Tổng quan nghiên cứu

Rượu truyền thống Việt Nam là loại đồ uống có cồn phổ biến, chiếm khoảng 80% tổng số các loại đồ uống có cồn trong nước. Sản xuất rượu truyền thống dựa trên quá trình lên men sinh học phức tạp, trong đó hệ vi sinh vật đóng vai trò trung tâm, đặc biệt là các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae. Tuy nhiên, sự đa dạng và đặc tính sinh học của các chủng nấm mốc này trong bánh men rượu truyền thống Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu sâu rộng. Việc xác định và đánh giá hoạt tính thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc này là cần thiết để kiểm soát chất lượng và nâng cao hiệu quả sản xuất rượu.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập, phân loại các chủng nấm mốc họ Mucoraceae từ bánh men rượu truyền thống Việt Nam, đánh giá hoạt tính enzyme amylase và khả năng thủy phân tinh bột của chúng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau, đồng thời thử nghiệm sử dụng chủng thuần kết hợp với nấm men thuần để lên men rượu và phân tích phổ hương rượu bằng phương pháp sắc ký khí kết nối khối phổ (GCMS). Nghiên cứu được thực hiện trên 15 mẫu bánh men thu thập từ các tỉnh Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên và Bắc Giang trong năm 2019.

Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ vai trò của các chủng nấm mốc họ Mucoraceae trong quá trình thủy phân tinh bột và lên men rượu truyền thống Việt Nam, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc cải tiến quy trình sản xuất rượu truyền thống, nâng cao chất lượng sản phẩm và phát triển ngành công nghiệp rượu truyền thống bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết enzyme amylase trong thủy phân tinh bột: Amylase gồm ba loại chính là α-amylase, β-amylase và γ-amylase, có khả năng cắt liên kết glycosidic α-1,4 và α-1,6 trong tinh bột để tạo thành các phân tử đường khử như glucose, maltose và dextrin. Trong đó, α-amylase đóng vai trò chủ đạo trong giai đoạn dextrin hóa, β-amylase cắt từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide, còn γ-amylase có hoạt tính cao trong môi trường acid.

  • Mô hình lên men rượu truyền thống: Quá trình lên men gồm hai giai đoạn chính là đường hóa (thủy phân tinh bột thành đường khử) và lên men rượu (chuyển hóa đường thành ethanol). Hệ vi sinh vật gồm nấm mốc (chủ yếu sinh enzyme amylase), nấm men (chủ yếu Saccharomyces cerevisiae) và vi khuẩn lactic phối hợp trong quá trình này.

  • Khái niệm về đa dạng vi sinh vật trong bánh men: Bánh men chứa hệ vi sinh vật đa dạng với mật độ từ 10^3 đến 10^7 CFU/g, trong đó nấm mốc họ Mucoraceae chiếm ưu thế, cùng với các loài nấm men và giả men khác.

  • Phương pháp phân tích sắc ký khí kết nối khối phổ (GCMS): Phương pháp HS-SPME GCMS được sử dụng để chiết tách và phân tích các hợp chất bay hơi tạo hương trong rượu, giúp định tính và bán định lượng các thành phần tạo mùi đặc trưng.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: 15 mẫu bánh men rượu truyền thống thu thập từ nhiều tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam, cùng với các chủng nấm mốc và nấm men thuần chủng từ Viện Công nghiệp Thực phẩm.

  • Phương pháp phân lập và giữ giống: Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu, nuôi cấy trên môi trường Malt 2ºBx ở 30ºC trong điều kiện hiếu khí. Chủng nấm mốc được làm sạch, giữ giống bằng phương pháp bảo quản cát khô, nấm men và giả men được bảo quản lạnh sâu.

  • Phân loại và định danh chủng: Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào dưới kính hiển vi; phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting sử dụng mồi MST2 (GAC)5; định danh chủng dựa trên đọc trình tự vùng ITS và D1/D2 của rDNA.

  • Đánh giá hoạt tính enzyme amylase: Chiết enzyme từ dịch nuôi cấy nấm mốc trên cơ chất tinh bột, đo hoạt tính bằng phương pháp DNS xác định lượng đường khử tạo thành, biểu thị bằng IU/ml.

  • Kiểm tra khả năng chịu nhiệt: Nuôi cấy các chủng nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ từ 25ºC đến 50ºC, đo đường kính khuẩn lạc để đánh giá sự phát triển.

  • Thí nghiệm thủy phân tinh bột trong môi trường có đường: Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase khi có sẵn glucose ở các nồng độ khác nhau (0%, 0.5%, 1%, 2%) bằng phương pháp nhuộm lugol.

  • Thử nghiệm lên men rượu: Sử dụng các chủng nấm mốc thuần chủng có hoạt tính amylase cao kết hợp với nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc giả men Saccharomycopsis fibuligera để lên men cơm gạo hấp chín, đo nồng độ cồn bằng sôi kế.

  • Phân tích phổ hương rượu: Sử dụng phương pháp HS-SPME GCMS để phân tích các hợp chất bay hơi trong 32 mẫu rượu chưng cất, bao gồm 26 mẫu thu thập và 6 mẫu lên men từ chủng thuần, phân nhóm mẫu theo thứ bậc bằng phần mềm ORANGE.

  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2019, từ thu thập mẫu, phân lập, phân tích đến thử nghiệm lên men và phân tích hóa học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Đa dạng chủng nấm mốc họ Mucoraceae trong bánh men: Từ 15 mẫu bánh men, phân lập được 101 chủng vi nấm, trong đó 73 chủng là nấm mốc thuộc họ Mucoraceae, chiếm đa số. Các loài phổ biến gồm Rhizopus oryzae (27 chủng), Rhizopus microsporus (26 chủng), Mucor indicus (11 chủng), Mucor circinelloides (3 chủng), Lichtheimia ramosa (3 chủng), Cunninghamella echinulata (2 chủng) và Cunninghamella bertholletiae (1 chủng).

  2. Hoạt tính enzyme amylase cao nhất thuộc nhóm Rhizopus oryzae: Hoạt tính amylase của các chủng R. oryzae dao động từ khoảng 59,56 đến 190,01 IU/ml, vượt trội so với các nhóm khác. Nhóm R. microsporus có hoạt tính thấp hơn nhiều, trong khoảng 3,29-33,22 IU/ml, còn các loài Mucor có hoạt tính rất thấp, chỉ khoảng 1-2 IU/ml, tương đương chủng đối chứng Cunninghamella echinulata.

  3. Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm mốc: Rhizopus microsporus có khả năng sinh trưởng và tiết enzyme amylase ở nhiệt độ cao lên đến 45-50ºC, trong khi Rhizopus oryzae phát triển tốt ở nhiệt độ phòng 30-35ºC. Điều này cho thấy sự thích nghi khác nhau của các chủng trong quá trình lên men.

  4. Khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường có đường: Một số chủng nấm mốc, đặc biệt là R. oryzae, vẫn duy trì khả năng sinh enzyme amylase và thủy phân tinh bột ngay cả khi có sẵn glucose trong môi trường, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong quá trình lên men rượu truyền thống.

  5. Thử nghiệm lên men rượu với chủng thuần: Sử dụng chủng thuần R. oryzae kết hợp với S. cerevisiae hoặc Saccharomycopsis fibuligera cho kết quả lên men rượu với nồng độ cồn đạt khoảng 12-15% (v/v), tương đương hoặc cao hơn so với các mẫu rượu truyền thống.

  6. Phân tích phổ hương rượu bằng GCMS: Phân tích 32 mẫu rượu chưng cất cho thấy sự đa dạng các hợp chất bay hơi thuộc các nhóm ester, alcohol, acid, aldehyde và ketone. Mẫu rượu lên men từ chủng thuần có phổ hương tương đồng với các mẫu rượu truyền thống, chứng tỏ khả năng tái tạo hương vị đặc trưng.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy họ Mucoraceae đóng vai trò chủ đạo trong quá trình thủy phân tinh bột của rượu truyền thống Việt Nam, với Rhizopus oryzae là loài có hoạt tính enzyme amylase cao nhất và khả năng thích nghi tốt trong điều kiện lên men. Điều này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về vai trò của R. oryzae trong sản xuất rượu truyền thống châu Á như rượu Sake Nhật Bản.

Khả năng duy trì hoạt tính thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của R. oryzae giúp tối ưu hóa quá trình đường hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men chuyển hóa đường thành ethanol hiệu quả. Sự đa dạng về chủng nấm mốc và khả năng chịu nhiệt khác nhau cũng góp phần tạo nên sự phong phú về hương vị và chất lượng rượu truyền thống.

Phân tích phổ hương bằng GCMS cung cấp dữ liệu định lượng và định tính các hợp chất tạo mùi, giúp đánh giá chất lượng sản phẩm một cách khách quan, vượt trội hơn so với phương pháp cảm quan truyền thống. Việc sử dụng chủng thuần trong lên men rượu không chỉ giúp kiểm soát chất lượng mà còn duy trì được đặc trưng hương vị truyền thống.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme amylase giữa các nhóm chủng, bảng phân loại chủng nấm mốc theo PCR-fingerprinting, và biểu đồ thành phần hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu phân tích bằng GCMS.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển bộ giống chủng thuần Rhizopus oryzae có hoạt tính amylase cao: Tập trung tuyển chọn và nhân giống các chủng R. oryzae ưu việt để sử dụng làm giống khởi động trong sản xuất rượu truyền thống, nhằm nâng cao hiệu quả thủy phân tinh bột và ổn định chất lượng rượu. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: Viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất rượu.

  2. Ứng dụng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh rDNA trong kiểm soát chất lượng bánh men: Áp dụng các phương pháp phân loại hiện đại để giám sát đa dạng vi sinh vật trong bánh men, giúp phát hiện và loại bỏ các chủng không mong muốn, đảm bảo tính đồng nhất và an toàn sản phẩm. Thời gian: liên tục; chủ thể: Trung tâm kiểm nghiệm và nhà sản xuất.

  3. Tối ưu hóa điều kiện lên men và thủy phân tinh bột: Nghiên cứu và điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, tỷ lệ bánh men và nguyên liệu để tạo môi trường thuận lợi cho hoạt động enzyme amylase và nấm men, nâng cao hiệu suất lên men và chất lượng rượu. Thời gian: 1 năm; chủ thể: Nhà sản xuất và viện nghiên cứu.

  4. Phân tích và kiểm soát hương vị rượu bằng phương pháp GCMS: Xây dựng quy trình phân tích phổ hương định kỳ để đánh giá và duy trì đặc trưng hương vị rượu truyền thống, đồng thời phát hiện các hợp chất gây ô nhiễm hoặc mùi lạ. Thời gian: định kỳ hàng năm; chủ thể: Trung tâm phân tích và nhà sản xuất.

  5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ cho các cơ sở sản xuất rượu truyền thống: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật nuôi cấy chủng thuần, kiểm soát quá trình lên men và phân tích chất lượng sản phẩm nhằm nâng cao năng lực sản xuất và bảo tồn giá trị văn hóa truyền thống. Thời gian: 6-12 tháng; chủ thể: Viện nghiên cứu, trường đại học và các tổ chức liên quan.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu vi sinh vật học và công nghệ thực phẩm: Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về đa dạng chủng nấm mốc họ Mucoraceae, hoạt tính enzyme và vai trò trong lên men rượu truyền thống, hỗ trợ nghiên cứu phát triển giống vi sinh vật và quy trình lên men.

  2. Doanh nghiệp sản xuất rượu truyền thống và công nghiệp: Thông tin về chủng thuần, phương pháp kiểm soát chất lượng bánh men và phân tích hương vị giúp cải tiến quy trình sản xuất, nâng cao chất lượng và ổn định sản phẩm.

  3. Cơ quan quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm: Cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kiểm soát vi sinh vật trong bánh men và sản phẩm rượu truyền thống, đảm bảo an toàn và bảo vệ người tiêu dùng.

  4. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành vi sinh vật học, công nghệ thực phẩm: Tài liệu tham khảo về phương pháp phân lập, phân loại vi sinh vật, kỹ thuật PCR-fingerprinting, phân tích enzyme và sắc ký khí, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao họ Mucoraceae lại quan trọng trong sản xuất rượu truyền thống?
    Họ Mucoraceae chứa các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme amylase mạnh, giúp thủy phân tinh bột thành đường khử, tạo điều kiện cho nấm men lên men chuyển hóa thành ethanol. Đây là bước then chốt trong quá trình lên men rượu truyền thống.

  2. Phương pháp PCR-fingerprinting có ưu điểm gì trong phân loại vi sinh vật?
    PCR-fingerprinting sử dụng mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn ADN vệ tinh, cho phép phân nhóm chính xác các chủng vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về trình tự ADN, nhanh chóng và hiệu quả hơn so với phân loại hình thái truyền thống.

  3. Hoạt tính enzyme amylase được đo như thế nào?
    Hoạt tính amylase được đánh giá bằng phương pháp DNS, đo lượng đường khử tạo thành sau phản ứng thủy phân tinh bột, biểu thị bằng đơn vị IU/ml, phản ánh khả năng thủy phân tinh bột của chủng nấm mốc.

  4. Làm thế nào để kiểm soát chất lượng bánh men trong sản xuất rượu?
    Kiểm soát chất lượng bánh men bao gồm phân lập và định danh các chủng vi sinh vật, sử dụng chủng thuần có hoạt tính enzyme cao, giám sát quá trình lên men và phân tích sản phẩm cuối cùng bằng các phương pháp hóa học và sinh học phân tử.

  5. Phân tích phổ hương rượu bằng GCMS có ý nghĩa gì?
    Phân tích GCMS giúp xác định thành phần các hợp chất bay hơi tạo hương trong rượu, từ đó đánh giá chất lượng và đặc trưng hương vị sản phẩm, hỗ trợ cải tiến quy trình sản xuất và phát triển sản phẩm phù hợp với thị trường.

Kết luận

  • Phân lập và xác định được 73 chủng nấm mốc họ Mucoraceae từ 15 mẫu bánh men rượu truyền thống Việt Nam, với Rhizopus oryzae và Rhizopus microsporus là hai loài phổ biến nhất.
  • Rhizopus oryzae có hoạt tính enzyme amylase cao nhất, phù hợp làm chủng thuần để cải tiến quá trình thủy phân tinh bột và lên men rượu.
  • Chủng nấm mốc có khả năng duy trì hoạt tính thủy phân tinh bột trong môi trường có đường và chịu nhiệt độ lên đến 45-50ºC, thích hợp với điều kiện lên men truyền thống.
  • Thử nghiệm lên men rượu sử dụng chủng thuần kết hợp với nấm men cho kết quả nồng độ cồn và phổ hương tương đương với rượu truyền thống, chứng minh tính khả thi của phương pháp.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển công nghệ sản xuất rượu truyền thống bền vững, nâng cao chất lượng sản phẩm và kiểm soát quy trình sản xuất.

Next steps: Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quy trình lên men, mở rộng tuyển chọn chủng thuần, và ứng dụng phân tích GCMS trong kiểm soát chất lượng sản phẩm quy mô công nghiệp.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất rượu truyền thống nên áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm chất lượng cao, đồng thời bảo tồn giá trị văn hóa rượu truyền thống Việt Nam.