Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn d

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin HA tái tổ hợp của virus cúm A H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá.

Trường đại học

Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành

Công nghệ sinh học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

Luận án tiến sĩ

2021

182

Phí lưu trữ

45 Point

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu về kháng nguyên HA của virus cúm A H5N1 là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học và y học. Virus này gây ra dịch bệnh nghiêm trọng cho gia cầm và có khả năng lây lan sang người, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao. Việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra kháng nguyên HA tái tổ hợp thông qua phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá. Phương pháp này không chỉ giúp sản xuất kháng nguyên nhanh chóng mà còn tiết kiệm chi phí, đáp ứng kịp thời nhu cầu vaccine trong bối cảnh dịch bệnh. Theo nghiên cứu, việc sử dụng cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm, bao gồm khả năng sinh trưởng nhanh và dễ dàng trong việc điều chỉnh điều kiện môi trường.

II. Tổng quan tài liệu

Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm gia cầm có khả năng gây bệnh cao. Kháng nguyên HA là một trong hai kháng nguyên chính của virus, có vai trò quan trọng trong việc phát triển vaccine. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens là một phương pháp hiệu quả để sản xuất kháng nguyên. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng việc sử dụng cây thuốc lá có thể tạo ra kháng nguyên với hoạt tính sinh học cao. Hơn nữa, việc sản xuất kháng nguyên từ thực vật giúp giảm thiểu rủi ro về an toàn sinh học so với việc sản xuất từ động vật. Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng kháng nguyên HA tái tổ hợp có thể kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ trên động vật thí nghiệm, mở ra triển vọng cho việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá để tạo ra kháng nguyên HA tái tổ hợp. Quá trình này bao gồm việc lựa chọn gen mã hóa kháng nguyên HA từ các chủng virus cúm A H5N1 khác nhau, thiết kế vector biểu hiện và thực hiện quá trình chuyển đổi gen vào cây thuốc lá. Các điều kiện tối ưu cho việc biểu hiện tạm thời được xác định thông qua các thí nghiệm khác nhau. Sau khi thu hoạch, dịch chiết từ lá cây được phân tích để đánh giá hoạt tính sinh học của kháng nguyên HA. Phương pháp này không chỉ giúp sản xuất kháng nguyên một cách nhanh chóng mà còn đảm bảo chất lượng và tính an toàn của sản phẩm cuối cùng.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy rằng kháng nguyên HA tái tổ hợp có thể được sản xuất thành công từ cây thuốc lá. Các thí nghiệm cho thấy rằng kháng nguyên HA có hoạt tính ngưng kết hồng cầu cao, cho thấy khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tốt. Đặc biệt, kháng nguyên HA oligomer cho thấy hiệu quả cao hơn trong việc kích thích sản xuất kháng thể so với dạng monomer. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sử dụng cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn giảm chi phí sản xuất. Những kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh đang diễn biến phức tạp.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sản xuất kháng nguyên HA tái tổ hợp từ cây thuốc lá thông qua phương pháp biểu hiện tạm thời là một giải pháp khả thi và hiệu quả. Kết quả cho thấy rằng kháng nguyên HA có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, mở ra triển vọng cho việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm A H5N1. Để nâng cao hiệu quả nghiên cứu, cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng quy mô sản xuất. Ngoài ra, việc nghiên cứu thêm về các clade khác của virus cúm A H5N1 cũng cần được thực hiện để đảm bảo tính hiệu quả và an toàn của vaccine trong tương lai.

01/03/2025

Bạn đang xem trước tài liệu:

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn d

Tải đầy đủ

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của luận án. Mục tiêu nghiên cứu của luận án. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin.

Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1. Bệnh cúm gia cầm. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam.

Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam. Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng.

Nghiên cứu vaccine từ thực vật. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration).

Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học trên thế giới. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguồn vật liệu thực vật.

Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen. Các cặp mồi sử dụng. Nguồn vật liệu động vật. Môi trường và đệm.

Phương pháp. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1. Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá. Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp.

Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1…. Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm.

Phân tích đổi mã gen và tổng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm. Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide. Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên cứu….

Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP.

Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây thuốc lá. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô thuốc lá. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch chiết thô lá thuốc lá. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp.

Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.

Miễn dịch trên chuột thí nghiệm. Miễn dịch trên gà thí nghiệm. Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam. HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh học của HA trimer.

HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật. Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật. 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

131 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 132 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ. 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO. P1 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp base pair BS3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleotide triphosphate E.

coli Escherichia coli EDTA ethylene diamine tetra-acetate acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ELP elastin-like polypeptides EtBr ethidium bromide FAO The Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin HI hemagglutinin inhibition IMAC Immobilized metal ion chromatography kb kilobase kDa kilodalton LB Luria and Bertani mITC membrane-based inverse transition cycling OD optical density OIE The World Organisation for Animal Health PCR polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEC size exclusion chromatography TAE tris acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase v/p vòng/phút WHO World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Các gốc amino acid ở các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể, vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị biến đổi của các H5 từ một số chủng virus A/H5N1 khác nhau. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phát triển vaccine. Các protein có hoạt tính sinh học, kháng thể và vaccine được sản xuất từ thực vật đang trong thử nghiệm lâm sàng hoặc có mặt trên thị trường.

Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu. Số lượng trình tự gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm ở Việt Nam. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 1. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 2.

Danh sách các cấu trúc vector thiết kế chứa HA tự nhiên và nhân tạo. Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP. Bảng tổng hợp kết quả thiết kế, biểu hiện và đánh giá hoạt tính của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Trình tự amino acid tại các vị trí phân cắt protein, liên kết thụ thể epitope kháng nguyên và vị trí glycosyl của các protein HA.

124 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép. Dòng thời gian xuất hiện các clade của A/H5N1 dựa vào trình tự của gen HA ở Việt Nam [1].

Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2006 đến 2014 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2015 đến 2017 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE. Bản đồ các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra ở các năm 2018 đến 11/09/2020 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE. Sơ đồ dạng lục thể IgM (A) và dạng đơn tiểu đơn vị (B).

Quy mô thương mại N. benthamiana tăng trưởng (A) và khử trùng (B). Quy trình sản xuất virus cúm mùa tại công ty Medicago, Canada. Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm cơ bản trong nghiên cứu.

Hình ảnh cây thuốc lá thuỷ canh 5 tuần tuổi (A) được loại bỏ bớt lá già, lá non và lá bánh tẻ trước khi biến nạp (B). Biến nạp dịch khuẩn vào lá thuốc lá bằng máy hút chân không. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5TG chủng A/duck/Vietnam/TG24-O1/05 đã được tối ưu trong biểu hiện thuốc lá so với trình tự gốc. Hình ảnh so sánh trình tự amino acid của protein H5HT chủng A/duck/Vietnam/HT-O2/2014 đã được tối ưu trong biểu hiện thuốc lá so với trình tự gốc.

Mô hình thiết kế các trình tự HA COBRA (A) và hình ảnh xây dựng cây phân loại dựa vào các trình tự của kháng nguyên HA tự nhiên và nhân tạo. Hình ảnh biểu diễn và so sánh trình tự amino acid của 4 kháng nguyên HA tự nhiên và HA nhân tạo. Các loại cassette biểu hiện kháng nguyên HA trong thực vật. Mô hình thiết kế vector biểu hiện protein H5TG trimer ở thực vật.

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen H5TG (A) và sản phẩm cắt vector tách dòng pRTRA_H5TG trimer bởi enzyme BamHI và PspOMI (B). Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer. 78 viii ix Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer.

Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế vector tách dòng gen mã hóa kháng nguyên HA oligomer ELP. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP. Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP. Hình ảnh điện di sản phẩm của quá trình thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HACOBRA1 oligomer TP.

Bản đồ vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP. Kết quả gieo và nhân nhanh cây thuốc lá N. benthamiana in vitro từ hạt. Hình ảnh cây thuốc lá trồng thuỷ canh.

Hình ảnh thuốc lá sau 5 ngày biến nạp tạm thời. A–D là cây thuốc lá được sử dụng cho biến nạp ở 3, 4, 5 và 6 tuần tuổi. Phân tích sự biểu hiện của kháng nguyên HA trên lá thuốc lá bằng SDS-PAGE và Western blot. Phân tích sự biểu hiện của HApII theo các mật độ OD600 biến nạp khác nhau.

Lựa chọn thời gian biến nạp. Mức độ biểu hiện của protein HApII sau các ngày biến nạp. Quy trình biểu hiện kháng nguyên HA của A/H5N1 tái tổ hợp trong cây thuốc lá trồng thuỷ canh. Mức độ biểu hiện của các kháng nguyên HA trên thuốc lá.

Hàm lượng kháng nguyên HA tái tổ hợp biểu hiện trong lá thuốc lá. Phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu của các kháng nguyên HA trong dịch chiết thô thuốc lá. Quy trình tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP tái tổ hợp trong cây thuốc lá. Kết quả ly tâm loại bỏ tạp chất sử dụng PEG 8000 ở các nồng độ khác nhau.

Kết quả phân tích protein trong dịch nổi bằng lai miễn dịch (A) và nhuộm Coomassie Brilliant Blue (B). Cải tiến quá trình tinh sạch mITC bởi PEG. mITC dựa vào PEG để tinh sạch các protein HA oligomer ELP. Tinh sạch H5TG trimer và oligomer TP bằng IMAC.

Tinh sạch HACOBRA1 trimer bằng IMAC.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Tài liệu "Nghiên cứu tạo kháng nguyên HA tái tổ hợp virus cúm A H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá" trình bày một nghiên cứu quan trọng về việc phát triển kháng nguyên HA từ virus cúm A H5N1 thông qua kỹ thuật biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá. Nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế miễn dịch mà còn mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất vaccine hiệu quả và an toàn hơn. Độc giả sẽ tìm thấy những thông tin quý giá về quy trình nghiên cứu, ứng dụng thực tiễn và tiềm năng trong lĩnh vực sinh học và y học.

Để mở rộng kiến thức của bạn về các ứng dụng công nghệ sinh học, bạn có thể tham khảo thêm tài liệu Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương, nơi khám phá các sản phẩm sinh học từ thực vật. Ngoài ra, tài liệu Xây dựng phương pháp multiplex-pcr sàng lọc phát hiện thành phần biến đổi gen gm trong sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành và bắp sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc về các phương pháp phân tích gen trong thực phẩm. Cuối cùng, bạn cũng có thể tìm hiểu về Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ lactobacillus acidophilus, một nghiên cứu liên quan đến vi sinh vật và ứng dụng của chúng trong công nghệ thực phẩm. Những tài liệu này sẽ giúp bạn có cái nhìn toàn diện hơn về các xu hướng và nghiên cứu hiện tại trong lĩnh vực sinh học.

#luận án tiến sĩ

#sinh học phân tử

#tái tổ hợp protein

#cây thuốc lá

#virus cúm A H5N1

#kháng nguyên HA

Chủ đề

Công nghệ sinh học

Nghiên cứu y sinh

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn d

I. Giới thiệu

II. Tổng quan tài liệu

III. Phương pháp nghiên cứu

IV. Kết quả nghiên cứu

V. Kết luận và kiến nghị

THÔNG TIN CHI TIẾT

Tác giả: Phạm Thị Vân

Người hướng dẫn: TS. Vũ Huyền Trang

Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Đề tài: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ

Năm xuất bản: 2021

Địa điểm: Hà Nội

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn d

I. Giới thiệu

II. Tổng quan tài liệu

III. Phương pháp nghiên cứu

IV. Kết quả nghiên cứu

V. Kết luận và kiến nghị

Tài liệu liên quan

THÔNG TIN CHI TIẾT

Tác giả: Phạm Thị Vân

Người hướng dẫn: TS. Vũ Huyền Trang

Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Đề tài: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ

Năm xuất bản: 2021

Địa điểm: Hà Nội

Có thể bạn quan tâm