Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Nguyễn Văn Quyên, thực hiện năm 2020 tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, thuộc chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số: 9.42.01.07), mang tiêu đề: "Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô". Công trình được hoàn thành dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Nguyễn Thành Đạt và TS. Nguyễn Quang Thảo.
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Whisky là loại rượu mạnh có độ cồn từ 40% đến 50% Vol, được sản xuất thông qua quá trình chưng cất dịch lên men từ các loại ngũ cốc (đại mạch, ngô, lúa mì, lúa mạch đen, gạo) và tàng trữ lâu năm trong thùng gỗ sồi để hoàn thiện chất lượng cảm quan. Tại Việt Nam, nhu cầu tiêu thụ các dòng rượu cao độ nói chung và rượu whisky nói riêng đạt mức 500 – 520 triệu lít/năm (theo khảo sát của Hiệp hội Rượu - Bia - Nước giải khát Việt Nam - VBA). Do trong nước chưa làm chủ công nghệ sản xuất quy mô lớn, lượng rượu whisky tiêu thụ hầu như phụ thuộc hoàn toàn vào nhập khẩu bằng ngoại tệ.
Mặc dù Việt Nam sở hữu nguồn nguyên liệu ngũ cốc phong phú (sản lượng ngô đạt 5,13 triệu tấn; ngành bia - rượu tiêu thụ khoảng 120.000 tấn malt nhập khẩu hàng năm; đồng thời có nhà máy sản xuất malt tại Khu công nghiệp Tiên Sơn, Bắc Ninh với công suất 60.000 tấn) cùng hệ vi sinh vật bản địa đa dạng từ các làng nghề truyền thống, các công trình nghiên cứu sản xuất rượu cao độ và whisky trong nước trước đó chủ yếu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, sản xuất rượu trắng chưa qua ủ gỗ sồi, hoặc gặp hạn chế về chủng men, lựa chọn loại gỗ sồi và kỹ thuật tàng trữ. Do đó, việc nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men thuần khiết, xác định thông số công nghệ lên men, chưng cất và tàng trữ gỗ sồi để tạo ra sản phẩm whisky đạt chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm là nhiệm vụ có tính cấp thiết cao.
Mục tiêu nghiên cứu
Văn bản luận án xác định 4 mục tiêu cụ thể:
- Tuyển chọn được 1 – 2 chủng nấm men có chất lượng tốt, đáp ứng các yêu cầu công nghệ và chất lượng sản phẩm.
- Xác định được một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa, di truyền và định tên khoa học chủng nấm men đã tuyển chọn.
- Ứng dụng chủng nấm men đã tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch và ngô.
- Xây dựng được quy trình công nghệ và sản xuất được rượu whisky từ ngô và malt đại mạch sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng và an toàn thực phẩm theo quy định.
Nội dung nghiên cứu chính
Luận án triển khai 5 nội dung nghiên cứu đánh số theo văn bản:
- 3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ sản xuất và chất lượng sản phẩm rượu whisky;
- 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản (đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh trưởng) và định danh tên khoa học của chủng nấm men đã tuyển chọn;
- 3.3. Nghiên cứu động học quá trình lên men rượu;
- 3.4. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch;
- 3.5. Ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất thử nghiệm sản phẩm tại cơ sở sản xuất rượu.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: 15 dòng nấm men phân lập từ các nguồn men truyền thống tại Việt Nam; chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MS42 được lựa chọn; nguyên liệu malt đại mạch, ngô hạt vàng khô; các loại enzyme công nghiệp (Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase); 24 mẫu gỗ sồi thử nghiệm; các mẫu rượu whisky đối chứng thương mại (Jack Daniel's, Singleton, Knob Creek).
- Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học và Công nghệ vi sinh (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội), Trung tâm bảo tồn Vi sinh vật công nghiệp (Viện Công nghiệp Thực phẩm), và quy mô thử nghiệm tại Công ty cổ phần Bia - Rượu Eresson Việt Nam. Nguồn mẫu nấm men thu thập tại xã Mẫu Sơn, huyện Lộc Bình, tỉnh Lạng Sơn.
- Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2020; các số liệu theo dõi tàng trữ rượu với gỗ sồi được tiến hành kéo dài đến 24 tháng.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế
Trong luận án, tác giả tổng kết các công trình và tài liệu khoa học liên quan đến phân loại học vi sinh vật, hóa sinh lên men và công nghệ sản xuất whisky:
- Nghiên cứu trong nước:
- Đặng Tất Thành (2006) thực hiện đề tài "Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để sản xuất rượu cao độ từ malt đại mạch", sản xuất cồn thực nghiệm ở hai mức cồn 29% Vol và 39,9% Vol, tàng trữ trong vại sứ ở nhiệt độ thấp nhưng chưa ngâm ủ với gỗ sồi.
- Nguyễn Đức Quang (Viện Nghiên cứu Rượu Bia Nước giải khát) thực hiện đề tài "Nghiên cứu sản xuất rượu có độ cồn cao từ nguồn Đại mạch Việt Nam", vận hành quy mô 40 lít/mẻ và 150 lít/mẻ, hiệu suất thu hồi 88%, độ cồn 30% Vol, mới dừng lại ở dạng rượu trắng cao độ.
- Nguyễn Minh Thu (2016) triển khai đề tài "Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam" thuộc Đề án phát triển CNSH đến năm 2020; áp dụng công thức phối trộn malt : gạo : ngô theo tỷ lệ 2 : 1 : 7 ở quy mô công nghiệp, tuy nhiên còn hạn chế về chất lượng hương vị, chưa đánh giá hệ thống về tuyển chọn gỗ sồi, thời gian tàng trữ và chủng nấm men tối ưu.
- Nghiên cứu quốc tế:
- Về phân loại học và sinh học phân tử nấm men: Lodder (1983), Kreger-Van Rij với các khóa phân loại nấm men; phân tích trình tự DNA các vùng D1/D2 của gen 28S, ITS1/ITS2 quanh gen 5.8S và trình tự gen RNA ribosome 18S.
- Về sinh lý trao đổi chất và động học: Yaya Liu và cộng sự xác định tốc độ giải phóng tối thiểu của tế bào S. cerevisiae khi thiếu N và P lần lượt là 8,1 μmol N/[g sinh khối]/h và 5,2 μmol P/[g sinh khối]/h. Schimz và Holzer (1979) nghiên cứu nồng độ SO2 1 mM ở pH < 4 gây giảm ATP nội bào và làm chết tế bào nấm men. Hopkins và Wiener phân tích giới hạn thủy phân tinh bột của amylase khi không có dextrinase.
- Về kinh tế và thị trường whisky: MarketLine (2015) ghi nhận quy mô thị trường rượu mạnh vượt 306 tỷ USD với sản lượng 22 tỷ lít, whisky chiếm 27% thị phần; Grand View Research (2017) định giá thị trường rượu mạnh toàn cầu năm 2016 đạt 336 tỷ USD.
Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết
Luận án tập trung giải quyết khoảng trống thực nghiệm và ứng dụng công nghệ tại Việt Nam: tuyển chọn dòng nấm men bản địa thuần chủng có khả năng lên men tạo cồn cao (trên 12% Vol), chịu được nồng độ đường và áp suất thẩm thấu lớn, tạo ít độc tố (methanol, acetaldehyde, furfural); xác định chế phẩm enzyme thủy phân phù hợp cho dịch ngô và malt; xác định dòng gỗ sồi thích hợp (gỗ sồi S8 từ Mỹ) và xây dựng bộ dữ liệu biến đổi chất thơm theo chu kỳ tàng trữ 24 tháng; đồng thời kiểm chứng toàn diện quy trình trên quy mô công nghiệp 10.000 lít tại doanh nghiệp sản xuất đồ uống.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng
- Phân loại học nấm men: Kết hợp hình thái học tế bào/khuẩn lạc, khả năng tạo túi bào tử (Ascospores) qua giảm phân, khả năng đồng hóa 20 loại hợp chất carbon (hexose, pentose, disaccharide, trisaccharide, polysaccharide, rượu polyol, axit hữu cơ), đồng hóa hợp chất nitơ bằng phương pháp khuyết dưỡng tự ghi (auxanographic), và sinh học phân tử dựa trên giải trình tự gen ribosome.
- Hóa sinh quá trình lên men ethanol: Con đường đường phân Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), cơ chế khử pyruvate thành acetaldehyde nhờ pyruvate decarboxylase, chuyển hóa tiếp thành ethanol nhờ enzyme alcohol dehydrogenase liên kết hệ coenzyme NAD+/NADH.
- Hiệu ứng Pasteur và điều hòa chuyển hóa: Hiện tượng ức chế lên men do quá trình hô hấp hiếu khí thông qua cạnh tranh cơ chất giữa pyruvate dehydrogenase (Km = 0,1 – 0,2 mM) và pyruvate decarboxylase (Km = 3 – 4 mM). Sự kiểm soát dị hóa glucose ở các điểm nghẽn phosphofructokinase, pyruvate dehydrogenase và citrate synthetase.
Bảng so sánh quá trình thủy phân đường ở Candida tropicalis và Saccharomyces cerevisiae:
| Đặc điểm so sánh | Candida tropicalis | Saccharomyces cerevisiae |
|---|---|---|
| Tốc độ lên men trong điều kiện kị khí (nmol glucose/g) | 150 – 200 | 160 |
| Tốc độ lên men trong điều kiện hiếu khí (nmol glucose/g) | 5 | 140 |
| Đường độ hô hấp (nmol glucose/g) | 42 | 7 |
| Dòng đường phân tổng số (thủy phân đường) (nmol glucose/g) | 47 | 147 |
| Phần trăm ức chế quá trình lên men do hô hấp (%) | 97 | 12 |
| Phần trăm ức chế quá trình thủy phân đường có oxy (%) | 73 | 9 |
- Hóa học gỗ sồi và sự hình thành hương: Cấu trúc thành tế bào gỗ gồm cellulose (38 – 52%), hemicellulose (25 – 30%), lignin (22 – 25%) và ellagitannin (5 – 10%). Sự giải phóng các dẫn xuất polyphenol (gallic acid, vanillic acid, syringic acid, ferulic acid, vanillin, syringaldehyde, coniferylaldehyde, sinapaldehyde) vào rượu qua các phản ứng oxy hóa và tương tác hóa học.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Kỹ thuật vi sinh vật và sinh học phân tử:
- Nuôi cấy, phân lập trên môi trường thạch Hansen, môi trường YM (chiết xuất nấm men, malt extract, agar).
- Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng chuỗi polymerase (PCR), giải trình tự đoạn gen chỉ thị và phân tích quan hệ phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.
- Quan sát cấu trúc tế bào và bào tử qua kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử.
- Kỹ thuật phân tích hóa lý và sinh hóa:
- Định lượng đường khử và đường tổng số theo phương pháp tạo phức màu, dựng đường chuẩn với D-glucose và maltose.
- Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry (dựng đường chuẩn với Albumin).
- Định lượng nồng độ nitơ alpha-amino tự do (FAN).
- Đo mật độ quang (OD) xác định mật độ sinh khối và đo OD ở bước sóng 420 nm (OD420nm) để theo dõi tốc độ chiết xuất màu sắc và polyphenol từ gỗ sồi.
- Sắc ký khí phát hiện ion hóa ngọn lửa (GC-FID) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS) phân tích hàm lượng ethanol, methanol, ester, aldehyde, các rượu bậc cao (fusel oil), axit bay hơi và các hợp chất thơm hình thành trong thời gian tàng trữ.
- Kỹ thuật chế biến và công nghệ:
- Thủy phân tinh bột qua 4 giai đoạn nhiệt độ bằng nồi mashing; tối ưu nồng độ các enzyme thương mại Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase.
- Chưng cất phân đoạn gián đoạn 2 lần bằng hệ thống nồi đồng củ hành (pot still); tách phân đoạn rượu đầu (foreshots/heads), rượu tim (heart) và rượu cuối (feints/tails).
- Đánh giá cảm quan sản phẩm theo thang điểm tiêu chuẩn TCVN, áp dụng hệ số quan trọng cho các chỉ tiêu độ trong, màu sắc, mùi, vị.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu
Chương này gồm 38 trang, hệ thống hóa toàn diện các cơ sở lý luận và thực tiễn về vi sinh vật học nấm men và công nghệ sản xuất rượu whisky:
- Đặc điểm nấm men: Mô tả kích thước tế bào từ 3 – 10 μm, thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ mannan và glucan; bộ gen S. cerevisiae gồm 16 nhiễm sắc thể (đơn bội 1n hoặc lưỡng bội 2n); khối lượng riêng đạt 1,055 – 1,060 KDa. Chu kỳ sinh sản vô tính chia làm 4 pha (G1, S, G2, M). Liệt kê 15 chi nấm men rượu điển hình (Brettanomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces...).
- Nhu cầu dinh dưỡng: Xác định tỷ lệ nguyên tố trong sinh khối S. cerevisiae là C : 1,72; O : 0,44; N : 0,15. Trình bày trật tự sử dụng các axit amin ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng từ cao xuống thấp (đứng đầu là Glutamine, Ammonium, Asparagine, Axit glutamic, Serine, Arginine; thấp nhất là Methionine, Histidine, Glycine).
Thành phần tro trong sinh khối tế bào Saccharomyces cerevisiae:
| Nguyên tố khoáng | Hàm lượng (g/100g chất khô tế bào) |
|---|---|
| Potassium (K) | 2,2 |
| Cobalt (Co) | 0,5 × 10⁻³ |
- Các yếu tố ảnh hưởng lên men:
- Nhiệt độ thích hợp: 24 – 30°C.
- Hoạt độ nước (aw): Tối thiểu 0,65; nấm men tích lũy polyols (glycerol, arabitol) để duy trì áp suất thẩm thấu; nồng độ đường tối ưu 16 – 22% (w/v), trên 28% (w/v) gây ức chế và 79% (w/v) làm mất hoàn toàn khả năng lên men.
- Nồng độ ethanol: Gây độc ở mức 8 – 18% (w/v); nồng độ ethanol nội bào tối đa cho phép là 0,25 mg trên 10⁶ tế bào sống.
- Oxy hòa tan: Cần 0,65 – 0,7 mg/l ban đầu để tổng hợp ergosterol và axit oleic.
- Mật độ giống: 4 × 10⁶ – 10 × 10⁶ tế bào/ml dịch lên men.
- Nồng độ chất kháng khuẩn SO2: Cho phép dùng ở mức 75 – 110 ppm, giới hạn tối đa 490 ppm.
- Nguyên liệu và công nghệ:
- Phân tích chi tiết đặc tính hạt ngô vàng khô:
| Thành phần dinh dưỡng ngô hạt khô | Đơn vị tính | Hàm lượng (trên 100g) |
|---|---|---|
| Nước | g | 14,0 |
| Protein | g | 8,6 |
| Chất béo | g | 4,7 |
| Tinh bột | g | 69,4 |
| Xenlulose (Chất xơ) | g | 2,0 |
| Đường tổng số | g | 0,64 |
| Tro | g | 1,3 |
| Tổng axit béo no | g | 0,670 |
| Tổng axit béo không no 1 nối đôi (MUFA) | g | 1,250 |
| Tổng axit béo không no nhiều nối đôi (PUFA) | g | 2,160 |
- Trình bày hoạt động của hệ enzyme diastase (α-amylase phân cắt liên kết α-1,4 ngẫu nhiên; β-amylase cắt gốc maltose từ đầu không khử; γ-amylase/glucoamylase cắt cả α-1,4 và α-1,6 tạo 100% glucose) và hệ enzyme protease (proteinase, peptidase, amidase).
- Quy trình mashing malt 4 mức nhiệt độ: 45°C (30 phút, trương nở tinh bột), 52°C (40 phút, protease hoạt động), 64°C (60 phút, amylase dịch hóa/đường hóa), 75°C (15 phút, vô hoạt enzyme và thanh trùng).
- Quy trình chưng cất 2 lần kiểu Scotland và 3 lần kiểu Ireland bằng nồi pot still bằng đồng.
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương này gồm 20 trang, mô tả nguồn gốc mẫu vật, môi trường và bố trí thí nghiệm:
- Vật liệu nghiên cứu: 15 dòng nấm men phân lập từ bánh men truyền thống; malt đại mạch thương mại; ngô vàng khô nguyên hạt; các chế phẩm sinh học thương mại (Termamyl SC từ Bacillus stearothermophilus biểu hiện qua B. licheniformis, Dextrozyme GA, Neutrase chứa kẽm từ Bacillus subtilis). 24 mẫu gỗ sồi thử nghiệm từ các xuất xứ khác nhau; các mẫu rượu whisky ngoại nhập đối chứng gồm Jack Daniel's (Mỹ, 100% ngô), Singleton (Scotland, 100% malt) và Knob Creek (Mỹ, 80% ngô, 20% malt).
- Thiết kế thí nghiệm: Bố trí khảo sát ảnh hưởng đơn yếu tố và tối ưu hóa đa yếu tố đối với quá trình nhân giống và lên men: dải pH (4,0 đến 6,5), nhiệt độ (16°C đến 35°C), hàm lượng oxy hòa tan ban đầu, nồng độ đường tổng số (120 g/l đến 240 g/l), và thử nghiệm sử dụng dịch chiết giá đỗ thay thế pepton nhằm hạ giá thành môi trường nhân giống.
- Phương pháp chưng cất và tàng trữ: Vận hành nồi chưng cất đồng gián đoạn dung tích nhỏ tại phòng thí nghiệm; xác định tỷ lệ tách rượu đầu và rượu cuối dựa trên độ cồn và cảm quan; bố trí thí nghiệm ngâm ủ rượu với 24 mẫu gỗ sồi ở quy mô bình thủy tinh và thùng ủ, định kỳ phân tích các chỉ tiêu hóa lý, mật độ quang OD420nm và sắc ký chất thơm sau 6, 12, 18 và 24 tháng.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Chương này gồm 80 trang, trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được:
- Tuyển chọn và định danh chủng MS42:
- Đánh giá khả năng lên men và cảm quan của 15 dòng nấm men trên môi trường malt (M) và ngô (N). Dòng ký hiệu MS42 thể hiện hoạt lực lên men vượt trội, hương vị tốt, sinh ít độc tố.
- Phân tích tế bào học: Khuẩn lạc tròn, rìa nhẵn trên thạch Hansen; tế bào hình bầu dục/hình trứng nảy chồi; hình thành túi chứa 4 bào tử túi khi gặp điều kiện cảm ứng; khối lượng riêng tế bào đạt chuẩn nấm men.
- Kết quả phân tích trình tự phân tử vùng gen ribosome và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 6 xác định dòng MS42 thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Tên khoa học được ấn định là Saccharomyces cerevisiae MS42.
- Đặc điểm sinh lý, sinh trưởng của chủng MS42:
- Đồng hóa tốt các nguồn đường glucose, galactose, maltose, saccharose, raffinose.
- Sinh trưởng tối ưu trong nuôi cấy mẻ tại điều kiện: pHopt = 5,0 – 5,5; Topt = 20 – 30°C; oxy hòa tan ban đầu 0,65 – 0,70 mg/l; hàm lượng đường tổng số 160 – 180 g/l. Mật độ tế bào đạt đỉnh 213 × 10⁶ – 215 × 10⁶ tế bào/ml sau 36 – 48 giờ nuôi cấy.
- Dịch chiết giá đỗ chứng minh khả năng thay thế hoàn toàn nguồn pepton đắt tiền trong môi trường nhân giống mà vẫn duy trì sinh khối và hoạt lực lên men tương đương. Chủng giữ được hoạt tính ổn định qua các chu kỳ bảo quản.
- Động học lên men rượu và tối ưu hóa chế biến dịch đường:
- Tỷ lệ phối trộn nước : malt tối ưu là 4 : 1 (1 kg malt : 4 lít nước). Thử nghiệm bổ sung enzyme Termamyl SC và Dextrozyme GA giúp đường hóa triệt để tinh bột malt.
- Nấu ngô chịu áp lực kết hợp bổ sung Termamyl SC, Dextrozyme GA và Neutrase: Xác định được liều lượng và thời gian thủy phân tối ưu giúp giảm độ nhớt khối dịch hồ hóa ngô và tăng lượng axit amin tự do (FAN).
- Lên men dịch malt và dịch ngô bằng S. cerevisiae MS42 đạt hiệu suất chuyển hóa 89,51% – 91,40%, độ cồn sau lên men đạt 9,00 – 9,91% Vol; chủng có khả năng chịu cồn cao và đạt độ cồn tối đa 12,3% Vol ở 25°C.
- Công nghệ chưng cất, phối trộn và tàng trữ:
- Thực hiện chưng cất gián đoạn 2 lần: Lần 1 thu nhận rượu thô (khoảng 45° Proof); lần 2 tách chính xác phân đoạn đầu và phân đoạn cuối để thu rượu tim có độ cồn thích hợp, loại bỏ hợp chất lưu huỳnh, furfural và tạp chất đắng.
- Phối trộn rượu malt và rượu ngô theo các tỷ lệ khác nhau để tạo dòng rượu Blend; tối ưu hóa công thức pha chế.
- Đánh giá 24 mẫu gỗ sồi ngâm ủ: Sau 3 tháng và 180 ngày đánh giá cảm quan lần 2, chọn được mẫu gỗ sồi S8 nhập khẩu từ Mỹ cho chỉ số cảm quan và trích ly hợp chất màu (OD420nm) tối ưu nhất.
- Theo dõi biến đổi chất thơm qua 6, 12, 18, 24 tháng bằng GC-MS: Hàm lượng các ester thơm (ethyl acetate, ethyl lactate, phenylethyl acetate), vanillin, syringaldehyde tăng dần theo thời gian ủ, tạo nên cấu trúc hương vị đặc trưng tiệm cận với các mẫu đối chứng ngoại nhập (Jack Daniel's, Singleton, Knob Creek).
- Thử nghiệm sản xuất quy mô công nghiệp tại Công ty Eresson:
- Ứng dụng quy trình hoàn thiện tại Công ty cổ phần TNHH MTV Bia - Rượu Eresson Việt Nam, sản xuất thành công 10.000 lít rượu whisky gồm 3 dòng sản phẩm: Whisky 100% malt; Whisky 100% ngô; và Whisky phối trộn Blend (20% malt + 80% ngô).
- Kiểm nghiệm chất lượng: Tất cả 3 sản phẩm đều đạt Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN) và quy định an toàn thực phẩm đối với đồ uống có cồn; được khách hàng quốc tế từ Trung Quốc và Singapore thử nghiệm và đánh giá cao.
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới của luận án
Theo công bố của tác giả, luận án mang lại 6 đóng góp mới chính thức:
- Tuyển chọn và định danh khoa học được 01 chủng nấm men phân lập từ nguồn bánh men rượu truyền thống xã Mẫu Sơn, huyện Lộc Bình, tỉnh Lạng Sơn (Saccharomyces cerevisiae MS42) đạt các tiêu chí để sản xuất rượu whisky từ ngô và malt đại mạch: lên men dịch đường hóa tạo độ cồn đạt 12,3% Vol ở 25°C; tạo hương vị đặc trưng; sinh trưởng đạt 213 × 10⁶ – 215 × 10⁶ tế bào/ml sau 36 – 48 giờ; lên men tối ưu ở đường 160 – 180 g/l, pH 5,0 – 5,5, nhiệt độ 20 – 30°C cho độ cồn 9,00 – 9,91% Vol; hiệu suất lên men đạt 89,52 – 91,13%, sinh rất ít độc tố methanol, acetaldehyde, furfural.
- Xác định được nguồn nguyên liệu phù hợp để sản xuất rượu whisky tại Việt Nam gồm: Malt đại mạch, ngô hạt vàng trong nước và gỗ sồi (ký hiệu S8) nhập khẩu từ Mỹ.
- Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất whisky từ ngô và malt đại mạch phù hợp với điều kiện thực tiễn thiết bị và nguyên liệu tại Việt Nam.
- Bước đầu làm sáng tỏ quy luật hình thành và biến đổi của một số hợp chất tạo hương đặc trưng trong quá trình tàng trữ rượu whisky với gỗ sồi kéo dài 24 tháng.
- Cung cấp cơ sở khoa học hoàn chỉnh về chủng giống nấm men và quy trình công nghệ chế biến dịch đường, lên men, chưng cất rượu whisky ngũ cốc.
- Ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất thử nghiệm thành công 10.000 lít rượu whisky tại Công ty cổ phần TNHH MTV Bia - Rượu Eresson Việt Nam (với 3 dòng sản phẩm: 100% malt, 100% ngô, và 20% malt phối trộn 80% ngô), đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia và tiêu chuẩn an toàn thực phẩm.
Kiến nghị và đề xuất
- Đề nghị đưa chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MS42 vào lưu giữ, bảo tồn tại Trung tâm bảo tồn Vi sinh vật công nghiệp (Viện Công nghiệp Thực phẩm) để phục vụ nghiên cứu và sản xuất lâu dài.
- Kiến nghị các doanh nghiệp sản xuất đồ uống có cồn áp dụng quy trình công nghệ đã hoàn thiện của luận án để mở rộng sản xuất rượu whisky trong nước, từng bước thay thế hàng nhập khẩu.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Dựa trên nội dung văn bản luận án, các hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:
- Hạn chế:
- Thời gian tàng trữ gỗ sồi theo dõi trong luận án dừng lại ở mốc 24 tháng, trong khi các tiêu chuẩn whisky quốc tế thường đòi hỏi thời gian tàng trữ tối thiểu 3 năm (như Scotch Whisky hay Irish Whiskey) hoặc lâu hơn (8 năm trở lên đối với dòng Single Malt cao cấp).
- Nguồn gỗ sồi chất lượng cao (mẫu S8) vẫn phải nhập khẩu từ Mỹ, chưa khai thác hoặc thử nghiệm được nguồn gỗ sồi hoặc các loại gỗ thay thế nội địa có thể tạo hương vị tương đương.
- Quy mô thử nghiệm công nghiệp mới triển khai tại một doanh nghiệp duy nhất (Công ty Eresson).
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Tiếp tục theo dõi sự biến đổi các hợp chất bay hơi và chất lượng cảm quan của rượu whisky ngâm ủ với gỗ sồi S8 ở các mốc thời gian dài hơn (36, 48 và 60 tháng).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện vi khí hậu nhiệt đới gió mùa tại Việt Nam (nhiệt độ, độ ẩm nhà kho tàng trữ) đến tốc độ hao hụt và tương tác giữa rượu với gỗ sồi.
- Mở rộng ứng dụng chủng S. cerevisiae MS42 trên các nguồn tinh bột phụ phẩm nông nghiệp khác.
Giá trị tham khảo
Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp định danh nấm men kết hợp sinh học phân tử (MEGA 6), động học lên men kị khí, hóa sinh hệ enzyme amylase/protease và cơ chế hiệu ứng Pasteur trong chuyển hóa carbohydrate.
- Kỹ sư công nghệ thực phẩm và đồ uống: Cung cấp thông số vận hành thực tế cho quy trình mashing malt (4 nấc nhiệt độ), chế độ nấu ngô chịu áp lực (120°C, 15 × 10⁶ Pa), kỹ thuật sử dụng enzyme công nghiệp (Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase), kỹ thuật phân đoạn chưng cất 2 lần trên nồi đồng và chế độ ngâm ủ gỗ sồi.
- Doanh nghiệp sản xuất rượu bia: Tài liệu tham khảo trực tiếp cho các nhà máy muốn làm chủ công nghệ sản xuất whisky từ nguồn ngô và malt trong nước, giúp tính toán hiệu suất thu hồi (89,51 – 91,40%) và kiểm soát các chỉ tiêu an toàn thực phẩm (methanol, aldehyde, furfural).
Câu hỏi thường gặp
1. Chủng nấm men MS42 được phân lập từ đâu và có những đặc tính sinh học nổi bật nào?
Chủng nấm men MS42 được phân lập từ nguồn bánh men rượu truyền thống tại xã Mẫu Sơn, huyện Lộc Bình, tỉnh Lạng Sơn. Chủng được định danh khoa học là Saccharomyces cerevisiae MS42. Đặc tính nổi bật gồm: mật độ tế bào đạt 213 × 10⁶ – 215 × 10⁶ tế bào/ml sau 36 – 48 giờ nuôi cấy; sinh trưởng tối ưu ở pH 5,0 – 5,5, nhiệt độ 20 – 30°C; khả năng sinh cồn đạt 9,00 – 9,91% Vol trong dịch lên men có đường 160 – 180 g/l và có thể chịu cồn tối đa tới 12,3% Vol ở 25°C; hiệu suất lên men đạt 89,52 – 91,13%, hàm lượng tạp chất độc hại (methanol, acetaldehyde, furfural) rất thấp.
2. Sự khác biệt về hiệu ứng Pasteur giữa Saccharomyces cerevisiae và Candida tropicalis được luận án chỉ ra như thế nào?
Theo Bảng 1.3 của luận án, ở Candida tropicalis, sự chuyển hóa hiếu khí chiếm ưu thế rõ rệt: phần trăm ức chế quá trình lên men do hô hấp lên tới 97% và ức chế thủy phân đường có oxy là 73% (tốc độ lên men kị khí 150 – 200 nmol/g nhưng hiếu khí chỉ còn 5 nmol/g). Ngược lại, ở Saccharomyces cerevisiae, glucose ức chế các enzyme hô hấp khiến tốc độ sử dụng đường ít phụ thuộc vào oxy; phần trăm ức chế lên men do hô hấp chỉ là 12% và ức chế thủy phân đường có oxy chỉ là 9% (tốc độ lên men kị khí 160 nmol/g và hiếu khí vẫn duy trì ở mức cao 140 nmol/g). Do đó, hiệu ứng Pasteur ở S. cerevisiae rất yếu.
3. Quy trình đường hóa malt và nấu ngô được thiết lập với những thông số kỹ thuật nào?
- Dịch malt được đường hóa theo 4 nấc nhiệt độ: 45°C trong 30 phút (trương nở tinh bột), 52°C trong 40 phút (protease hoạt động giải phóng axit amin), 64°C trong 60 phút (amylase phân cắt tinh bột thành đường lên men), và 75°C trong 15 phút (bảo toàn hoạt tính α-amylase và thanh trùng). Tỷ lệ nước : malt là 4 : 1.
- Dịch ngô được nấu chín trong nồi chịu áp lực ở nhiệt độ 120°C, áp suất 15 × 10⁶ Pa trong thời gian 1,5 giờ; sau đó hạ nhiệt độ xuống 60 – 65°C để phối trộn enzyme Termamyl SC, Dextrozyme GA và Neutrase nhằm thủy phân tinh bột và protein, hạ độ nhớt và làm giàu axit amin tự do.
4. Loại gỗ sồi nào được tuyển chọn để tàng trữ rượu whisky và kết quả theo dõi ra sao?
Luận án tiến hành thử nghiệm ngâm ủ với 24 mẫu gỗ sồi khác nhau. Qua đánh giá cảm quan ở mốc 3 tháng và 180 ngày, mẫu gỗ sồi ký hiệu S8 nhập khẩu từ Mỹ được lựa chọn là tối ưu nhất. Kết quả đo mật độ quang OD420nm và phân tích sắc ký GC-MS qua 6, 12, 18 và 24 tháng cho thấy hàm lượng các hợp chất thơm (như vanillin, syringaldehyde, các ester thơm) tăng dần đều, tạo màu sắc và hương vị đặc trưng hài hòa, tiệm cận với các dòng whisky chuẩn quốc tế.
5. Kết quả ứng dụng sản xuất thử nghiệm tại doanh nghiệp đạt quy mô và tiêu chuẩn gì?
Quy trình công nghệ được ứng dụng thực tế tại Công ty cổ phần TNHH MTV Bia - Rượu Eresson Việt Nam với quy mô 10.000 lít. Ba sản phẩm được sản xuất gồm: Whisky 100% malt, Whisky 100% ngô, và Whisky Blend (20% malt + 80% ngô). Toàn bộ các lô sản phẩm đều đạt Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN) và Tiêu chuẩn an toàn thực phẩm đối với đồ uống có cồn của Việt Nam, đồng thời nhận được đánh giá cảm quan tích cực từ khách hàng thử nghiệm quốc tế tại Trung Quốc và Singapore.
Kết luận
Luận án của tác giả Nguyễn Văn Quyên đã giải quyết thành công các vấn đề khoa học và công nghệ trong sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch và ngô tại Việt Nam. Công trình đã tuyển chọn, định danh và làm sáng tỏ đặc tính sinh học của chủng nấm men bản địa Saccharomyces cerevisiae MS42, đồng thời xác lập hệ thống thông số kỹ thuật tối ưu cho quá trình đường hóa enzyme, lên men nồng độ cồn cao, chưng cất phân đoạn nồi đồng và tàng trữ 24 tháng với gỗ sồi S8. Kết quả sản xuất thử nghiệm 10.000 lít tại Công ty Bia - Rượu Eresson Việt Nam khẳng định tính khả thi cao trong việc làm chủ công nghệ sản xuất whisky thương phẩm đạt chuẩn an toàn thực phẩm, mở ra triển vọng tự chủ nguồn cung đồ uống cao độ và khai thác hiệu quả nguồn nông sản trong nước.