Tổng quan luận án

Tình trạng đề kháng kháng sinh (Antimicrobial Resistance - AMR) của vi sinh vật gây bệnh đang là một thách thức y tế và nông nghiệp trên phạm vi toàn cầu. Việc sử dụng kháng sinh phổ biến trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và thú y nhằm mục đích điều trị, phòng bệnh cũng như kích thích tăng trưởng đã thúc đẩy sự gia tăng các chủng vi khuẩn đề kháng. Theo ước tính được trích dẫn trong luận án, kháng kháng sinh có thể là nguyên nhân dẫn đến khoảng 10 triệu trường hợp tử vong mỗi năm vào năm 2050 và gây thiệt hại kinh tế vượt 100 nghìn tỷ USD trên toàn thế giới (O’Neill và ctv, 2016). Hàng năm, vi khuẩn Salmonella gây ra khoảng 93,8 triệu ca nhiễm trùng đường tiêu hóa và 155.000 ca tử vong trên thế giới, là tác nhân hàng đầu trong nhiều vụ ngộ độc thực phẩm quy mô lớn. Hiện nay, hơn 2.500 kiểu huyết thanh (serovar) Salmonella đã được xác định, trong đó hơn một nửa thuộc phân loài Salmonella enterica subsp. enterica, chiếm phần lớn các ca nhiễm ở người. Sự gia tăng của các chủng Salmonella đa kháng với nhiều nhóm kháng sinh quan trọng dùng trong lâm sàng như cephalosporin thế hệ 3 (ceftriaxone) và fluoroquinolone (ciprofloxacin) làm giảm hiệu quả điều trị và gia tăng nguy cơ tử vong (Divek và ctv, 2018).

Tại Việt Nam, hệ thống giám sát vi khuẩn Salmonella kháng kháng sinh trong thực phẩm chưa được thiết lập mang tính liên tục và đồng bộ; các dữ liệu nghiên cứu chủ yếu tập trung trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng ở người, trong khi nguồn thực phẩm lưu thông tại các chợ bán lẻ truyền thống chưa được khảo sát toàn diện. Đặc biệt, các công trình nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền phân tử, sự lưu hành của các gen kháng sinh và mối liên quan với các yếu tố di truyền di động như plasmid không tương hợp, integron và transposon của Salmonella phân lập từ thực phẩm tại Thành phố Hồ Chí Minh còn nhiều hạn chế. Xuất phát từ khoảng trống nghiên cứu và yêu cầu thực tiễn đó, luận án "Nghiên cứu tính kháng kháng sinh ở mức độ phân tử của Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh" được thực hiện tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP. HCM (CASE) phối hợp cùng Viện Y tế Công cộng TP. HCM và Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung cụ thể:

  1. Khảo sát tỷ lệ nhiễm, xác định mức độ nhạy với kháng sinh của Salmonella spp. phân lập từ các nhóm thực phẩm khác nhau tại các chợ bán lẻ trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh.
  2. Nghiên cứu các đặc điểm phân tử liên quan đến cơ chế kháng kháng sinh của Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm.
  3. Xác định và phân tích mối quan hệ giữa các nhóm gen kháng với sự hiện diện của integron, các vùng gen cassette, các plasmid không tương hợp đối với Salmonella spp. có kiểu hình đa kháng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập từ 4 nhóm thực phẩm tươi sống và sản phẩm chế biến gồm thịt (thịt heo, thịt bò, thịt gà), thủy hải sản (cá, tôm, mực), rau củ quả và trứng gia cầm.
  • Phạm vi không gian: 38 chợ bán lẻ thuộc 19 quận trung tâm trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh (gồm Quận 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, Bình Tân, Bình Thạnh, Gò Vấp, Phú Nhuận, Tân Bình, Thủ Đức và Tân Phú).
  • Phạm vi thời gian: Thời gian thu thập mẫu liên tục trong 12 tháng, từ tháng 09/2019 đến tháng 09/2020. Các mẫu được thu thập ngẫu nhiên vào khung giờ từ 08h00 đến 09h00 sáng. Tổng số mẫu thu thập và phân tích là 1.520 mẫu (380 mẫu cho mỗi nhóm thực phẩm).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng hợp bức tranh dịch tễ học và cơ chế kháng kháng sinh của Salmonella thông qua các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế:

Về tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm trên thế giới: Báo cáo của Cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu (EFSA) và Trung tâm Phòng chống Dịch bệnh châu Âu (ECDC) năm 2018 cho thấy gần một phần ba số vụ ngộ độc thực phẩm tại châu Âu do Salmonella gây ra (chủ yếu tại Slovakia, Tây Ban Nha, Ba Lan liên quan đến trứng). Nghiên cứu của Lai và ctv (2014) tại tỉnh Sơn Đông (Trung Quốc) giai đoạn 2009–2012 ghi nhận 50/692 mẫu thịt heo nhiễm Salmonella, phổ biến nhất là S. Derby (58%), S. Typhimurium (18%) và S. Enteritidis (12%) với hơn 99% chủng kháng ít nhất một kháng sinh. Tại Tô Giang (Trung Quốc), 154/1096 mẫu thịt heo dương tính với 14 serovar (S. Derby chiếm 47,9%). Tại Romania (2011), 149/650 mẫu thịt gà và thịt heo nhiễm Salmonella. Tadee và ctv (2014) ghi nhận tỷ lệ nhiễm tại các lò mổ ở Chiang Mai và Lamphun (Thái Lan) là 11,85%.

Về tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm tại Việt Nam: Số liệu Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm giai đoạn 2000–2007 (Bộ Y tế, 2008) chỉ ra nguyên nhân do vi sinh vật chiếm 43,20% các vụ ngộ độc. Phạm Hồng Ngân và ctv (2014) phát hiện tỷ lệ nhiễm trên thịt heo tại Gia Lâm là 46,7% (dao động 30,0%–66,7%). Lê Hữu Nghị và Tăng Mạnh Nhật (2005) ghi nhận 25,00% mẫu thịt bò và heo tại chợ Đông Ba và Tây Lộc (Huế) nhiễm khuẩn. Võ Thị Trà An và ctv (2006) ghi nhận tỷ lệ nhiễm trên thân thịt heo là 55,90% và thịt gà là 64,00%. Viện Pasteur TP. HCM khảo sát 1.150 mẫu thịt tươi sống, phát hiện 385 mẫu nhiễm (thịt heo gần 40%, thịt gà hơn 35%, thịt bò gần 31%). Lê Văn Du và Hồ Thị Kim Hoa (2017) kiểm tra 150 mẫu thịt tại TP. HCM, ghi nhận 40,67% nhiễm Salmonella (thịt heo 43,75%, gà 37,14%). Nguyễn Thanh Long (2015) ghi nhận tỷ lệ trên thịt heo và gà bán tại chợ lần lượt là 43,3% và 41,6%.

Về thực trạng sử dụng và tồn dư kháng sinh: Carrique-Mas (2015) ước tính ngành chăn nuôi gà tại Việt Nam sử dụng 42,2 tấn kháng sinh/năm (95% CI: 26,2–58,2) và chăn nuôi heo sử dụng 981,3 tấn/năm (95% CI: 616,5–1346,0), tổng cộng 1.023,5 tấn/năm (95% CI: 642,8–1404,2). Lã Văn Kính (2007) tại Bình Dương ghi nhận 53,9% thức ăn chăn nuôi chứa chlortetracycline với nồng độ 140–275 ppm. Chi cục Thú y TP. HCM ghi nhận tỷ lệ mẫu thịt tồn dư tetracycline từ năm 2012 đến 2015 dao động từ 2,33% đến 25,53%. Chử Văn Tuất và ctv (2016) phát hiện dư lượng enrofloxacin (128,7–1161,0 µg/kg) trong 19/66 mẫu thịt gà. Lê Văn Du và Hồ Thị Kim Hoa (2017) ghi nhận sulfadimidine trong 17,5% mẫu thịt heo, norfloxacin vượt ngưỡng MRL trong 3,75% mẫu, enrofloxacin trong 32,86% mẫu gà và florfenicol trong 27,14% mẫu gà.

Về mức độ kháng kháng sinh và đặc điểm phân tử: Tỷ lệ đa kháng của các chủng Salmonella không gây sốt thương hàn (NTS) tăng cao kể từ khi xuất hiện chủng S. Typhimurium DT104 vào năm 1990 (Helms và ctv, 2005; Crump và ctv, 2011). Tại Việt Nam, Chau và ctv (2007) ghi nhận tỷ lệ S. Typhi kháng axit nalidixic tăng từ 4% (1993) lên 97% (2005). Thai và ctv (2012) ghi nhận Salmonella từ thịt bò tại Hà Nội kháng tetracycline (46,0%), sulfamethoxazole/trimethoprim (39,7%), ampicillin (31,7%), streptomycin (30,2%). Thai và Yamaguchi (2012) phát hiện 14/17 gen kháng kháng sinh trên các chủng phân lập từ thịt gà, gồm blaTEM, blaOXA-1, blaPSE1, aadA1, sul1, tetA, tetB, tetG, cmlA1, floR, dfrA1, dfrA12, aac(3)-IV, aphA1-1AB. Nguyen và ctv (2016) khảo sát 409 mẫu thịt và hải sản tại TP. HCM, ghi nhận 62,2% chủng kháng kháng sinh, 41,1% đa kháng, đặc biệt các serovar S. Schwarzengrund, S. Indiana, S. Newport, S. Saintpaul kháng tới 6 nhóm kháng sinh. Lê Văn Du và ctv (2017) phát hiện 87,18% chủng Salmonella mang gen kháng sinh, trong đó 53,85% mang đồng thời gen sinh ESBL (blaTEM) và gen kháng quinolone trên plasmid (qnrS). Hoàng Hoài Phương và ctv (2008) ghi nhận tỷ lệ mang gen blaTEM (90,9%), sul2 (72,7%), tetA, tetB, sul1 (63,6%), cmlA (45,5%), blaSHV (18,2%).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã phản ánh thực trạng nhiễm và mức độ đề kháng kiểu hình, việc làm sáng tỏ cơ chế phân tử đồng thời ở nhiều cấp độ—bao gồm việc phân loại 18 nhóm plasmid không tương hợp, xác định cấu trúc integron nhóm 1, 2, 3 cùng các gen cassette, nhận diện đột biến điểm trên các gen sinh enzym ESBL, enzym biến đổi aminoglycoside, bơm đẩy phenicol/tetracycline, đột biến vùng QRDR (gyrA, parC) và giải trình tự toàn bộ hệ gen (NGS/MLST) để phát hiện yếu tố chuyển vị—chưa được thực hiện một cách có hệ thống trên nguồn thực phẩm lưu thông tại TP. HCM. Luận án được định vị nhằm giải quyết toàn diện các khoảng trống phân tử này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Phân loại học vi khuẩn: Dựa trên cấu trúc kháng nguyên O (lipopolysaccharide) và kháng nguyên H (flagellar) theo sơ đồ phân loại Kauffmann-White (Achtman và ctv, 2012).
  • Cơ chế kháng kháng sinh phân tử:
    • Kháng β-lactam: Thủy phân vòng β-lactam bởi enzyme β-lactamase (phân loại Ambler nhóm A, B, C, D; các họ gen blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaCMY-2).
    • Kháng aminoglycoside: Enzyme biến đổi kháng sinh gồm acetyltransferase (AAC), phosphotransferase (APH - strA, strB), nucleotidyltransferase (ANT - aadA, aadB).
    • Kháng phenicol: Bơm đẩy chủ động mã hóa bởi gen floR, cmlA, cmlB hoặc enzym chloramphenicol acetyltransferase (cat).
    • Kháng quinolone: Đột biến điểm trong vùng xác định kháng quinolone (QRDR) của gen mã hóa DNA gyrase (gyrA, gyrB) và topoisomerase IV (parC, parE), hoặc qua trung gian plasmid (PMQR).
    • Kháng tetracycline: Hệ thống bơm ngược chủ động (tetA, tetB, tetC, tetG) hoặc protein bảo vệ ribosome (tetM, tetO/W).
    • Kháng sulfonamide/trimethoprim: Biến đổi enzyme đích dihydropteroate synthetase (sul1, sul2, sul3) và dihydrofolate reductase (dfr, dhfr).
  • Yếu tố di truyền di động (MGEs):
    • Plasmid không tương hợp: Phân nhóm dựa trên cấu trúc sao chép replicon (IncF, IncI, IncP, IncA/C, IncHI1, IncHI2, IncN, IncT, IncW, IncX, IncY, v.v.) theo Carattoli và ctv (2005).
    • Integron và Gen cassette: Integron nhóm 1 (vùng 5'-CS chứa intI1, attI1, promoter Pc; vùng 3'-CS chứa qacEΔ1, sul1, orf5, orf6), integron nhóm 2 (liên kết transposon Tn7, chứa gen intI2), integron nhóm 3, cùng các cấu trúc cassette kháng sinh gắn tại vị trí attI (Stokes và Hall, 1989; Partridge và ctv, 2009; Cambray và ctv, 2010).
    • Transposon: Các yếu tố chuyển vị mang gen kháng (ví dụ transposon Tn21).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp giữa phương pháp vi sinh vật học chuẩn hóa và các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại:

  1. Phương pháp xác định cỡ mẫu và lấy mẫu:

    • Cỡ mẫu tối thiểu được tính theo công thức: $$n = \frac{z^2 \cdot p \cdot (1-p)}{e^2}$$ Với $z = 1,96$ (độ tin cậy 95%), mức chính xác $e = 0,05$, tỷ lệ ước tính $p = 0,4$ (dựa trên nghiên cứu của Lê Văn Du và Hồ Thị Kim Hoa, 2017 có tỷ lệ 43,75%). Cỡ mẫu tính toán $n \ge 376$. Nghiên cứu đã thu thập 380 mẫu cho mỗi nhóm thực phẩm, tổng cộng 1.520 mẫu.
    • Thu mẫu thực hiện theo Thông tư 14/2011/TT-BYT tại 38 chợ bán lẻ thuộc 19 quận tại TP. HCM. Mẫu được bảo quản lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 04 giờ.

  2. Phương pháp phân lập, định danh và xác định serovar:

    • Quy trình phân lập theo tiêu chuẩn ISO 6579-1:2017: Đồng nhất 25 g mẫu với 225 mL nước đệm peptone (BPW), ủ 34–38°C trong 18±2 giờ; tăng sinh chọn lọc trên môi trường canh thang RVS (41,5°C trong 24±3 giờ) và MKTTn (37°C trong 24±3 giờ); phân lập trên đĩa thạch XLD và BPLS (37°C trong 24±3 giờ); khẳng định sinh hóa và phản ứng tự ngưng kết.
    • Xác định serovar theo tiêu chuẩn ISO/TR 6579-3:2014: Ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh O đa giá (OMA, OMB, OMC), O đơn giá, H đa giá, H đơn giá; xác định kháng nguyên H pha 2 bằng kỹ thuật ức chế pha 1 trên môi trường thạch Sven Gard bổ sung Anti Sven Gard Serum (SG1–SG6). Chủng vi khuẩn được kiểm chứng khẳng định tại Viện Y tế Công cộng TP. HCM.

  3. Khảo sát tính nhạy với kháng sinh:

    • Phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer theo tiêu chuẩn Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI 2018) trên thạch Mueller-Hinton, sử dụng huyền phù vi khuẩn độ đục 0,5 McFarland.
    • Thử nghiệm 11 loại kháng sinh thuộc 6 nhóm (Bảng 1).
STT Nhóm kháng sinh Tên kháng sinh Ký hiệu Hàm lượng khoanh giấy
1 Penicillin (β-Lactam) Amoxicillin/Clavulanic acid AMC 20/10 µg
2 Penicillin (β-Lactam) Ampicillin AMP 10 µg
3 Cephalosporin (β-Lactam) Ceftazidime CAZ 30 µg
4 Phenicol Chloramphenicol C 30 µg
5 Quinolone Axit Nalidixic NA 30 µg
6 Quinolone Ciprofloxacin CIP 5 µg
7 Quinolone Ofloxacin OFX 5 µg
8 Aminoglycoside Gentamycin GM 10 µg
9 Aminoglycoside Streptomycin STR 10 µg
10 Tetracycline Tetracycline TE 30 µg
11 Sulfonamide Sulfamethoxazole/Trimethoprim SXT 1,25/23,75 µg
  1. Phương pháp sinh học phân tử:
    • Tách chiết DNA: Sử dụng Genomic DNA Purification Kit (Norgen Biotek), PrimePrep Plasmid DNA Isolation Kit (GeNet Bio), AccuRive pDNA Prep Kit (KT Biotech).
    • Phát hiện Salmonella spp. bằng kỹ thuật s-PCR khuếch đại gen đặc hiệu invA (520 bp) theo TCVN 8342:2012 / TCVN 4832:2012.
    • Khảo sát 18 nhóm plasmid không tương hợp bằng 5 phản ứng multiplex-PCR (m-PCR 1: HI1, HI2, I1; m-PCR 2: X, L/M, N; m-PCR 3: FIA, FIB, W; m-PCR 4: Y, P, FIC; m-PCR 5: A/C, T, FIIA) và 3 phản ứng simplex-PCR (s-PCR 2: F; s-PCR 3: K/B; s-PCR 4: B/O) theo Carattoli và ctv (2005).
    • Khảo sát integron và gen cassette: Xác định integron nhóm 1 (intI1, 164 bp), nhóm 2 (intI2, 233 bp), nhóm 3 (intI3, 600 bp) bằng m-PCR 6 (Asgharpour và ctv, 2018); khuếch đại vùng gen cassette của integron 1 bằng s-PCR 5 (cặp mồi 5'CS/3'CS) và integron 2 bằng s-PCR 6 (cặp mồi hep51/hep74) (Kaushik và ctv, 2019).
    • Khảo sát các gen kháng kháng sinh: Gồm m-PCR 7 (blaTEM, blaSHV, blaCTX), m-PCR 8 (tetA, tetB), s-PCR 7 (tetC), m-PCR 9 (cmlA, cmlB, flo), m-PCR 10 (sul1, sul2), m-PCR 11 (strA, strB), m-PCR 12 (aadA2, aadB), m-PCR 13 (gyrA, gyrB), m-PCR 14 (parC, parE).
    • Chủng chuẩn đối chứng: E. coli ATCC 25922; S. Typhimurium ATCC 14028; S. Paratyphi ATCC 13428; S. Kentucky SA12/19 1600, SA11/19 3497, SA07/20 1066, SA07/20 1067; hỗn hợp DNA chuẩn sinh ESBL từ Viện Y tế Công cộng TP. HCM.
    • Giải trình tự thế hệ mới (NGS): Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) tại Công ty TNHH Khoa học KTEST, lắp ráp de novo contigs, phân tích kiểu chuỗi đa locus (MLST) xác định serotype, phân tích đột biến điểm và yếu tố chuyển vị.
    • Xử lý số liệu: Thống kê mô tả (tần số, tỷ lệ phần trăm) và kiểm định chi bình phương bằng phần mềm SPSS 20 và Microsoft Excel 2019.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu làm rõ tính cấp thiết của đề tài trong bối cảnh lạm dụng kháng sinh nông nghiệp và gia tăng nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn đa kháng qua chuỗi thực phẩm. Xác định rõ ràng đối tượng, 3 mục tiêu nghiên cứu và các đóng góp mới của luận án đối với cơ sở dữ liệu vi sinh vật học thực phẩm và sinh học phân tử tại Việt Nam.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế về 14 nội dung trọng tâm:

  • Thực trạng ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm tại các khu vực trên thế giới (châu Âu, Trung Quốc, Thái Lan, Romania) và tại các tỉnh thành Việt Nam.
  • Mức độ sử dụng, tiêu thụ kháng sinh hàng năm trong chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam và thực trạng tồn dư kháng sinh (tetracycline, fluoroquinolone, phenicol, sulfonamide) vượt ngưỡng giới hạn cho phép trong thịt thương phẩm.
  • Diễn biến đề kháng kháng sinh của Salmonella, đặc biệt là các dòng S. Typhi H58 và S. Typhimurium DT104 đa kháng.
  • Đặc điểm sinh học hoàn chỉnh của Salmonella: Trực khuẩn Gram âm, không tạo nha bào, có 7–12 lông di động; đặc tính nuôi cấy hiếu khí/kỵ khí tùy tiện, ức chế bởi 3%–4% NaCl; đặc tính sinh hóa (lên men glucose, mannitol, maltose, không lên men lactose/saccharose, catalase dương tính, oxidase âm tính, đa số sinh H2S).
  • Cấu trúc hệ gen Salmonella: Kích thước 3,39 đến 5,59 Mb, chứa khoảng 4.500 gen, sở hữu từ 1 đến 2 plasmid kích thước 2 đến 200 kb; vai trò của 23 đảo gây bệnh (SPI), đặc biệt là SPI-1 và SPI-2, cùng các đảo bộ gen (GI) trong việc thu nhận gen ngoại lai qua truyền gen ngang.
  • Chi tiết cơ chế phân tử của 6 nhóm kháng sinh: aminoglycoside (3 nhóm enzym AAC, APH, ANT mã hóa bởi aac, aph, aad), β-lactam (phân loại Ambler, các họ gen blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaCMY-2), phenicol (bơm đẩy floR, enzym biến đổi cmlA, cmlB), quinolone (đột biến gyrA, gyrB, parC, parE và bơm đẩy AcrAB-TolC), tetracycline (hơn 40 gen tet, otr, tcr), sulfonamide/trimethoprim (sul1, sul2, sul3, dfr, dhfr).
  • Cấu trúc và cơ chế phát tán gen kháng qua các yếu tố di truyền di động: Plasmid mạch vòng/mạch hở, plasmid không tương hợp (các nhóm Inc); cấu tạo integron nhóm 1 (vùng 5'-CS, 3'-CS và gen cassette), nhóm 2 (liên kết transposon Tn7), nhóm 3, 4, 5 và cơ chế bắt giữ gen cassette tại vị trí tái tổ hợp attI nhờ enzyme integrase (intI).

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, địa điểm, hóa chất, chủng chuẩn và thiết bị:

  • Danh mục 38 chợ bán lẻ thuộc 19 quận trung tâm tại TP. HCM phục vụ thu thập 1.520 mẫu thực phẩm (Bảng 2).
  • Quy trình phân lập vi sinh vật chuẩn hóa theo ISO 6579-1:2017 và xác định huyết thanh theo ISO/TR 6579-3:2014.
  • Kháng sinh đồ khuếch tán đĩa thạch trên 11 loại kháng sinh theo CLSI 2018.
  • Quy trình chi tiết 14 phản ứng multiplex-PCR và simplex-PCR bao gồm thành phần phản ứng (Master mix 2X, 2 UI Taq polymerase, mồi 0,5 µM, 50 ng DNA khuôn) và chu trình luân nhiệt cụ thể (Bảng 3).
  • Kỹ thuật điện di gel agarose 1,5%, chụp ảnh gel UV và quy trình giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), lắp ráp contigs và MLST.
STT Quận Địa điểm chợ lấy mẫu
01 Quận 1 Tân Định; Thái Bình
02 Quận 2 An Khánh; Đo Đạc
03 Quận 3 Vườn Chuối; Bùi Phát
04 Quận 4 Xóm Chiếu; Tôn Thất Thuyết
05 Quận 5 Bầu Sen; Phùng Hưng
06 Quận 6 Phú Lâm; An Dương Vương
07 Quận 7 Tân Mỹ; Tân Quy
08 Quận 8 Phạm Thế Hiển; Nhị Thiên Đường
09 Quận 9 Phước Long B; Hiệp Phú
10 Quận 10 Nguyễn Tri Phương; Hòa Hưng
11 Quận 11 Thiếc; Lãnh Binh Thăng
12 Quận 12 Hiệp Thành; Ngã Tư Ga
13 Quận Bình Tân An Lạc; Kiến Đức 2
14 Quận Bình Thạnh Bà Chiểu; Thị Nghè
15 Quận Gò Vấp Gò Vấp; Xóm Mới
16 Quận Phú Nhuận Phú Nhuận; Chợ Mới
17 Quận Tân Bình Tân Bình; Hoàng Hoa Thám
18 Quận Thủ Đức Thủ Đức; Linh Xuân
19 Quận Tân Phú Tân Hương; Hiệp Tân
Mục tiêu gen / Phản ứng Tên mồi Trình tự mồi (5'–3') Kích thước (bp) Tài liệu nguồn
invA (s-PCR 1) InvA1
InvA2		 TTGTTACGGCTATTTTGACCA
CTGACTGCTACCTTGGCTGATG		 520 TCVN 8342:2012
Integron nhóm 1 (m-PCR 6) Int1 F
Int1 R		 CAGTGGACATAAGCCTGTTC
CCCGAGGCATAGACTGTA		 164 Asgharpour và ctv, 2018
Integron nhóm 2 (m-PCR 6) Int2 F
Int2 R		 TTATTGCTGGGATTAGGC
ACGGCTACCCTCTGTTATC		 233 Asgharpour và ctv, 2018
Integron nhóm 3 (m-PCR 6) Int3 F
Int3 R		 AGTGGGTGGCGAATGAGTG
TGTTCTTGTATCGGCAGGTG		 600 Asgharpour và ctv, 2018
Cassette integron 1 (s-PCR 5) 5'CS
3'CS		 GGCATCCAAGCAGCAAG
AAGCAGACTTGACCTGA		 Biến đổi Kaushik và ctv, 2019
Cassette integron 2 (s-PCR 6) hep51
hep74		 GATGCCATCGCAAGTACGAG
CGGGATCCCGGACGGCATGCACGATTTGTA		 Biến đổi Kaushik và ctv, 2019
blaTEM (m-PCR 7) blaTEM F
blaTEM R		 GGTCGCCGCATACACTATTCTC
TTTATCCGCCTCCATCCAGTC		 372 Quoc và ctv, 2015
blaSHV (m-PCR 7) blaSHV F
blaSHV R		 CCAGCAGGATCTGGTGGACTAC
CCGGGAAGCGCCTCAT		 231 Quoc và ctv, 2015
blaCTX (m-PCR 7) blaCTX F
blaCTX R		 CCCATGGTTAAAAAACACTGC
CAGCGCTTTTGCCGTCTAAG		 950 Ghazaei, 2018
tetA (m-PCR 8) tetA F
tetA R		 GGCCTCAATTTCCTGACG
AAGCAGGATGTAGCCTGTGC		 372 Guillaume và ctv, 2000
tetB (m-PCR 8) tetB F
tetB R		 GAGACGCAATCGAATTCGG
TTTAGTGGCTATTCTTCCTGCC		 228 Guillaume và ctv, 2000
tetC (s-PCR 7) tetC F
tetC R		 TCCTTGCATGCACCATTCC
AACCCGTTCCATGTGCTCG		 635 Guillaume và ctv, 2000
cmlA (m-PCR 9) cmlA F
cmlA R		 CGCCACGGTGTTGTTGTTAT
GCGACCTGCGTAAATGTCAC		 394 Chen và ctv, 2004
cmlB (m-PCR 9) cmlB F
cmlB R		 ACTCGGCATGGACATGTACT
ACGGACTGCGGAATCCATAG		 840 Chen và ctv, 2004
flo (m-PCR 9) flo F
flo R		 CTGAGGGTGTCGTCATCTAC
GCTCCGACAATGCTGACTAT		 673 Chen và ctv, 2004
sul1 (m-PCR 10) sul1 F
sul1 R		 TCACCGAGGACTCCTTCTTC
CAGTCCGCCTCAGCAATATC		 331 Chen và ctv, 2004
sul2 (m-PCR 10) sul2 F
sul2 R		 CCTGTTTCGTCCGACACAGA
GAAGCGCAGCCGCAATTCAT		 435 Chen và ctv, 2004
strA (m-PCR 11) strA F
strA R		 CCAATCGCAGATAGAAGGC
CTTGGTGATAACGGCAATTC		 608 Doosti và ctv, 2016
strB (m-PCR 11) strB F
strB R		 GGATCGTAGAACATATTGGC
ATCGTCAAGGGATTGAAACC		 256 Doosti và ctv, 2016
aadA2 (m-PCR 12) aadA2 F
aadA2 R		 ATTTGCTGGTTACGGTGACC
CTTCAAGTATGACGGGCTGA		 431 Doosti và ctv, 2016
aadB (m-PCR 12) aadB F
aadB R		 CTAGCTGCGGCAGATGAGC
CTCAGCCGCCTCTGGGCA		 219 Doosti và ctv, 2016
gyrA (m-PCR 13) gyrA F
gyrA R		 CGTTGGTGACGTAATCGGTA
CCGTACCGTCATAGTTATCC		 251 Eaves và ctv, 2002
gyrB (m-PCR 13) gyrB F
gyrB R		 GCGCTGTCCGAACTGTACCT
TGATCAGCGTCGCCACTTCC		 181 Eaves và ctv, 2002
parC (m-PCR 14) parC F
parC R		 CTATGCGATGTCAGAGCTGG
TAACAGCAGCTCGGCGTATT		 270 Eaves và ctv, 2004
parE (m-PCR 14) parE F
parE R		 TCTCTTCCGATGAAGTGCTG
ATACGGTATAGCGGCGGTAG		 240 Eaves và ctv, 2004

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả phân tích định lượng và sinh học phân tử:

  • Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trên các nhóm thực phẩm: Trong tổng số 1.520 mẫu khảo sát, có 256 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ chung 16,84%. Phân bố tỷ lệ nhiễm giữa các nhóm thực phẩm thể hiện sự khác biệt rõ rệt (Bảng 4). Nhóm mẫu thịt có tỷ lệ nhiễm cao nhất đạt 43,16% (164/380), kế tiếp là nhóm thủy hải sản đạt 23,95% (91/380), nhóm rau củ quả có tỷ lệ rất thấp 0,26% (01/380), và chưa ghi nhận mẫu nào thuộc nhóm trứng bị nhiễm Salmonella (0,00%).
Nhóm thực phẩm Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ nhiễm (%)
Thịt (heo, bò, gà) 380 164 43,16%
Thủy hải sản (cá, tôm, mực) 380 91 23,95%
Rau củ quả 380 1 0,26%
Trứng gia cầm 380 0 0,00%
Tổng cộng 1.520 256 16,84%
  • Kiểu hình kháng kháng sinh của 150 chủng Salmonella thử nghiệm:
    • Các kháng sinh có tỷ lệ đề kháng cao gồm: tetracycline (TE), ampicillin (AMP), streptomycin (STR), chloramphenicol (C) và sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT), với tỷ lệ kháng dao động từ 34,67% đến 52,00%.
    • Ngược lại, mức độ nhạy cảm cao nhất được ghi nhận đối với ceftazidime (CAZ) với 96,00% chủng nhạy cảm.
  • Định danh serovar và đặc điểm đa kháng: Từ 21 chủng Salmonella spp. có kiểu hình đa kháng, đã định danh được 07 serovar chính gồm: S. Kentucky, S. Potsdam, S. Infantis, S. Saintpaul, S. Braenderup, S. Agona, S. Indiana cùng hai kiểu huyết thanh chưa đầy đủ công thức là 7:1,z6:UT và OMF:1,z6:UT.
  • Sự hiện diện của các nhóm integron và gen cassette trên 21 chủng đa kháng:
    • Integron nhóm 1 xuất hiện ở 100% (21/21) chủng.
    • Integron nhóm 2 xuất hiện ở 52,38% (11/21) chủng.
    • Integron nhóm 3 xuất hiện ở 100% (21/21) chủng.
    • Tỷ lệ chủng mang đồng thời cả ba nhóm integron (nhóm 1, 2 và 3) đạt 52,38% (11/21).
    • Khảo sát vùng gen cassette cho thấy 85,71% chủng dương tính với cassette thuộc integron 1 và 72,73% dương tính với cassette thuộc integron 2.
  • Sự phân bố các nhóm plasmid không tương hợp: 100% các serovar đa kháng đều mang plasmid không tương hợp. Số lượng plasmid biến thiên tùy theo serovar (Bảng 5). Serovar mang nhiều plasmid nhất là S. Kentucky (08 plasmid), tiếp theo là S. Potsdam (07 plasmid), các serovar S. Infantis, S. Saintpaul, S. Braenderup, S. Agona và chủng 7:1,z6:UT cùng mang 05 plasmid; serovar S. Indiana và chủng OMF:1,z6:UT mang 04 plasmid.
STT Tên serovar / Kiểu huyết thanh Số lượng plasmid không tương hợp phát hiện
1 Salmonella Kentucky 08
2 Salmonella Potsdam 07
3 Salmonella Infantis 05
4 Salmonella Saintpaul 05
5 Salmonella Braenderup 05
6 Salmonella Agona 05
7 Salmonella 7:1,z6:UT 05
8 Salmonella Indiana 04
9 Salmonella OMF:1,z6:UT 04
  • Sự hiện diện của các gen kháng kháng sinh và đột biến phân tử:
    • Gen sinh β-lactamase phổ rộng (ESBL): Gen blaTEM chiếm tỷ lệ cao nhất 52,38%, phát hiện đột biến tại vị trí codon 90 (Asp90Gly) trên chủng SA11/19 3497. Gen blaCTX chiếm tỷ lệ 19,05%, phát hiện đột biến tại vị trí codon 80 (Ala80Val) trên ba chủng SA07/20 1066, SA07/20 1067 và SA12/19 1600.
    • Gen kháng quinolone: Phát hiện các đột biến điểm trên gen gyrA tại vị trí Ser83Phe và Asp87Asn; trên gen parC tại các vị trí Thr57Ser, Ser80Ile, Ser395Asn, Ala469Ser và Thr620Ala.
    • Gen kháng tetracycline (tetA, tetB, tetC), phenicol (cmlA, cmlB, flo), aminoglycoside (strA, strB, aadA2, aadB) và sulfonamide (sul1, sul2).
    • Yếu tố di truyền chuyển vị: Kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS/MLST) ghi nhận tính đa kháng của Salmonella enterica subsp. serovar Kentucky có liên quan đ