I. Khám phá Exopolysaccharide từ Lactobacillus fermentum EPS
Exopolysaccharide (EPS) là các polymer carbohydrate có trọng lượng phân tử cao, được sinh vật, đặc biệt là vi sinh vật, tiết ra môi trường bên ngoài. Trong số đó, polysaccharide ngoại bào từ vi khuẩn lactic (LAB), cụ thể là chủng Lactobacillus fermentum, đang nhận được sự quan tâm lớn. Chủng vi khuẩn này được công nhận là an toàn (GRAS) và là một probiotic quan trọng trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Các EPS do chủng Lactobacillus này tạo ra không chỉ an toàn mà còn sở hữu nhiều hoạt tính sinh học của EPS quý giá. Chúng có khả năng hoạt động như chất điều hòa miễn dịch, chất chống oxy hóa và kháng khuẩn. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Bảo (2022) cho thấy EPS từ Lactobacillus fermentum có tiềm năng ức chế tế bào ung thư và kích thích phản ứng miễn dịch. Bên cạnh đó, các hợp chất này còn đóng vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm, hoạt động như chất làm đặc, chất ổn định, và chất tạo gel tự nhiên, giúp cải thiện cấu trúc và cảm quan của sản phẩm sữa lên men mà không cần phụ gia tổng hợp. Sự đa dạng về cấu trúc hóa học EPS mang lại phổ ứng dụng rộng rãi, từ dược phẩm, mỹ phẩm đến các vật liệu sinh học tiên tiến. Việc nghiên cứu sâu hơn về quy trình tách chiết EPS và tối ưu hóa sản xuất là một hướng đi đầy hứa hẹn để khai thác tối đa nguồn tài nguyên sinh học này.
1.1. Tổng quan về chủng Lactobacillus và vi khuẩn lactic probiotic
Lactobacillus fermentum là một loại vi khuẩn lactic Gram dương, lên men dị hình và thường được phân lập từ các sản phẩm lên men thực vật hoặc trong đường ruột của động vật. Đây là một probiotic hữu ích, góp phần tạo ra môi trường axit bất lợi cho vi khuẩn gây hại phát triển. Chúng có khả năng ức chế các enzyme do vi khuẩn gây thối tạo ra, qua đó làm giảm nguy cơ hình thành các chất gây ung thư đại tràng. Các chủng vi khuẩn lactic như Lactobacillus fermentum có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và thường được nuôi cấy trên môi trường MRS (Man, Rogosa và Sharpe) để đảm bảo điều kiện phát triển tối ưu. Nhờ những đặc tính vượt trội và được Cục Dược phẩm Hoa Kỳ công nhận là an toàn (GRAS), chúng trở thành đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu sinh tổng hợp hợp chất có giá trị như polysaccharide ngoại bào.
1.2. Đặc điểm cấu trúc hóa học EPS và hoạt tính sinh học
Cấu trúc hóa học EPS rất đa dạng, quyết định đến tính chất và chức năng sinh học của chúng. Dựa trên thành phần monosaccharide, EPS từ vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm chính: Homopolysaccharide (HoPS) và Heteropolysaccharide (HePS). HoPS chỉ được cấu tạo từ một loại monosaccharide (như D-glucose), trong khi HePS có cấu trúc phức tạp hơn, bao gồm nhiều loại đường khác nhau như D-galactose, L-rhamnose. Sự đa dạng này mang lại nhiều hoạt tính sinh học của EPS, bao gồm khả năng chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch, và giảm cholesterol. Các nghiên cứu đã chứng minh EPS có thể kích thích sản xuất các cytokine như IL-6 và TNF-α, thể hiện vai trò trong việc tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Ngọc Bảo, 2022). Những đặc tính này mở ra tiềm năng lớn cho ứng dụng của exopolysaccharide trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.
II. Thách thức trong quy trình tách chiết EPS hiệu suất thấp
Mặc dù tiềm năng ứng dụng của polysaccharide ngoại bào từ Lactobacillus fermentum là rất lớn, việc thương mại hóa chúng vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Rào cản lớn nhất là hiệu suất thu nhận EPS thường ở mức thấp, khiến chi phí sản xuất tăng cao. Quá trình sinh tổng hợp EPS phụ thuộc vào nhiều yếu tố phức tạp như điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, và đặc tính của từng chủng vi khuẩn. Việc tối ưu hóa quá trình lên men để tối đa hóa sản lượng là một bài toán khó, đòi hỏi nhiều nghiên cứu thực nghiệm chi tiết. Một thách thức khác nằm ở quy trình tách chiết EPS và tinh sạch. Dịch lên men là một hỗn hợp phức tạp chứa tế bào vi khuẩn, protein, peptide và các chất chuyển hóa khác. Việc loại bỏ hoàn toàn các tạp chất này, đặc biệt là protein, để thu được sản phẩm EPS có độ tinh khiết cao là một công đoạn quan trọng nhưng không hề đơn giản. Các phương pháp truyền thống có thể làm thất thoát một lượng đáng kể sản phẩm. Do đó, việc xây dựng một quy trình chuẩn hóa, hiệu quả và kinh tế cho việc tinh sạch exopolysaccharide là yêu cầu cấp thiết để thúc đẩy ứng dụng của hợp chất này trong thực tiễn.
2.1. Vấn đề hiệu suất thu nhận EPS và tối ưu hóa quá trình
Năng suất thu nhận thấp là lý do chính cản trở khả năng thương mại hóa EPS từ vi khuẩn lactic. Hiệu suất thu nhận EPS chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố trong quá trình lên men như nhiệt độ, pH, thời gian, và đặc biệt là thành phần dinh dưỡng của môi trường MRS. Việc tối ưu hóa quá trình này là điểm mấu chốt. Mỗi chủng Lactobacillus có yêu cầu riêng về điều kiện nuôi cấy. Nếu các điều kiện không được kiểm soát tối ưu, quá trình sinh tổng hợp EPS sẽ diễn ra chậm chạp, dẫn đến sản lượng cuối cùng không đạt yêu cầu. Cần có những nghiên cứu sâu rộng để xác định các thông số lý tưởng cho từng chủng cụ thể, từ đó cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất.
2.2. Khó khăn khi tinh sạch exopolysaccharide khỏi tạp chất
Quá trình tinh sạch exopolysaccharide là một công đoạn phức tạp. Dịch lên men sau nuôi cấy chứa rất nhiều thành phần không mong muốn, trong đó protein là tạp chất chính cần được loại bỏ. Việc sử dụng các hóa chất như axit trichloroacetic (TCA) để kết tủa protein có thể gây ra hiện tượng đồng kết tủa, làm mất một phần EPS. Theo Cerning J. (1995), cần phải rửa kết tủa nhiều lần để thu hồi tối đa sản phẩm. Bên cạnh đó, các bước như ly tâm, thẩm tích và đông khô cũng đòi hỏi thiết bị chuyên dụng và có thể làm giảm hiệu suất cuối cùng. Việc lựa chọn phương pháp phân lập và tinh sạch phù hợp, cân bằng giữa độ tinh khiết sản phẩm và hiệu suất thu hồi, là một thách thức lớn trong nghiên cứu và sản xuất EPS.
III. Hướng dẫn tối ưu điều kiện nuôi cấy Lactobacillus fermentum
Để nâng cao hiệu suất thu nhận EPS, việc tối ưu hóa quá trình nuôi cấy Lactobacillus fermentum là bước đi tiên quyết. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các thông số trong điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian lên men, và thành phần môi trường dinh dưỡng đều đóng vai trò quan trọng. Luận văn của Nguyễn Ngọc Bảo (2022) đã tiến hành khảo sát chi tiết các yếu tố này trên chủng Lactobacillus fermentum BR11. Kết quả cho thấy nhiệt độ và thời gian lên men là hai thông số quyết định. Khi vi khuẩn được nuôi trong điều kiện tối ưu, hoạt động của các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp EPS diễn ra mạnh mẽ nhất. Bên cạnh đó, việc điều chỉnh nồng độ nguồn carbon (glucose) và nguồn nitơ (cao nấm men) trong môi trường MRS cũng cho thấy sự cải thiện rõ rệt về sản lượng. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố này không chỉ giúp tối đa hóa lượng EPS tạo thành mà còn đảm bảo tính ổn định và đồng nhất của sản phẩm qua các mẻ nuôi cấy.
3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ và thời gian là hai yếu tố cốt lõi trong điều kiện nuôi cấy. Nghiên cứu trên chủng Lb. fermentum BR11 chỉ ra rằng khoảng nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp EPS là 36-37°C. Ở nhiệt độ này, hàm lượng EPS đạt giá trị cao nhất là 441,204 µg/ml (Nguyễn Ngọc Bảo, 2022). Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều ức chế hoạt động của các enzyme liên quan. Về thời gian, quá trình lên men đạt đỉnh sản lượng EPS sau khoảng 48-72 giờ. Cụ thể, sau 72 giờ, hàm lượng EPS đạt 451,56 µg/ml. Kéo dài thời gian hơn nữa không làm tăng sản lượng mà còn có xu hướng giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và tích tụ các chất ức chế. Do đó, việc kết thúc quá trình nuôi cấy vào đúng thời điểm cuối pha log là rất quan trọng.
3.2. Vai trò của nguồn carbon và nitơ trong môi trường MRS
Thành phần dinh dưỡng trong môi trường MRS ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng sản xuất EPS. Nguồn carbon, chủ yếu là glucose, là nguyên liệu chính cho quá trình sinh tổng hợp. Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ glucose 22 g/lít cho hiệu suất thu nhận EPS cao nhất (449,38 µg/ml). Tương tự, nguồn nitơ từ cao nấm men cũng đóng vai trò quyết định. Nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng cao nấm men 7 g/lít là điều kiện lý tưởng, giúp vi khuẩn phát triển tốt và sinh tổng hợp EPS đạt mức 451,56 ug/ml. Việc cân bằng tỷ lệ C/N trong môi trường là một bí quyết để tối ưu hóa quá trình sản xuất polysaccharide ngoại bào.
IV. Phương pháp phân lập và tinh sạch exopolysaccharide EPS
Quy trình tách chiết EPS và tinh sạch là giai đoạn quyết định đến chất lượng và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng. Một phương pháp phân lập hiệu quả phải đảm bảo loại bỏ tối đa tạp chất trong khi giữ lại được lượng polysaccharide ngoại bào cao nhất. Quy trình này thường bao gồm nhiều bước. Đầu tiên, dịch lên men được ly tâm để loại bỏ sinh khối tế bào vi khuẩn. Tiếp theo, protein hòa tan trong dịch nổi được loại bỏ bằng phương pháp kết tủa hóa học, thường sử dụng axit trichloroacetic (TCA). Đây là bước quan trọng để tinh sạch exopolysaccharide. Sau khi loại bỏ tủa protein, dịch nổi chứa EPS tiếp tục được xử lý để thu hồi sản phẩm. Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng dung môi hữu cơ như ethanol lạnh để kết tủa EPS. Tủa EPS thô sau đó được thu lại, hòa tan trong nước và thẩm tích để loại bỏ các phân tử nhỏ như muối và đường đơn. Cuối cùng, sản phẩm được đông khô để thu được bột EPS tinh khiết. Việc phân tích cấu trúc hóa học EPS sau đó có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật hiện đại như phổ hồng ngoại FTIR hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
4.1. Kỹ thuật loại bỏ protein bằng axit trichloroacetic TCA
Việc loại bỏ protein khỏi dịch lên men là một bước thiết yếu trong quy trình tách chiết EPS. Axit trichloroacetic (TCA) là một tác nhân hiệu quả để kết tủa protein. Tuy nhiên, nồng độ TCA cần được tối ưu hóa cẩn thận. Nếu nồng độ quá thấp, protein không được loại bỏ hoàn toàn. Nếu quá cao, TCA có thể gây phân hủy hoặc đồng kết tủa EPS, làm giảm hiệu suất. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Bảo (2022) đã khảo sát các nồng độ TCA khác nhau và kết luận rằng nồng độ 35% là tối ưu cho chủng Lb. fermentum BR11. Ở nồng độ này, lượng protein còn lại trong dịch là thấp nhất trong khi lượng EPS thu được đạt mức cao nhất (452,110 µg/ml).
4.2. Quy trình tách chiết EPS bằng phương pháp tủa ethanol
Sau khi loại bỏ protein, quy trình tách chiết EPS tiếp tục với bước kết tủa bằng ethanol lạnh. Đây là phương pháp phân lập dựa trên sự khác biệt về độ tan. EPS không tan trong ethanol và sẽ kết tủa, trong khi các thành phần hòa tan khác vẫn ở trong dung dịch. Tỷ lệ ethanol so với dịch nổi và thời gian tủa là hai thông số cần được khảo sát. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ thể tích dịch nổi và ethanol là 1:1 và thời gian tủa trong 24 giờ ở 4°C là điều kiện hiệu quả nhất. Việc tăng tỷ lệ ethanol hoặc kéo dài thời gian hơn không cải thiện đáng kể hiệu suất thu nhận EPS. Đây là một bước quan trọng để thu hồi EPS thô trước khi tiến hành các bước tinh sạch sâu hơn.
4.3. Phân tích cấu trúc EPS bằng sắc ký và quang phổ
Để xác định thành phần monosaccharide của EPS thu được, các kỹ thuật phân tích hiện đại được sử dụng. Phổ biến là phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Bảo (2022), mẫu EPS sau khi thủy phân đã được phân tích bằng TLC. Kết quả cho thấy sự xuất hiện của hai vết có hệ số lưu (Rf) tương ứng với chất chuẩn glucose và galactose, xác nhận đây là hai thành phần đường chính cấu tạo nên EPS của chủng Lb. fermentum BR11. Ngoài ra, kỹ thuật phổ hồng ngoại FTIR cũng thường được sử dụng để xác định các nhóm chức đặc trưng và liên kết glycosidic trong cấu trúc hóa học EPS, cung cấp những thông tin quan trọng về đặc tính của polymer.
V. Top ứng dụng của exopolysaccharide trong thực phẩm và y dược
Nhờ các đặc tính chức năng độc đáo, ứng dụng của exopolysaccharide ngày càng trở nên phổ biến trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là công nghệ thực phẩm và dược phẩm. Trong ngành thực phẩm, EPS từ vi khuẩn lactic được xem là một chất phụ gia tự nhiên, an toàn (GRAS). Chúng được sử dụng như chất làm đặc, chất ổn định và chất tạo gel trong các sản phẩm sữa lên men như sữa chua và phô mai. Khả năng giữ nước và cải thiện độ nhớt của EPS giúp tạo ra kết cấu mềm mịn, đồng nhất và ngăn ngừa hiện tượng tách nước, nâng cao giá trị cảm quan cho sản phẩm. Trong lĩnh vực y dược phẩm, EPS thể hiện nhiều hoạt tính sinh học của EPS đầy hứa hẹn. Chúng hoạt động như những prebiotics, kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm, điều hòa miễn dịch và thậm chí là kháng ung thư của các EPS này. Những đặc tính này mở ra tiềm năng ứng dụng EPS trong việc phát triển thực phẩm chức năng và các liệu pháp hỗ trợ điều trị bệnh, biến chúng thành một nguồn tài nguyên sinh học quý giá.
5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm chất làm đặc tạo gel
Trong công nghệ thực phẩm, ứng dụng của exopolysaccharide chủ yếu tập trung vào vai trò cải thiện tính chất lưu biến của sản phẩm. EPS có khả năng tạo thành một mạng lưới ba chiều trong dung dịch, giúp tăng độ nhớt, tạo độ đặc và ổn định cấu trúc. Trong sản xuất sữa chua, việc sử dụng các chủng Lactobacillus có khả năng sinh EPS giúp tạo ra sản phẩm có kết cấu mịn, chắc và giảm thiểu việc sử dụng các chất ổn định công nghiệp. Khả năng tạo gel và giữ nước của EPS cũng giúp cải thiện cảm quan và kéo dài thời gian bảo quản của nhiều sản phẩm thực phẩm khác.
5.2. Tiềm năng dược phẩm và mỹ phẩm chống oxy hóa kháng khuẩn
Lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm đang khai thác mạnh mẽ hoạt tính sinh học của EPS. Khả năng chống oxy hóa giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do, làm chậm quá trình lão hóa. Hoạt tính kháng khuẩn của EPS có thể được ứng dụng để phát triển các tác nhân chống lại vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, khả năng giữ ẩm và tạo màng phim của EPS cũng rất được quan tâm trong ngành mỹ phẩm, giúp tạo ra các sản phẩm chăm sóc da có tác dụng dưỡng ẩm và bảo vệ da hiệu quả. Các nghiên cứu về tác dụng điều hòa miễn dịch và chống khối u cũng đang mở ra những hướng đi mới cho việc sử dụng EPS như một liệu pháp hỗ trợ trong y học.
