Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng trypanosoma evansi lưu hành trên trâu ở tỉnh tuyên quang

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng trypanosoma, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Thị Hiền
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Kim Lan
• Trường học: Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Tách Dòng Và Biểu Hiện Gene Kháng Nguyên Bề Mặt Trypanosoma Evansi Trên Trâu Tại Tuyên Quang
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Điểm mới của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc
• 2.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
• 2.2.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh
• 2.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng
• 2.2.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi
• 2.2.3.1. Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)
• 2.2.3.2. Kháng nguyên biến đổi
• 2.2.3.3. Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
• 2.3. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 2.3.1. Phân bố của bệnh
• 2.3.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sinh phẩm trong nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
• 3.3. Môi trường và hóa chất
• 3.4. Cặp mồi dùng trong nghiên cứu
• 3.5. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.6.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
• 3.6.2. Nghiên cứu biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Tách chiết ADN từ ký sinh trùng Trypanosoma evansi
• 3.7.2. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 3.7.3. Khuếch đại đoạn gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 3.7.4. Phương pháp tinh sạch ADN không sử dụng gel agarose
• 3.7.5. Phương pháp nối gene
• 3.7.6. Phương pháp tạo tế bào khả biến
• 3.7.7. Phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp mang đoạn gene RoTAT 1.2 vào tế bào khả biến (biến nạp)
• 3.7.8. Phương pháp tách plasmid
• 3.7.9. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
• 3.7.10. Phương pháp tinh sạch ADN bằng gel agarose
• 3.7.11. Phương pháp điện di gel SDS-PAGE
• 3.7.12. Phương pháp biểu hiện protein T4 trong E.
• 3.7.13. Phương pháp Western blot
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi
• 4.2. Kết quả biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên của T.
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi
• 5.2. Kết quả biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của T.
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu và tính cấp thiết của nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào việc tách dòng và biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi, một loại ký sinh trùng gây bệnh trên trâu tại Tuyên Quang. Trypanosoma evansi là tác nhân chính gây bệnh tiên mao trùng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và nền kinh tế nông nghiệp. Việc nghiên cứu này nhằm mục đích tạo ra các công cụ chẩn đoán hiệu quả, đặc biệt là Kit chẩn đoán dựa trên kháng nguyên RoTAT 1.2, giúp phát hiện sớm và kiểm soát bệnh. Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn, góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe động vật và phát triển công nghệ sinh học trong lĩnh vực thú y.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và tạo ra tế bào chủ biểu hiện gene này. Điều này sẽ cung cấp nền tảng cho việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp, phục vụ cho việc chế tạo các Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Nghiên cứu cũng hướng đến việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp chẩn đoán hiện có.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học lớn khi cung cấp hiểu biết sâu hơn về cấu trúc gene và kháng nguyên của Trypanosoma evansi. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở để phát triển các Kit chẩn đoán hiệu quả, giúp kiểm soát và phòng ngừa bệnh tiên mao trùng trên trâu và các gia súc khác, đặc biệt là tại các vùng nông thôn và miền núi như Tuyên Quang.

II. Tổng quan về Trypanosoma evansi và bệnh tiên mao trùng

Trypanosoma evansi là một loại ký sinh trùng đơn bào, gây bệnh tiên mao trùng trên gia súc, đặc biệt là trâu và bò. Bệnh này phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, gây thiệt hại lớn về kinh tế và sức khỏe động vật. Trypanosoma evansi có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt, giúp chúng né tránh hệ thống miễn dịch của vật chủ. Điều này làm cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh trở nên phức tạp. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích cấu trúc gene và kháng nguyên của Trypanosoma evansi, nhằm tìm ra các phương pháp chẩn đoán và phòng ngừa hiệu quả hơn.

2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Trypanosoma evansi có cấu trúc đơn bào, với kích thước nhỏ và hình dạng thon dài. Cơ thể của chúng được bao phủ bởi một lớp kháng nguyên bề mặt (VSG), có khả năng biến đổi để né tránh hệ thống miễn dịch của vật chủ. Cấu trúc gene của Trypanosoma evansi chứa nhiều gene mã hóa cho các loại kháng nguyên khác nhau, giúp chúng thích nghi và tồn tại trong môi trường ký sinh.

2.2. Dịch tễ học và phân bố bệnh

Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây ra phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở châu Á, châu Phi và Nam Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, từ miền núi đến đồng bằng. Trâu và bò là những vật chủ chính của bệnh này, với tỷ lệ nhiễm cao ở các vùng miền núi phía Bắc như Tuyên Quang.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách dòng và biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi. Quá trình bao gồm việc tách chiết ADN, khuếch đại gene bằng PCR, và tạo ra các vector tái tổ hợp để biểu hiện gene trong tế bào chủ. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tách dòng và biểu hiện gene RoTAT 1.2 thành công, mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất các Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.

3.1. Tách dòng gene

Quá trình tách dòng gene bao gồm việc tách chiết ADN từ Trypanosoma evansi, sau đó khuếch đại gene RoTAT 1.2 bằng phương pháp PCR. Gene này sau đó được chèn vào vector tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào chủ để biểu hiện. Kết quả cho thấy gene RoTAT 1.2 được tách dòng thành công, tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Biểu hiện gene và ứng dụng

Gene RoTAT 1.2 được biểu hiện thành công trong tế bào chủ, tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng phát hiện đặc hiệu Trypanosoma evansi. Kết quả này mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất các Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, giúp cải thiện hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát bệnh trên gia súc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên, Van Meirvenne cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981) [27], hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch.

Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất. Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như: phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung tiên mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Trong đó, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn, trong thời gian ngắn.

Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Song, nhược điểm của phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được. Kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable Antigen Type) của Trypanosoma evansi. Kháng nguyên này được chế tạo bằng công nghệ gene cho khả năng phát hiện đặc hiệu tiên mao trùng đạt 98%.

Để sản xuất kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi phục vụ chế tạo các bộ Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng lưu hành trên trâu ở tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tách dòng và biểu n 2 hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành trên trâu ở tỉnh Tuyên Quang”. Mục tiêu của đề tài - Xác định được gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng - Tạo được tế bào chủ yếu biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng 1. Điểm mới của đề tài - Đề tài xác định được gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 của tiên mao trùng phân lập ở Tuyên Quang để tạo cơ sở cho việc xác định cấu trúc kháng nguyên - Kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp được chế tạo trong nước phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.

Ý nghĩa khoa học Đề tài sẽ tách dòng, xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện được gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập ở Tuyên Quang. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán huyết thanh học có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao trùng gia súc ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc 2.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng 2. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5], vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau: Ngành Sarcomastigophora Phân ngành Mastigophora Lớp Zoomastigophorasida Bộ Kinetoplastorida Phân bộ Trypanosomatorida Họ Trypanosomatidae Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901 Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909 Loài Trypanosoma (S) cruzi Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918 Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trvpanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (N) congolense Loài Trypanosoma (N) siminae Loài Trypanosoma (N) vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906 Loài Trypanosoma (T) brucei n 4 Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843 Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885) Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm), chiều rộng 1,5 - 2 µm.

Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài vào trong được chia thành 3 phần chính: - Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa).

Lớp vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [28]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]). - Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài.

Trong nguyên sinh chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi. - Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng. Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN).

Từ kinetoplast có n 5 một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [28]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]). Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi Kháng nguyên của T.

evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi * Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết thanh thỏ tối miễn dịch với T. evansi, đã phát hiện tới 30 thành phần kháng nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100.

Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại ISG 65 và ISG 75 nằm chen vào phần VSG (Jackson và cs,1993 [26]). Còn ISG 100 do có đặc tính ưa nước và không thể kết hợp với kháng thể của vật chủ, loại này nằm ở túi tiên mao. * Kháng nguyên biến đổi Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG, những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi. Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt.

Lớp áo bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế bào bằng một lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107 phân tử). Lớp áo bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type kháng nguyên biến đổi. Kháng nguyên biến đổi có tính miễn dịch cao, chiếm khoảng 10% protein của tiên mao trùng. Loại kháng nguyên này kích thích tạo kháng thể đặc hiệu đối với từng loại sinh ra nó.

Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới có khả năng kích thích vật chủ tạo miễn dịch chủ động. Người ta ước lượng rằng, một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là từ 5 - 10% số gene của KST cung cấp cho sự biến đổi kháng nguyên n 6 bề mặt này. Quá trình biến đổi kháng nguyên từ trước đến nay đều cho rằng do đáp ứng của KST đối với kháng thể của vật chủ để trốn tránh sự phá hủy của hệ thống miễn dịch. Ngày nay, nhiều quan sát đã cho phép loại bỏ giả thiết này.

Van Meirvenne cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981) [27], hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.

* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG) và với bổ thể, gắn lên trên bề mặt và làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá của gene. Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng các phân tử VSG mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này. Theo Barry và Tumer (1991) [24], các VSG được mã hoá nhờ các gene chuyên biệt.

Từ kho chứa hàng nghìn gene khác nhau, một loại gene VSG được hoạt hoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG. Mỗi bên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ gene của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gene VSG, các gene này sử dụng nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính.