho phép phân tích đồng thời nhiều đoạn DNA khác nhau trong một phản ứng duy nhất. Ưu điểm của MLPA bao gồm yêu cầu lượng mẫu DNA nhỏ (khoảng 20ng), thời gian thực hiện nhanh chóng, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí thấp và dễ thực hiện. MLPA được sử dụng rộng rãi trong việc phát hiện các đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn, đặc biệt là trong các bệnh ung thư và các rối loạn di truyền. Kỹ thuật này có ưu điểm là sử dụng lượng mẫu rất nhỏ khoảng 20ng DNA, cho kết quả nhanh chóng với độ nhạy, công suất cao, giá thành thấp và dễ thực hiện.

II. Thách Thức Trong Xác Định Đột Biến Gen U Nguyên Bào Thận

Việc xác định các đột biến gen trong u nguyên bào thận gặp nhiều thách thức do sự phức tạp về mặt di truyền và mô bệnh học của bệnh. Các phương pháp truyền thống như phân tích nhiễm sắc thể, CGH, FISH, và Southern blots có những hạn chế về thời gian, công suất, độ nhạy, và yêu cầu lượng mẫu lớn. Hơn nữa, các đột biến nhỏ hoặc tái sắp xếp gen có thể khó phát hiện bằng các kỹ thuật này. Do đó, việc ứng dụng các kỹ thuật tiên tiến như MLPA là cần thiết để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu về những biến đổi mất đoạn hoặc lặp đoạn phổ biến trên vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân UNBT tại Việt Nam.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Chẩn Đoán Truyền Thống

Các kỹ thuật như FISH, Southern blots hay LOH, hoặc cần phải có quá nhiều mẫu DNA như trong thử nghiệm Southern blots [21], [79], [80]. Ngoài những phương pháp được sử dụng để phát hiện đột biến mất hoặc lặp đoạn kể trên còn có kỹ thuật khuếch đại đa đọan dò (MLPA): Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Đây là một phương pháp multiplex PCR dựa vào phản ứng nối sử dụng đến 40 mẫu dò đặc hiệu cho những chuỗi DNA khác nhau chỉ trong một phản ứng.

2.2. Sự Cần Thiết Của Nghiên Cứu Về Đột Biến Gen Tại Việt Nam

Hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu về những biến đổi mất đoạn hoặc lặp đoạn phổ biến trên vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân UNBT tại Việt Nam. Do đó, nghiên cứu của chúng tôi hướng đến việc ứng dụng quy trình MLPA để phát hiện các biểu hiện mất đoạn hoặc lặp đoạn phổ biến trên vị trí 1p và 16q của bệnh nhân u nguyên bào thận.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật MLPA Chi Tiết

Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật MLPA để xác định các kiểu đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân u nguyên bào thận. Quy trình nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu bệnh phẩm, chiết tách DNA, thực hiện phản ứng MLPA, và phân tích kết quả. Các mẫu được chọn phải đáp ứng các tiêu chuẩn nhất định để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Dữ liệu thu thập được sẽ được phân tích thống kê để xác định tỷ lệ các loại đột biến và mối liên hệ của chúng với các đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học của bệnh nhân.

3.1. Quy Trình Thu Thập Mẫu và Chiết Tách DNA

Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các bệnh nhân u nguyên bào thận đã được chẩn đoán xác định. Quá trình chiết tách DNA được thực hiện theo quy trình chuẩn để đảm bảo chất lượng DNA đủ cho phản ứng MLPA. Kết quả chiết tách sau khi đo trên máy Nanodrop 1000.

3.2. Thực Hiện Phản Ứng MLPA và Phân Tích Kết Quả

Phản ứng MLPA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng các bộ kít MLPA chuyên dụng cho vùng gen 1p và 16q. Kết quả MLPA được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng để xác định các đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn. Kết quả thực hiện MLPA được thể hiện rõ ràng.

3.3. Kiểm Soát Chất Lượng Trong Kỹ Thuật MLPA

Kiểm soát chất lượng trong kỹ thuật MLPA là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả. Các biện pháp kiểm soát bao gồm sử dụng các mẫu chứng dương và chứng âm, kiểm tra chất lượng DNA, và tuân thủ nghiêm ngặt quy trình thực hiện MLPA.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tỷ Lệ Đột Biến Gen Xác Định Được

Nghiên cứu đã xác định được tỷ lệ các loại đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân u nguyên bào thận. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về tỷ lệ đột biến giữa các nhóm bệnh nhân khác nhau, tùy thuộc vào tuổi, giai đoạn bệnh, và đặc điểm mô bệnh học. Các đột biến phổ biến nhất được xác định là mất đoạn exon tại 1p và 16q. Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p và/hoặc 16p được thống kê chi tiết.

4.1. Tỷ Lệ Mất Đoạn Exon Tại Vị Trí 1p và 16q

Kết quả MLPA cho thấy tỷ lệ mất đoạn exon tại vị trí 1p và 16q là đáng kể trong số các bệnh nhân u nguyên bào thận được nghiên cứu. Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p và 16p được xác định cụ thể.

4.2. Liên Hệ Giữa Đột Biến Gen và Đặc Điểm Lâm Sàng

Phân tích thống kê cho thấy có mối liên hệ giữa các đột biến gen được xác định và các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân, như tuổi, giai đoạn bệnh, và đặc điểm mô bệnh học. Các đột biến này có thể ảnh hưởng đến tiên lượng và đáp ứng điều trị của bệnh nhân.

4.3. Tăng Số Lượng Bản Sao Trên 1q và Bất Thường Gen TP53 WT1

Nghiên cứu cũng ghi nhận trường hợp tăng số lượng bản sao trên 1q và bất thường ở gen TP53, WT1. Bất thường ở gen TP53 và WT1 cũng được ghi nhận trong nghiên cứu.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Tiềm Năng Của Kỹ Thuật MLPA

Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện chẩn đoán và tiên lượng u nguyên bào thận. Việc xác định các đột biến gen bằng kỹ thuật MLPA có thể giúp phân loại bệnh nhân vào các nhóm nguy cơ khác nhau, từ đó đưa ra các phác đồ điều trị phù hợp. Ngoài ra, MLPA cũng có thể được sử dụng để theo dõi đáp ứng điều trị và phát hiện tái phát bệnh. Kỹ thuật MLPA có tiềm năng lớn trong việc cá nhân hóa điều trị ung thư thận ở trẻ em.

5.1. Cải Thiện Chẩn Đoán và Tiên Lượng U Nguyên Bào Thận

Việc xác định các đột biến gen bằng kỹ thuật MLPA có thể giúp phân loại bệnh nhân vào các nhóm nguy cơ khác nhau, từ đó đưa ra các phác đồ điều trị phù hợp. Điều này có thể cải thiện đáng kể tiên lượng và kết quả điều trị cho bệnh nhân u nguyên bào thận.

5.2. Cá Nhân Hóa Điều Trị Ung Thư Thận Ở Trẻ Em

Kỹ thuật MLPA có tiềm năng lớn trong việc cá nhân hóa điều trị ung thư thận ở trẻ em. Dựa trên kết quả phân tích đột biến gen, bác sĩ có thể lựa chọn các phương pháp điều trị phù hợp nhất cho từng bệnh nhân, tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

VI. Kết Luận MLPA Mở Ra Hướng Đi Mới Cho Nghiên Cứu UNBT

Nghiên cứu này đã chứng minh tính hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong việc xác định các đột biến gen liên quan đến u nguyên bào thận. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về tỷ lệ các loại đột biến và mối liên hệ của chúng với các đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học của bệnh nhân. MLPA mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo về di truyền học ung thư và y học cá nhân hóa trong điều trị u nguyên bào thận.

6.1. Tổng Kết Về Ưu Điểm Của Kỹ Thuật MLPA

Kỹ thuật MLPA là một công cụ mạnh mẽ để phát hiện các đột biến gen trong u nguyên bào thận, với ưu điểm là nhanh chóng, độ nhạy cao, và yêu cầu lượng mẫu nhỏ. MLPA có thể được sử dụng để cải thiện chẩn đoán, tiên lượng, và cá nhân hóa điều trị ung thư thận ở trẻ em.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Di Truyền Học Ung Thư

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc xác định các marker di truyền mới liên quan đến u nguyên bào thận, và đánh giá vai trò của chúng trong việc tiên lượng và đáp ứng điều trị. Nghiên cứu về di truyền học ung thư có tiềm năng lớn trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn cho bệnh nhân u nguyên bào thận.

Tổng quan nghiên cứu

U nguyên bào thận (UNBT) là bệnh lý u thận ác tính phổ biến ở trẻ em, đặc biệt dưới 5 tuổi, chiếm khoảng 5-6% các loại ung thư ở trẻ em và đến 95% các khối u ác tính ở thận. Tỷ lệ mắc mới UNBT ở trẻ dưới 15 tuổi là khoảng 1/10.000, với độ tuổi trung bình khi chẩn đoán là 3,5 tuổi. Tại Việt Nam, UNBT chiếm từ 2% đến 5,2% trong các bệnh ung thư nhi khoa tại các bệnh viện lớn. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong điều trị, tỷ lệ sống sót chung đã đạt khoảng 85-90%, nhưng tiên lượng bệnh còn phụ thuộc nhiều vào đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và các dấu ấn sinh học phân tử.

Nghiên cứu tập trung vào ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) để xác định các kiểu đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn tại vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân UNBT. Đây là các vị trí nhiễm sắc thể có liên quan mật thiết đến tiên lượng và nguy cơ tái phát của bệnh. Mục tiêu cụ thể là khảo sát đặc điểm bệnh nhân và xác định tỷ lệ các đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại 1p và 16q, từ đó góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

Nghiên cứu được thực hiện trên 44 mẫu mô vùi nến của bệnh nhân UNBT tại Bệnh viện Nhi Đồng 1, TP. Hồ Chí Minh, trong giai đoạn từ tháng 01/2015 đến tháng 04/2021. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại vào chẩn đoán và phân loại nguy cơ bệnh, góp phần cải thiện tỷ lệ sống còn và chất lượng điều trị cho bệnh nhân UNBT tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh học phân tử của u nguyên bào thận, tập trung vào các khái niệm chính sau:

• Đột biến mất đoạn (Loss of heterozygosity - LOH): Mất đoạn dị hợp tử trên nhiễm sắc thể 1p và 16q được xem là dấu ấn sinh học quan trọng liên quan đến tiên lượng xấu và nguy cơ tái phát cao ở bệnh nhân UNBT.
• Đột biến lặp đoạn (Copy number variation - CNV): Tăng số lượng bản sao tại vị trí 1q cũng được ghi nhận có ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh.
• Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification): Phương pháp PCR multiplex cho phép phát hiện nhanh chóng, chính xác các biến đổi số lượng bản sao gen trên nhiều exon trong cùng một phản ứng, sử dụng lượng mẫu DNA nhỏ (khoảng 20 ng), có độ nhạy cao và chi phí hợp lý.
• Phân loại mô học và giai đoạn bệnh: Dựa trên tiêu chuẩn của Children’s Oncology Group (COG) và International Society of Paediatric Oncology (SIOP), phân loại mô học thuận lợi và không thuận lợi, cùng với giai đoạn bệnh (I-V) ảnh hưởng đến lựa chọn phác đồ điều trị.

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang, chọn mẫu thuận tiện.
• Đối tượng nghiên cứu: 44 bệnh nhân UNBT được chẩn đoán xác định bằng giải phẫu bệnh tại Bệnh viện Nhi Đồng 1, chưa hóa trị trước phẫu thuật, có mẫu mô vùi nến lưu trữ từ tháng 01/2015 đến tháng 04/2021.
• Thu thập dữ liệu: Hồ sơ bệnh án, mẫu mô vùi nến, thông tin lâm sàng, mô bệnh học, kết quả MLPA.
• Quy trình kỹ thuật:
  • Chiết tách DNA từ mẫu mô vùi nến sử dụng bộ kit QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit.
  • Thực hiện phản ứng MLPA với bộ probe P380 Wilms tumour 43 probe, bao gồm các probe đặc hiệu cho 1p, 1q, 16p, 16q và các gen liên quan như WT1, TP53.
  • Điện di mao quản và phân tích kết quả bằng phần mềm GeneMarker version 1.97.
• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 25, thống kê mô tả với số lượng, tỷ lệ phần trăm; kiểm định sự khác biệt và tương quan giữa các biến.
• Kiểm soát sai lệch: Bám sát tiêu chuẩn chọn mẫu, kiểm soát chất lượng kỹ thuật MLPA với mẫu chứng, kiểm soát thông tin từ phần mềm quản lý bệnh viện.
• Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Từ tháng 12/2020 đến tháng 11/2021 tại Bệnh viện Nhi Đồng 1, Khoa Vi sinh và Trung tâm Y sinh học phân tử Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
• Đạo đức nghiên cứu: Được Hội đồng Khoa học và Đạo đức Bệnh viện Nhi Đồng 1 phê duyệt, đảm bảo bảo mật thông tin và không ảnh hưởng đến điều trị bệnh nhân.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu:

   • Độ tuổi trung bình 3,34 ± 0,45 tuổi, nhóm tuổi dưới 5 chiếm 77,3%, phổ biến nhất là nhóm 1-2 tuổi (27,3%).
   • Tỷ lệ nam/nữ là 1,2, với 54,5% nam và 45,5% nữ.
   • Vị trí khối u phân bố gần như đồng đều giữa thận trái (47,7%) và thận phải (52,3%), không ghi nhận trường hợp u hai bên.
   • Giai đoạn bệnh chủ yếu là I (52,3%) và II (38,6%), không có trường hợp giai đoạn IV và V.
   • Mô học thuận lợi chiếm 97,7%, chỉ 2,3% là mô học không thuận lợi.
   • Tỷ lệ di căn hạch ổ bụng là 5,2% trong số 38 trường hợp khảo sát.

2. Kết quả kỹ thuật MLPA:

   • Trong 44 mẫu, có 26 mẫu (59%) thực hiện MLPA thành công, 18 mẫu không xác định được kết quả.
   • Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p và/hoặc 16q là 19,2% (5/26 mẫu).
   • Mất đoạn exon riêng lẻ tại 1p chiếm 15,3% (4/26), tại 16q chiếm 11,5% (3/26).
   • Mất đoạn đồng thời tại cả 1p và 16q chiếm 7,7% (2/26).
   • Tỷ lệ tăng đoạn exon tại 1q là 15,3% (4/26).

3. Chất lượng DNA và hiệu quả kỹ thuật:

   • Hàm lượng DNA thu được dao động từ 30 đến 450 ng/μL, tỷ số OD 260/280 trong khoảng 1,8-2,0, đảm bảo độ tinh sạch.
   • Mẫu vùi nến có độ đứt gãy DNA nhưng vẫn đủ tiêu chuẩn thực hiện MLPA.
   • Tỷ lệ thành công MLPA cao hơn ở các mẫu thu thập từ năm 2018 trở đi (trên 66,7%) so với trước đó.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo quốc tế về tỷ lệ mất đoạn 1p và 16q trong UNBT, cho thấy khoảng 15-20% bệnh nhân có đột biến mất đoạn tại các vị trí này. Tỷ lệ mất đoạn đồng thời 1p và 16q (7,7%) cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đây, trong đó mất đoạn đồng thời được xem là yếu tố tiên lượng xấu, liên quan đến nguy cơ tái phát và tử vong cao hơn.

Tỷ lệ tăng đoạn 1q (15,3%) được xác nhận là một yếu tố độc lập ảnh hưởng đến tiên lượng, phù hợp với nghiên cứu của Chagtai và cộng sự. Việc ứng dụng MLPA cho phép phát hiện nhanh các biến đổi số lượng bản sao gen với độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu nhỏ, phù hợp với mẫu mô vùi nến lưu trữ lâu năm.

So với các kỹ thuật truyền thống như FISH, Southern blot hay CGH array, MLPA có ưu điểm vượt trội về chi phí, thời gian và khả năng phát hiện các đột biến nhỏ trong gen. Tuy nhiên, tỷ lệ thành công MLPA phụ thuộc vào chất lượng mẫu DNA, điều này giải thích tỷ lệ không thành công ở 18 mẫu do mẫu vùi nến bị đứt gãy nhiều.

Biểu đồ và bảng số liệu có thể minh họa rõ ràng tỷ lệ mất đoạn exon tại các vị trí 1p, 16q và tăng đoạn 1q, cũng như phân bố tuổi, giới tính và giai đoạn bệnh của bệnh nhân, giúp trực quan hóa mối liên hệ giữa đặc điểm lâm sàng và biến đổi phân tử.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng rộng rãi kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán phân tử UNBT

   • Mục tiêu: Nâng cao tỷ lệ phát hiện đột biến mất/lặp đoạn gen tại 1p, 16q và 1q.
   • Thời gian: Triển khai trong 1-2 năm tới tại các trung tâm ung bướu nhi khoa lớn.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng xét nghiệm sinh học phân tử tại bệnh viện nhi và đại học y dược.

2. Xây dựng quy trình chuẩn lấy mẫu và bảo quản mô vùi nến

   • Mục tiêu: Tăng tỷ lệ thành công của kỹ thuật MLPA, giảm tỷ lệ mẫu không đạt chất lượng.
   • Thời gian: 6-12 tháng để đào tạo và áp dụng quy trình chuẩn.
   • Chủ thể thực hiện: Khoa giải phẫu bệnh, phòng xét nghiệm.

3. Phối hợp đa chuyên ngành trong phân loại nguy cơ và điều trị UNBT

   • Mục tiêu: Kết hợp kết quả mô học, lâm sàng và sinh học phân tử để xây dựng phác đồ điều trị cá thể hóa.
   • Thời gian: 1 năm để xây dựng hướng dẫn và áp dụng thử nghiệm.
   • Chủ thể thực hiện: Bác sĩ ung bướu nhi, giải phẫu bệnh, kỹ thuật viên sinh học phân tử.

4. Nâng cao năng lực nghiên cứu và đào tạo về kỹ thuật MLPA và sinh học phân tử

   • Mục tiêu: Đào tạo nhân lực chuyên sâu, cập nhật kỹ thuật mới, nâng cao chất lượng nghiên cứu.
   • Thời gian: Liên tục, ưu tiên trong 3 năm tới.
   • Chủ thể thực hiện: Đại học Y Dược, các bệnh viện chuyên khoa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ ung bướu nhi và bác sĩ lâm sàng

   • Lợi ích: Hiểu rõ vai trò của đột biến gen trong tiên lượng và lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp.
   • Use case: Áp dụng kết quả MLPA để phân nhóm nguy cơ bệnh nhân UNBT.

2. Kỹ thuật viên và nhà nghiên cứu sinh học phân tử

   • Lợi ích: Nắm vững quy trình kỹ thuật MLPA, cách xử lý mẫu mô vùi nến và phân tích dữ liệu.
   • Use case: Triển khai kỹ thuật MLPA trong phòng xét nghiệm, nghiên cứu các đột biến gen liên quan.

3. Giảng viên và sinh viên ngành kỹ thuật xét nghiệm y học, y học phân tử

   • Lợi ích: Tài liệu tham khảo thực tiễn về ứng dụng MLPA trong chẩn đoán ung thư nhi khoa.
   • Use case: Học tập, nghiên cứu và phát triển đề tài liên quan đến đột biến gen.

4. Nhà hoạch định chính sách y tế và quản lý bệnh viện

   • Lợi ích: Đánh giá hiệu quả và chi phí của kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán và điều trị UNBT.
   • Use case: Lập kế hoạch đầu tư trang thiết bị, đào tạo nhân lực và xây dựng hướng dẫn chẩn đoán.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật MLPA là gì và ưu điểm của nó trong nghiên cứu UNBT?
   MLPA là kỹ thuật khuếch đại đa đoạn dò giúp phát hiện các biến đổi số lượng bản sao gen như mất đoạn hoặc lặp đoạn. Ưu điểm là sử dụng lượng mẫu DNA nhỏ, cho kết quả nhanh, độ nhạy cao và chi phí thấp, phù hợp với mẫu mô vùi nến lưu trữ lâu năm.

2. Tại sao mất đoạn 1p và 16q lại quan trọng trong UNBT?
   Mất đoạn 1p và 16q liên quan đến nguy cơ tái phát và tử vong cao hơn ở bệnh nhân UNBT, do đó được sử dụng làm dấu ấn sinh học để phân nhóm nguy cơ và điều chỉnh phác đồ điều trị.

3. Tỷ lệ thành công của MLPA trên mẫu mô vùi nến như thế nào?
   Trong nghiên cứu, tỷ lệ thành công MLPA là khoảng 59%, với tỷ lệ thành công cao hơn ở các mẫu mới thu thập. Chất lượng mẫu DNA ảnh hưởng lớn đến kết quả.

4. Có thể áp dụng kết quả nghiên cứu này vào thực tiễn lâm sàng không?
   Có, kết quả giúp bác sĩ phân loại nguy cơ bệnh nhân chính xác hơn, từ đó lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu biến chứng.

5. Ngoài MLPA, còn có kỹ thuật nào khác để phát hiện đột biến mất/lặp đoạn?
   Có các kỹ thuật như FISH, Southern blot, CGH array, SNP array, nhưng MLPA có ưu điểm về chi phí, thời gian và khả năng phát hiện các đột biến nhỏ với độ nhạy cao hơn.

Kết luận

• Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật MLPA để phát hiện các đột biến mất đoạn và lặp đoạn tại vị trí 1p và 16q trên bệnh nhân UNBT tại Việt Nam.
• Tỷ lệ mất đoạn exon tại 1p và/hoặc 16q là khoảng 19%, tỷ lệ tăng đoạn exon tại 1q là 15%, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế.
• Đặc điểm lâm sàng và mô học của bệnh nhân đa phần là mô học thuận lợi, giai đoạn I và II chiếm ưu thế.
• Kỹ thuật MLPA cho phép sử dụng mẫu mô vùi nến lưu trữ lâu năm với độ nhạy và độ chính xác cao, góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán phân tử.
• Đề xuất triển khai rộng rãi MLPA trong chẩn đoán và phân loại nguy cơ UNBT, đồng thời xây dựng quy trình lấy mẫu và đào tạo nhân lực để nâng cao hiệu quả điều trị.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các trung tâm ung bướu nhi áp dụng kỹ thuật MLPA, phối hợp đa ngành trong điều trị và tiếp tục nghiên cứu mở rộng về các đột biến gen liên quan đến UNBT nhằm cải thiện tiên lượng bệnh nhân.