Tổng quan luận án
Tài liệu là bản mô tả chi tiết luận án tiến sĩ dược học chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất (mã số 9720210) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Thảo, thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phương Thiện Thương và TS. Nguyễn Thị Liên, hoàn thành năm 2022 và bảo vệ năm 2023. Đề tài gắn liền với Nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ cấp Bộ (Bộ Khoa học và Công nghệ cấp kinh phí, mã số 01.2020M001), có sự phối hợp thực hiện của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc (VKIST).
Tính cấp thiết của luận án xuất phát từ thực tiễn kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số toàn cầu sử dụng dược liệu trong chăm sóc sức khỏe. Số lượng quốc gia quản lý lưu hành dược liệu tăng từ 65 nước (năm 1999) lên 116 nước (năm 2012) và 124 nước (năm 2018). Tại Việt Nam, Quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ đặt mục tiêu thuốc từ dược liệu chiếm 30% tổng giá trị thuốc tiêu thụ; Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 định hướng đến năm 2030 đạt 100% nguyên liệu sản xuất thuốc được tiêu chuẩn hóa theo tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc (GMP-WHO). Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) chỉ có 83/310 chuyên luận dược liệu (27%) yêu cầu chất đánh dấu và 59/310 chuyên luận (19%) định lượng chất đánh dấu bằng HPLC/GC. Tỷ lệ này thấp hơn nhiều so với Dược điển Châu Âu 10 (97% chuyên luận dùng chất đánh dấu), Dược điển Trung Quốc 2015 (57% chuyên luận định lượng bằng HPLC/GC) và Tiêu chuẩn Dược liệu Hồng Kông (96% chuyên luận định lượng bằng HPLC/GC).
Khoảng trống nghiên cứu được xác định cụ thể:
- Dược liệu Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) trong Dược điển Trung Quốc và Tiêu chuẩn Hồng Kông quy định định lượng chất đánh dấu kirenol. Tuy nhiên, các nghiên cứu thực tế cho thấy Hy thiêm trồng tại một số vùng ở Việt Nam chứa rất ít hoặc không có kirenol, trong khi lại chứa hàm lượng đáng kể darutosid – một diterpenoid có tác dụng sinh học tương đương kirenol.
- Dược liệu Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry)), gồm nụ Vối và lá Vối, dù đã được đưa vào DĐVN V nhưng tiêu chuẩn chỉ dừng ở mức định tính cảm quan, vi phẫu, sắc ký lớp mỏng và định lượng cắn chiết bằng phương pháp cân, hoàn toàn chưa có quy định định tính, định lượng chất đánh dấu chính là hợp chất chalcon 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (CO1).
- Nguồn chất chuẩn đối chiếu gốc (PCRS) phục vụ công tác kiểm nghiệm các dược liệu này tại Việt Nam chưa được thiết lập đồng bộ theo các chuẩn mực quốc tế như ISO Guide 35 và hướng dẫn của WHO.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 4 nội dung:
- Chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dược liệu Hy thiêm hợp chất darutosid, từ Vối hợp chất CO1 đủ độ tinh khiết và đủ khối lượng để thiết lập chất chuẩn gốc.
- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid và CO1 tinh chế được.
- Thiết lập chất chuẩn gốc darutosid và CO1 theo các nguyên tắc chuẩn thức.
- Ứng dụng chất chuẩn thiết lập được để xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong dược liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối và lá Vối.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng hóa thực vật: Cây Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., họ Cúc - Asteraceae) và cây Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry), họ Sim - Myrtaceae).
- Phạm vi không gian và thời gian lấy mẫu: Mẫu Hy thiêm (08 mẫu ký hiệu từ HT1 đến HT8) thu thập tại Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Hòa Bình trong giai đoạn từ tháng 6/2019 đến tháng 5/2022; Mẫu nụ Vối (08 mẫu, NV1 đến NV8) và lá Vối (08 mẫu, LV1 đến LV8) thu thập tại Bắc Giang, Hưng Yên, Cẩm Xuyên - Hà Tĩnh, Yên Bái, Thanh Hóa, Đà Bắc - Hòa Bình, Lý Nhân - Hà Nam, Cao Bằng trong giai đoạn từ tháng 4/2019 đến tháng 5/2021.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học của hai đối tượng dược liệu cũng như cơ sở lý luận về thiết lập chất chuẩn:
- Về dược liệu Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.):
- Phân loại học: Thuộc chi Sigesbeckia, phân lớp Cúc (Asteridae), họ Cúc (Asteraceae). Chi này tại Việt Nam có 4 loài.
- Thành phần hóa học: Nhóm hoạt chất chính là diterpenoid (khoảng 30 hợp chất thuộc khung ent-pimarane và ent-kaurane). P. Giang và cộng sự (2005) đã phân lập từ Hy thiêm Hà Giang các chất darutigenol (1), darutosid (2), 16-O-acetyldarutosid (hythiemosid A) (3), 15-O-acetyldarutosid (hythiemosid B) (4), ent-(15R),16,19-trihydroxypimar-8(14)-ene 19-O-β-D-glucopyranosid (5). Goud và cộng sự phân tích mẫu tại Ấn Độ ghi nhận hàm lượng darutosid đạt 0,185% và hythiemosid A đạt 0,852%. Fei Wang và Li-Li Wang phân lập kirenol cùng các dẫn xuất diterpenoid từ mẫu Hy thiêm Trung Quốc. Năm 2020, XiaoXu Gao và cộng sự phân lập 9 hợp chất ent-pimarane diterpenoid mới (Siegesbeckia A–I). Yuan Yang và cộng sự phân lập các dẫn xuất ent-kaurane (acid 16β-hydro-ent-kauran-17,19-dioic, acid siegesmethyletheric...). Ngoài ra còn có các hợp chất sesquiterpen lacton và phenolic.
- Tác dụng sinh học: Có hoạt tính chống viêm cấp và mạn tính, ức chế xanthin oxidase, hạ acid uric máu trên thực nghiệm. Kirenol và darutosid có tác dụng giảm đau, kháng viêm thông qua cơ chế gắn vào enzym cyclooxygenase-2 (COX-2) và ngăn cản thâm nhiễm tế bào viêm.
- Về dược liệu Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry)):
- Phân loại học: Thuộc chi Cleistocalyx, họ Sim (Myrtaceae). Chi này ở Việt Nam có 6 loài.
- Thành phần hóa học: Đã phân lập được khoảng 22 hợp chất flavonoid. Byung Sun Min và cộng sự (2010) phân lập các flavonoid glycosid. Năm 2013, Phương Thiện Thương và cộng sự phân lập 14 flavonoid từ nụ Vối, xác định 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (CO1) là thành phần chủ yếu. Liu Wen-Jun và cộng sự (2018) phân lập auron mới ((Z)-6-hydroxy-4-methoxy-5,7-dimethylauron) cùng với CO1. Bên cạnh flavonoid, Vối còn chứa triterpenoid (acid cleistocalyxic J), hợp chất phenolic và tinh dầu (α-pinen, cis-linalool oxid).
- Tác dụng sinh học: Kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram âm (P. aeruginosa) và Gram dương (S. aureus, B. subtilis); chống oxy hóa, thu dọn gốc tự do với IC50 đạt 22,9 µg/ml; ức chế mạnh enzym giải phóng PGE2 (IC50 của CO1 đạt 6,12 nmol/l so với ibuprofen 68,66 nmol/l); ức chế maltase làm hạ đường huyết; bảo vệ tế bào gan và ức chế các dòng tế bào ung thư.
- Nghiên cứu chiết xuất CO1: Các công trình của Nguyễn Quốc Tuấn (chiết ngâm cồn từ 8 kg nụ Vối, phân đoạn ethyl acetat qua cột silica gel thu 4,3 g CO1), Trương Thị Tố Chinh (chiết từ lá Vối), Huỳnh Như Tuấn (tách qua cột Sephadex LH-20 thu 1,6 g CO1), Jin Woo Choi và Takashi Izumi.
- Về lý luận thiết lập chất chuẩn hóa học:
- Luận án tổng hợp các khung lý thuyết chuẩn hóa từ ISO Guide 35, các văn bản của WHO (1975, 1982, 1999, 2004, 2017), hướng dẫn của Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thức (AOAC) và Dược điển Châu Âu (EP 10). Phân loại chuẩn thành chất chuẩn hóa học gốc (PCRS), chất chuẩn thứ cấp (SCRS) và chất đánh dấu (Marker).
Vị trí của luận án: Luận án là công trình tích hợp quy trình từ chiết xuất, tinh chế quy mô phòng thí nghiệm, xác định cấu trúc phân tử, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu, thẩm định liên phòng/thiết bị để thiết lập chất chuẩn gốc darutosid và CO1, cho đến ứng dụng xây dựng phương pháp kiểm nghiệm chất lượng dược liệu thực tế tại Việt Nam.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
Luận án vận dụng hướng dẫn ISO Guide 35 về thiết lập mẫu chuẩn/chất chuẩn và hướng dẫn của WHO năm 2017 về "Lựa chọn chất đánh dấu có nguồn gốc dược liệu trong kiểm nghiệm dược liệu và thuốc có nguồn gốc từ dược liệu". Khung đánh giá chất chuẩn gốc định lượng bao gồm:
- Xác định đặc tính cấu trúc phân tử.
- Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký và định lượng tạp chất liên quan.
- Định lượng tạp chất bay hơi và tạp chất vô cơ.
- Đánh giá độ đồng nhất trong đóng lọ.
- Tính giá trị ấn định hàm lượng kèm theo độ không đảm bảo đo mở rộng.
- Theo dõi độ ổn định theo thời gian.
Công thức tính giá trị ấn định hàm lượng chất chuẩn gốc định lượng:
$$\text{Hàm lượng (%)} = \text{% Độ tinh khiết sắc ký} \times \frac{100 - \text{% Tạp bay hơi} - \text{% Tạp vô cơ}}{100}$$
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Dược liệu thô (Hy thiêm HT2 / Nụ Vối NV5)
Nguyên liệu tinh khiết (Darutosid / CO1)
Chất chuẩn gốc (PCRS) darutosid và CO1 (kèm Giá trị ấn định & U)
Xây dựng & Thẩm định phương pháp HPLC-DAD định tính, định lượng dược liệu
Ứng dụng khảo sát hàm lượng trên các mẫu thực tế (HT1-HT8, NV1-NV8, LV1-LV8)
- Chiết xuất và tinh chế:
- Darutosid: Dược liệu Hy thiêm (mẫu HT2) xay nhỏ, chiết ngâm cồn 96% ở nhiệt độ phòng, cô áp suất giảm ở 60°C. Cắn phân tán trong nước, lắc phân đoạn với ethyl acetat. Dịch chiết ethyl acetat cô cắn và tinh chế qua sắc ký cột silica gel pha thuận, tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18.
- CO1: Nụ Vối (mẫu NV5) ngâm cồn 96% ở nhiệt độ phòng, cô thu hồi cắn ở 50°C. Cắn hòa nước, chiết loại tạp bằng n-hexan, lắc phân đoạn lấy dịch ethyl acetat. Tinh chế sơ bộ qua cột silica gel pha thuận và tinh chế triệt để bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC).
- Kỹ thuật xác định cấu trúc và nhận dạng:
- Quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis).
- Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).
- Khối phổ ion hóa tia điện phân giải cao (HR-LC-ESI-MS) và LC-MS/MS.
- Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ 1D-NMR ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và 2D-NMR (DEPT, COSY, HSQC, HMBC) trên máy Bruker 500 MHz và 600 MHz.
- Quét nhiệt vi sai (DSC) trên máy Shimadzu DSC-60.
- Đánh giá tạp chất và xác định giá trị ấn định:
- Tạp chất liên quan (hữu cơ): Sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang (HPLC/DAD), áp dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích pic.
- Tạp chất bay hơi (nước và dung môi tồn dư): Phương pháp mất khối lượng do làm khô hoặc phân tích nhiệt trọng lượng (TGA).
- Tạp chất vô cơ: Phương pháp tro sulfat/cắn sau khi nung.
-
Thẩm định quy trình phân tích HPLC:
Tuân thủ các chỉ tiêu thẩm định phương pháp phân tích theo khuyến cáo quốc tế và Dược điển: Tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và hệ số tương quan ($R^2$), độ lặp lại (RSD), độ chính xác trung gian (giữa các kiểm nghiệm viên/ngày phân tích), độ đúng (tỷ lệ phục hồi qua phương pháp thêm chuẩn), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
-
Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu:
- Thiết bị chính: Hệ thống HPLC Agilent 1260, Shimadzu 20A, Waters; Máy HPLC điều chế Shimadzu LC-20AP và CBM-20A; Cân phân tích Mettler Toledo XPE-26 (độ phân giải 1 µg); Tủ Glovebox thao tác đóng gói; Hệ thống NMR Bruker 500 MHz (Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam).
- Mẫu chuẩn đối chứng so sánh: Kirenol chuẩn Dược điển Trung Quốc (SKS: 111726-200601, hàm lượng 100%).
- Các loại dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích và tiêu chuẩn sắc ký (HPLC grade).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về vai trò của chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu theo định hướng của WHO và các Dược điển quốc tế lớn (EP 10, ChP 2015, HKCMMS, JP 17/18, DĐVN V). Tác giả làm rõ thực trạng tiêu chuẩn hóa Hy thiêm và Vối, đồng thời tổng quan chi tiết các nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học (đặc biệt là nhóm ent-pimarane diterpenoid trong Hy thiêm và flavonoid nhóm chalcon trong Vối) cùng các thử nghiệm dược lý học liên quan đến tính kháng viêm, giảm đường huyết, bảo vệ gan. Chương này cũng phân tích quy trình thiết lập chất chuẩn hóa học gốc (PCRS) và các yêu cầu kỹ thuật phân tích tạp chất (hữu cơ, vô cơ, bay hơi) và cấu trúc phân tử theo ISO Guide 35.
Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc 08 mẫu Hy thiêm (HT1–HT8) và 08 cặp mẫu nụ Vối/lá Vối (NV1–NV8, LV1–LV8), tất cả đều có xác nhận định danh thực vật của Viện Dược liệu. Tác giả thiết lập thiết kế nghiên cứu bao gồm 5 khối nội dung logic:
- Chiết tách, phân lập và tinh chế darutosid và CO1.
- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu.
- Thiết lập chất chuẩn gốc (đóng lọ, thử đồng nhất, ấn định hàm lượng, tính độ không đảm bảo đo, theo dõi độ ổn định).
- Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC-DAD.
- Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC-DAD.
| Nhóm mẫu |
Ký hiệu mẫu |
Địa điểm thu hái |
Thời gian thu hái |
| Hy thiêm |
HT1 |
Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa |
Tháng 6/2019 |
|
HT2 |
Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa (vùng trồng Cty Dược VTYT Thanh Hóa) |
Tháng 5/2020 |
|
HT3 |
TP. Thanh Hóa (TT Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ) |
Tháng 4/2020 |
|
HT4 |
Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa |
Tháng 5/2021 |
|
HT5 |
TP. Thanh Hóa (TT Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ) |
Tháng 5/2021 |
|
HT6 |
Huyện Thạch Hà – Hà Tĩnh |
Tháng 6/2020 |
|
HT7 |
TP. Hòa Bình |
Tháng 6/2021 |
|
HT8 |
Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa |
Tháng 5/2022 |
| Nụ Vối & Lá Vối |
NV1 / LV1 |
TP. Bắc Giang |
Tháng 5/2021 |
|
NV2 / LV2 |
TP. Hưng Yên |
Tháng 4/2019 |
|
NV3 / LV3 |
Huyện Cẩm Xuyên – Hà Tĩnh |
Tháng 4/2021 |
|
NV4 / LV4 |
TP. Yên Bái |
Tháng 4/2020 |
|
NV5 / LV5 |
TP. Thanh Hóa |
Tháng 5/2019 |
|
NV6 / LV6 |
Huyện Đà Bắc – Hòa Bình |
Tháng 4/2019 |
|
NV7 / LV7 |
Huyện Lý Nhân – Hà Nam |
Tháng 4/2019 |
|
NV8 / LV8 |
TP. Cao Bằng |
Tháng 5/2020 |
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
1. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc
- Hợp chất darutosid: Từ cặn chiết ethyl acetat của mẫu Hy thiêm HT2, qua sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18 đã tinh chế được darutosid dạng bột vô định hình màu trắng ngà. Phổ UV-Vis ghi nhận đỉnh hấp thụ đặc trưng; phổ IR ghi nhận các dải hấp thụ nhóm chức; khối phổ HR-LC-ESI-MS xác nhận công thức phân tử $\text{C}{26}\text{H}{44}\text{O}_8$ (khối lượng mol 484,6 g/mol); số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H-NMR}$ (600 MHz) và $^{13}\text{C-NMR}$ (150 MHz) hoàn toàn trùng khớp với các tín hiệu công bố trong tài liệu tham khảo chuẩn.
- Hợp chất CO1: Từ cặn phân đoạn ethyl acetat của nụ Vối NV5, tinh chế bằng sắc ký cột silica gel kết hợp sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC) thu được chất CO1 dạng tinh thể màu vàng cam. Cấu trúc được xác định là 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (công thức phân tử $\text{C}{18}\text{H}{18}\text{O}_4$, khối lượng mol 298,3 g/mol) thông qua dữ liệu phổ UV-Vis, IR, MS, quét nhiệt vi sai DSC (nhiệt độ nóng chảy khoảng 126°C), $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz) và $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz).
2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn
Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp HPLC-DAD xác định tạp chất liên quan cho cả hai nguyên liệu:
- Darutosid: Phương pháp có tính thích hợp hệ thống tốt (RSD diện tích pic và thời gian lưu < 1%), độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính đáp ứng tốt, độ lặp lại và độ chính xác trung gian đạt yêu cầu.
- CO1: Thẩm định đầy đủ tính thích hợp, khoảng tuyến tính, độ lặp lại của kiểm nghiệm viên 1 và 2, độ chính xác trung gian, xác định rõ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
3. Thiết lập chất chuẩn gốc và theo dõi độ ổn định
- Tiến hành đóng lọ trong điều kiện kiểm soát (tủ Glovebox), kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói cho thấy sự phân bố đồng đều giữa các lọ mẫu kiểm tra.
- Đánh giá hàm lượng tinh khiết sắc ký (TKSK), hàm lượng tạp chất bay hơi và hàm lượng tạp chất vô cơ của từng chất chuẩn.
- Tính toán giá trị ấn định công bố trên chứng chỉ kèm độ không đảm bảo đo mở rộng ($U$).
- Kết quả theo dõi độ ổn định của chất chuẩn darutosid và CO1 trong các điều kiện bảo quản xác định cho thấy các chất chuẩn duy trì được chất lượng và hàm lượng trong thời gian theo dõi.
| Chỉ tiêu đánh giá |
Chất chuẩn gốc Darutosid |
Chất chuẩn gốc CO1 |
| Trạng thái cảm quan |
Bột vô định hình màu trắng ngà |
Tinh thể / bột màu vàng cam |
| Độ tinh khiết sắc ký (TKSK, %) |
Đạt yêu cầu quy định |
Đạt yêu cầu quy định |
| Hàm lượng tạp chất bay hơi (%) |
Đã xác định theo TGA/Sấy khô |
Đã xác định theo TGA/Sấy khô |
| Hàm lượng tạp chất vô cơ (%) |
Đã xác định theo tro sulfat |
Đã xác định theo tro sulfat |
| Giá trị ấn định hàm lượng |
Được xác định kèm độ KĐBĐ ($U$) |
Được xác định kèm độ KĐBĐ ($U$) |
| Đánh giá độ đồng nhất đóng lọ |
Đạt yêu cầu |
Đạt yêu cầu |
| Đánh giá độ ổn định |
Đạt yêu cầu trong thời gian theo dõi |
Đạt yêu cầu trong thời gian theo dõi |
4. Xây dựng quy trình phân tích kiểm nghiệm dược liệu và khảo sát mẫu
- Quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC-DAD:
- Khảo sát và tối ưu hóa quy trình chiết xuất mẫu thử.
- Thẩm định phương pháp: Độ đặc hiệu (pic kirenol và darutosid tách hoàn toàn khỏi các tạp chất nền, phổ UV-Vis thuần khiết), độ tuyến tính cao, độ đúng qua tỷ lệ phục hồi đạt giới hạn quy định, độ lặp lại và độ chính xác trung gian đạt yêu cầu.
- Ứng dụng khảo sát trên 08 mẫu Hy thiêm (HT1–HT8): Kết quả phân tích định lượng chỉ ra sự biến thiên hàm lượng của kirenol và darutosid giữa các vùng trồng và thời điểm thu hái, trong đó darutosid luôn hiện diện với hàm lượng đáng kể.
- Quy trình định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC-DAD:
- Tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu thử cho nụ Vối và lá Vối.
- Thẩm định phương pháp: Đạt đầy đủ các chỉ tiêu về tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng trên mẫu nụ Vối và lá Vối, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, LOD và LOQ.
- Ứng dụng khảo sát trên 08 mẫu nụ Vối (NV1–NV8) và 08 mẫu lá Vối (LV1–LV8): Hàm lượng CO1 trong nụ Vối dao động trong khoảng 1,32% – 1,86%, trong lá Vối dao động từ 0,43% – 0,49%.
Bàn luận
Tác giả thảo luận về tính khoa học và thực tiễn của việc lựa chọn darutosid làm chất đánh dấu bổ sung bên cạnh kirenol cho Hy thiêm, giải thích nguyên nhân dựa trên đặc điểm phân bố hóa học của dược liệu trồng tại Việt Nam. Về cây Vối, việc lựa chọn CO1 được chứng minh là tối ưu do CO1 chiếm tỷ lệ lớn nhất trong nhóm flavonoid của cây, có hoạt tính sinh học đa dạng (chống viêm, chống oxy hóa, hạ đường huyết) phù hợp chặt chẽ với công năng y học cổ truyền. Các giải pháp kỹ thuật trong phân lập (như ứng dụng Prep-HPLC) và các phương pháp kiểm soát tạp chất theo chuẩn mực quốc tế cũng được phân tích, đối chiếu với các nghiên cứu trước đây.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Cung cấp bộ dữ liệu phổ hoàn chỉnh (UV-Vis, IR, HR-LC-ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR, DSC) nhận dạng và xác nhận cấu trúc của 02 hợp chất tự nhiên chiết xuất từ nguồn dược liệu Việt Nam: darutosid từ cây Hy thiêm và 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (CO1) từ cây Vối.
- Thiết lập cơ sở khoa học cho việc bổ sung tiêu chí kiểm soát chất lượng dược liệu Hy thiêm bằng chất đánh dấu darutosid song song với kirenol, khắc phục nhược điểm của các tiêu chuẩn dược điển nước ngoài khi áp dụng cho nguồn nguyên liệu thực tế tại Việt Nam.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn
- Đã chiết xuất, tinh chế và thiết lập thành công 02 chất chuẩn hóa học gốc (PCRS) cấp quốc gia là darutosid và CO1 với đầy đủ hồ sơ phân tích: tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu, dữ liệu đánh giá độ đồng nhất đóng lọ, giá trị ấn định hàm lượng kèm độ không đảm bảo đo mở rộng và dữ liệu theo dõi độ ổn định theo đúng hướng dẫn ISO Guide 35 và WHO.
- Xây dựng và thẩm định thành công 02 quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD):
- Quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong dược liệu Hy thiêm.
- Quy trình định tính, định lượng hợp chất CO1 trong cả hai bộ phận dùng là nụ Vối và lá Vối.
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hàm lượng các hoạt chất đánh dấu trên 08 mẫu Hy thiêm và 16 mẫu nụ/lá Vối thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam.
Kiến nghị và đề xuất
- Đề xuất Hội đồng Dược điển Việt Nam xem xét bổ sung chỉ tiêu định tính, định lượng darutosid và kirenol vào chuyên luận Hy thiêm; bổ sung chỉ tiêu định tính, định lượng CO1 vào chuyên luận nụ Vối và lá Vối trong các lần tái bản Dược điển Việt Nam tiếp theo.
- Sử dụng 02 chất chuẩn gốc đã thiết lập để cung ứng cho hệ thống các phòng kiểm nghiệm thuốc, viện nghiên cứu và các nhà máy sản xuất đông dược trên toàn quốc.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Luận án khảo sát hàm lượng hoạt chất trên tập mẫu gồm 08 mẫu Hy thiêm và 08 cặp mẫu nụ/lá Vối thu thập tại một số tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ; việc theo dõi độ ổn định của chất chuẩn mới thực hiện trong khoảng thời gian nhất định theo khuôn khổ của đề tài nghiên cứu.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Tiếp tục theo dõi độ ổn định dài hạn của các lô chất chuẩn darutosid và CO1 đã đóng lọ để kéo dài hạn dùng trên chứng chỉ chất lượng.
- Mở rộng khảo sát hàm lượng darutosid, kirenol và CO1 trên quy mô mẫu dược liệu lớn hơn ở các vùng sinh thái Nam Trung Bộ và Tây Nguyên.
- Ứng dụng các quy trình HPLC-DAD đã xây dựng để phân tích, kiểm soát chất lượng các chế phẩm thuốc thành phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa cao Hy thiêm và cao Vối đang lưu hành trên thị trường.
Giá trị tham khảo
Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn trong các lĩnh vực:
- Cơ quan quản lý và kiểm nghiệm chất lượng: Cung cấp quy trình phân tích và dữ liệu thẩm định đáng tin cậy cho Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh và các Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm tuyến tỉnh/thành phố để phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu.
- Cơ quan biên soạn tiêu chuẩn: Cung cấp cơ sở thực nghiệm trực tiếp cho Ban Thư ký Dược điển Việt Nam nhằm nâng cấp, hoàn thiện các chuyên luận dược liệu trong Dược điển Việt Nam.
- Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm: Hỗ trợ các nhà máy sản xuất thuốc đông dược chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào theo tiêu chuẩn GMP-WHO và xây dựng quy trình kiểm soát hàm lượng hoạt chất trong quá trình sản xuất cao chiết.
- Đào tạo và nghiên cứu học thuật: Là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp phân lập hợp chất tự nhiên, kỹ thuật giải phổ cấu trúc hóa học và quy trình thiết lập chất chuẩn theo chuẩn mực quốc tế cho giảng viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất, Hóa thực vật và Dược liệu học.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao luận án lại chọn darutosid để thiết lập chất chuẩn thay vì chỉ dùng kirenol cho dược liệu Hy thiêm?
Dược điển Trung Quốc và Dược điển Hồng Kông chỉ định lượng kirenol trong Hy thiêm. Tuy nhiên, các nghiên cứu thực tế trên mẫu Hy thiêm trồng tại Việt Nam cho thấy hàm lượng kirenol rất thấp hoặc không phát hiện được ở một số mẫu, trong khi lại chứa hàm lượng đáng kể darutosid. Darutosid là một diterpenoid đã được chứng minh có tác dụng kháng viêm và làm lành vết thương tương đương kirenol. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn darutosid và xây dựng quy trình định lượng đồng thời cả hai chất phản ánh đúng thực tế thành phần hóa học của nguồn dược liệu Việt Nam.
2. Hợp chất CO1 phân lập từ cây Vối có tên khoa học đầy đủ và đặc tính gì?
Hợp chất CO1 có tên khoa học là 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (hoặc (2E)-1-(2,4-dihydroxy-6-methoxy-3,5-dimethylphenyl)-3-phenyl-2-propen-1-on), công thức phân tử $\text{C}{18}\text{H}{18}\text{O}_4$, khối lượng mol 298,3 g/mol. Chất này kết tinh dạng tinh thể màu vàng cam (dạng bột màu vàng), dễ tan trong aceton, cloroform, isopropanol, nhiệt độ nóng chảy khoảng 126°C. Đây là flavonoid chính trong nụ Vối (hàm lượng khoảng 1,32% – 1,86%) và lá Vối (khoảng 0,43% – 0,49%), có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và hạ đường huyết.
3. Giá trị ấn định hàm lượng của chất chuẩn gốc định lượng trong luận án được tính theo công thức nào?
Giá trị ấn định hàm lượng (%) của chất chuẩn gốc được tính toán theo nguyên tắc bù trừ tạp chất:
$$\text{Hàm lượng (%)} = \text{% Độ tinh khiết sắc ký} \times \frac{100 - \text{% Tạp bay hơi} - \text{% Tạp vô cơ}}{100}$$
Trong đó, độ tinh khiết sắc ký được xác định bằng phương pháp HPLC-DAD; tạp chất bay hơi được xác định bằng phương pháp sấy khô hoặc phân tích nhiệt trọng lượng (TGA); tạp chất vô cơ được xác định bằng phương pháp tro sulfat/cắn sau khi nung.
4. Các mẫu dược liệu nghiên cứu trong luận án được thu thập từ những địa phương nào?
Các mẫu Hy thiêm (HT1–HT8) được thu thập tại Thanh Hóa (huyện Thạch Thành, TP. Thanh Hóa), Hà Tĩnh (huyện Thạch Hà) và Hòa Bình. Các mẫu nụ Vối (NV1–NV8) và lá Vối (LV1–LV8) được thu thập tại 8 tỉnh/thành phố gồm Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Tĩnh (Cẩm Xuyên), Yên Bái, Thanh Hóa, Hòa Bình (Đà Bắc), Hà Nam (Lý Nhân) và Cao Bằng.
5. Những phương pháp phân tích nào được sử dụng để xác định cấu trúc của các chất tinh chế được?
Để xác minh chính xác cấu trúc hóa học của darutosid và CO1, luận án đã phối hợp các phương pháp quang phổ và hóa lý hiện đại gồm: quang phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), khối phổ ion hóa tia điện phân giải cao (HR-LC-ESI-MS/MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và 2 chiều (DEPT, COSY, HSQC, HMBC) kết hợp phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC).
Kết luận
Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Thảo đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu chiết xuất, phân lập và thiết lập 02 chất chuẩn hóa học gốc là darutosid từ dược liệu Hy thiêm và 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (CO1) từ dược liệu Vối theo đúng các tiêu chuẩn quốc tế ISO Guide 35 và hướng dẫn của WHO. Công trình đã xây dựng và thẩm định thành công 02 quy trình phân tích HPLC-DAD phục vụ định tính, định lượng các chất đánh dấu trong Hy thiêm, nụ Vối và lá Vối, đồng thời khảo sát thực tế hàm lượng hoạt chất trên các mẫu dược liệu thu hái tại nhiều địa phương ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là luận cứ khoa học và thực tiễn trực tiếp góp phần nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu trong Dược điển Việt Nam, hỗ trợ đắc lực cho công tác kiểm nghiệm và sản xuất thuốc từ dược liệu trong nước.
