Nghiên Cứu Tách Chiết Và Thu Nhận Exopolysaccharide Sinh Tổng Hợp Bởi Lactobacillus Fermentum

Nghiên cứu tách chiết exopolysaccharide từ lactobacillus fermentum, khám phá ứng dụng và tiềm năng trong ngành thực phẩm và dược phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Bảo
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Phương Khanh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tách Chiết Exopolysaccharide Từ Lactobacillus Fermentum
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về Lactobacillus fermentum
• 1.2. Exopolysaccharide từ vi khuẩn LAB
• 1.2.1. Cấu trúc EPS
• 1.2.2. Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic
• 1.2.3. Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian
• 1.2.4. Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường
• 1.3. Điều kiện lên men chủng Lactobacillus fermentum
• 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic
• 1.4.1. Quá trình tách chiết và tinh chế EPS
• 1.5. Ứng dụng của EPS
• 1.5.1. Ứng dụng lĩnh vực y dược
• 1.5.2. Ứng dụng EPS trong công nghệ thực phẩm
• 1.5.3. Ứng dụng tạo vật liệu nghiên cứu thí nghiệm sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
• 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối
• 2.3.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phép đo mật độ quang
• 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS (Vivek K. và cộng sự, 2016)
• 2.3.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TCA lên khả năng loại bỏ protein trong dịch lên men
• 2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thể tích ethanol và thời gian tủa lên quá trình thu nhận EPS tủa từ dịch nổi
• 2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng EPS bằng phenol-sulfuric
• 2.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford
• 2.3.8. Phương pháp phân tích thành phần monosaccharide của EPS bằng sắc ký lớp mỏng
• 2.3.9. Phương pháp xử lý thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng thu nhận EPS
• 3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp EPS
• 3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp EPS
• 3.1.3. Ảnh hưởng của môi trường lên men
• 3.2. Khảo sát điều kiện thu nhận EPS từ dịch lên men
• 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) tới khả năng loại bỏ protein
• 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol đến khả năng tách EPS
• 3.2.3. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS
• 3.3. Xây dựng quy trình tách và thu nhận EPS
• 3.4. Phân tích EPS thu được bằng sắc ký lớp mỏng
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Khám phá Exopolysaccharide từ Lactobacillus fermentum EPS

Exopolysaccharide (EPS) là các polymer carbohydrate có trọng lượng phân tử cao, được sinh vật, đặc biệt là vi sinh vật, tiết ra môi trường bên ngoài. Trong số đó, polysaccharide ngoại bào từ vi khuẩn lactic (LAB), cụ thể là chủng Lactobacillus fermentum, đang nhận được sự quan tâm lớn. Chủng vi khuẩn này được công nhận là an toàn (GRAS) và là một probiotic quan trọng trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Các EPS do chủng Lactobacillus này tạo ra không chỉ an toàn mà còn sở hữu nhiều hoạt tính sinh học của EPS quý giá. Chúng có khả năng hoạt động như chất điều hòa miễn dịch, chất chống oxy hóa và kháng khuẩn. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Bảo (2022) cho thấy EPS từ Lactobacillus fermentum có tiềm năng ức chế tế bào ung thư và kích thích phản ứng miễn dịch. Bên cạnh đó, các hợp chất này còn đóng vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm, hoạt động như chất làm đặc, chất ổn định, và chất tạo gel tự nhiên, giúp cải thiện cấu trúc và cảm quan của sản phẩm sữa lên men mà không cần phụ gia tổng hợp. Sự đa dạng về cấu trúc hóa học EPS mang lại phổ ứng dụng rộng rãi, từ dược phẩm, mỹ phẩm đến các vật liệu sinh học tiên tiến. Việc nghiên cứu sâu hơn về quy trình tách chiết EPS và tối ưu hóa sản xuất là một hướng đi đầy hứa hẹn để khai thác tối đa nguồn tài nguyên sinh học này.

1.1. Tổng quan về chủng Lactobacillus và vi khuẩn lactic probiotic

Lactobacillus fermentum là một loại vi khuẩn lactic Gram dương, lên men dị hình và thường được phân lập từ các sản phẩm lên men thực vật hoặc trong đường ruột của động vật. Đây là một probiotic hữu ích, góp phần tạo ra môi trường axit bất lợi cho vi khuẩn gây hại phát triển. Chúng có khả năng ức chế các enzyme do vi khuẩn gây thối tạo ra, qua đó làm giảm nguy cơ hình thành các chất gây ung thư đại tràng. Các chủng vi khuẩn lactic như Lactobacillus fermentum có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và thường được nuôi cấy trên môi trường MRS (Man, Rogosa và Sharpe) để đảm bảo điều kiện phát triển tối ưu. Nhờ những đặc tính vượt trội và được Cục Dược phẩm Hoa Kỳ công nhận là an toàn (GRAS), chúng trở thành đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu sinh tổng hợp hợp chất có giá trị như polysaccharide ngoại bào.

1.2. Đặc điểm cấu trúc hóa học EPS và hoạt tính sinh học

Cấu trúc hóa học EPS rất đa dạng, quyết định đến tính chất và chức năng sinh học của chúng. Dựa trên thành phần monosaccharide, EPS từ vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm chính: Homopolysaccharide (HoPS) và Heteropolysaccharide (HePS). HoPS chỉ được cấu tạo từ một loại monosaccharide (như D-glucose), trong khi HePS có cấu trúc phức tạp hơn, bao gồm nhiều loại đường khác nhau như D-galactose, L-rhamnose. Sự đa dạng này mang lại nhiều hoạt tính sinh học của EPS, bao gồm khả năng chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch, và giảm cholesterol. Các nghiên cứu đã chứng minh EPS có thể kích thích sản xuất các cytokine như IL-6 và TNF-α, thể hiện vai trò trong việc tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Ngọc Bảo, 2022). Những đặc tính này mở ra tiềm năng lớn cho ứng dụng của exopolysaccharide trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.

II. Thách thức trong quy trình tách chiết EPS hiệu suất thấp

Mặc dù tiềm năng ứng dụng của polysaccharide ngoại bào từ Lactobacillus fermentum là rất lớn, việc thương mại hóa chúng vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Rào cản lớn nhất là hiệu suất thu nhận EPS thường ở mức thấp, khiến chi phí sản xuất tăng cao. Quá trình sinh tổng hợp EPS phụ thuộc vào nhiều yếu tố phức tạp như điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, và đặc tính của từng chủng vi khuẩn. Việc tối ưu hóa quá trình lên men để tối đa hóa sản lượng là một bài toán khó, đòi hỏi nhiều nghiên cứu thực nghiệm chi tiết. Một thách thức khác nằm ở quy trình tách chiết EPS và tinh sạch. Dịch lên men là một hỗn hợp phức tạp chứa tế bào vi khuẩn, protein, peptide và các chất chuyển hóa khác. Việc loại bỏ hoàn toàn các tạp chất này, đặc biệt là protein, để thu được sản phẩm EPS có độ tinh khiết cao là một công đoạn quan trọng nhưng không hề đơn giản. Các phương pháp truyền thống có thể làm thất thoát một lượng đáng kể sản phẩm. Do đó, việc xây dựng một quy trình chuẩn hóa, hiệu quả và kinh tế cho việc tinh sạch exopolysaccharide là yêu cầu cấp thiết để thúc đẩy ứng dụng của hợp chất này trong thực tiễn.

2.1. Vấn đề hiệu suất thu nhận EPS và tối ưu hóa quá trình

Năng suất thu nhận thấp là lý do chính cản trở khả năng thương mại hóa EPS từ vi khuẩn lactic. Hiệu suất thu nhận EPS chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố trong quá trình lên men như nhiệt độ, pH, thời gian, và đặc biệt là thành phần dinh dưỡng của môi trường MRS. Việc tối ưu hóa quá trình này là điểm mấu chốt. Mỗi chủng Lactobacillus có yêu cầu riêng về điều kiện nuôi cấy. Nếu các điều kiện không được kiểm soát tối ưu, quá trình sinh tổng hợp EPS sẽ diễn ra chậm chạp, dẫn đến sản lượng cuối cùng không đạt yêu cầu. Cần có những nghiên cứu sâu rộng để xác định các thông số lý tưởng cho từng chủng cụ thể, từ đó cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất.

2.2. Khó khăn khi tinh sạch exopolysaccharide khỏi tạp chất

Quá trình tinh sạch exopolysaccharide là một công đoạn phức tạp. Dịch lên men sau nuôi cấy chứa rất nhiều thành phần không mong muốn, trong đó protein là tạp chất chính cần được loại bỏ. Việc sử dụng các hóa chất như axit trichloroacetic (TCA) để kết tủa protein có thể gây ra hiện tượng đồng kết tủa, làm mất một phần EPS. Theo Cerning J. (1995), cần phải rửa kết tủa nhiều lần để thu hồi tối đa sản phẩm. Bên cạnh đó, các bước như ly tâm, thẩm tích và đông khô cũng đòi hỏi thiết bị chuyên dụng và có thể làm giảm hiệu suất cuối cùng. Việc lựa chọn phương pháp phân lập và tinh sạch phù hợp, cân bằng giữa độ tinh khiết sản phẩm và hiệu suất thu hồi, là một thách thức lớn trong nghiên cứu và sản xuất EPS.

III. Hướng dẫn tối ưu điều kiện nuôi cấy Lactobacillus fermentum

Để nâng cao hiệu suất thu nhận EPS, việc tối ưu hóa quá trình nuôi cấy Lactobacillus fermentum là bước đi tiên quyết. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các thông số trong điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian lên men, và thành phần môi trường dinh dưỡng đều đóng vai trò quan trọng. Luận văn của Nguyễn Ngọc Bảo (2022) đã tiến hành khảo sát chi tiết các yếu tố này trên chủng Lactobacillus fermentum BR11. Kết quả cho thấy nhiệt độ và thời gian lên men là hai thông số quyết định. Khi vi khuẩn được nuôi trong điều kiện tối ưu, hoạt động của các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp EPS diễn ra mạnh mẽ nhất. Bên cạnh đó, việc điều chỉnh nồng độ nguồn carbon (glucose) và nguồn nitơ (cao nấm men) trong môi trường MRS cũng cho thấy sự cải thiện rõ rệt về sản lượng. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố này không chỉ giúp tối đa hóa lượng EPS tạo thành mà còn đảm bảo tính ổn định và đồng nhất của sản phẩm qua các mẻ nuôi cấy.

3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ và thời gian là hai yếu tố cốt lõi trong điều kiện nuôi cấy. Nghiên cứu trên chủng Lb. fermentum BR11 chỉ ra rằng khoảng nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp EPS là 36-37°C. Ở nhiệt độ này, hàm lượng EPS đạt giá trị cao nhất là 441,204 µg/ml (Nguyễn Ngọc Bảo, 2022). Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều ức chế hoạt động của các enzyme liên quan. Về thời gian, quá trình lên men đạt đỉnh sản lượng EPS sau khoảng 48-72 giờ. Cụ thể, sau 72 giờ, hàm lượng EPS đạt 451,56 µg/ml. Kéo dài thời gian hơn nữa không làm tăng sản lượng mà còn có xu hướng giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và tích tụ các chất ức chế. Do đó, việc kết thúc quá trình nuôi cấy vào đúng thời điểm cuối pha log là rất quan trọng.

3.2. Vai trò của nguồn carbon và nitơ trong môi trường MRS

Thành phần dinh dưỡng trong môi trường MRS ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng sản xuất EPS. Nguồn carbon, chủ yếu là glucose, là nguyên liệu chính cho quá trình sinh tổng hợp. Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ glucose 22 g/lít cho hiệu suất thu nhận EPS cao nhất (449,38 µg/ml). Tương tự, nguồn nitơ từ cao nấm men cũng đóng vai trò quyết định. Nghiên cứu chỉ ra rằng hàm lượng cao nấm men 7 g/lít là điều kiện lý tưởng, giúp vi khuẩn phát triển tốt và sinh tổng hợp EPS đạt mức 451,56 ug/ml. Việc cân bằng tỷ lệ C/N trong môi trường là một bí quyết để tối ưu hóa quá trình sản xuất polysaccharide ngoại bào.

IV. Phương pháp phân lập và tinh sạch exopolysaccharide EPS

Quy trình tách chiết EPS và tinh sạch là giai đoạn quyết định đến chất lượng và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng. Một phương pháp phân lập hiệu quả phải đảm bảo loại bỏ tối đa tạp chất trong khi giữ lại được lượng polysaccharide ngoại bào cao nhất. Quy trình này thường bao gồm nhiều bước. Đầu tiên, dịch lên men được ly tâm để loại bỏ sinh khối tế bào vi khuẩn. Tiếp theo, protein hòa tan trong dịch nổi được loại bỏ bằng phương pháp kết tủa hóa học, thường sử dụng axit trichloroacetic (TCA). Đây là bước quan trọng để tinh sạch exopolysaccharide. Sau khi loại bỏ tủa protein, dịch nổi chứa EPS tiếp tục được xử lý để thu hồi sản phẩm. Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng dung môi hữu cơ như ethanol lạnh để kết tủa EPS. Tủa EPS thô sau đó được thu lại, hòa tan trong nước và thẩm tích để loại bỏ các phân tử nhỏ như muối và đường đơn. Cuối cùng, sản phẩm được đông khô để thu được bột EPS tinh khiết. Việc phân tích cấu trúc hóa học EPS sau đó có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật hiện đại như phổ hồng ngoại FTIR hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

4.1. Kỹ thuật loại bỏ protein bằng axit trichloroacetic TCA

Việc loại bỏ protein khỏi dịch lên men là một bước thiết yếu trong quy trình tách chiết EPS. Axit trichloroacetic (TCA) là một tác nhân hiệu quả để kết tủa protein. Tuy nhiên, nồng độ TCA cần được tối ưu hóa cẩn thận. Nếu nồng độ quá thấp, protein không được loại bỏ hoàn toàn. Nếu quá cao, TCA có thể gây phân hủy hoặc đồng kết tủa EPS, làm giảm hiệu suất. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Bảo (2022) đã khảo sát các nồng độ TCA khác nhau và kết luận rằng nồng độ 35% là tối ưu cho chủng Lb. fermentum BR11. Ở nồng độ này, lượng protein còn lại trong dịch là thấp nhất trong khi lượng EPS thu được đạt mức cao nhất (452,110 µg/ml).

4.2. Quy trình tách chiết EPS bằng phương pháp tủa ethanol

Sau khi loại bỏ protein, quy trình tách chiết EPS tiếp tục với bước kết tủa bằng ethanol lạnh. Đây là phương pháp phân lập dựa trên sự khác biệt về độ tan. EPS không tan trong ethanol và sẽ kết tủa, trong khi các thành phần hòa tan khác vẫn ở trong dung dịch. Tỷ lệ ethanol so với dịch nổi và thời gian tủa là hai thông số cần được khảo sát. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ thể tích dịch nổi và ethanol là 1:1 và thời gian tủa trong 24 giờ ở 4°C là điều kiện hiệu quả nhất. Việc tăng tỷ lệ ethanol hoặc kéo dài thời gian hơn không cải thiện đáng kể hiệu suất thu nhận EPS. Đây là một bước quan trọng để thu hồi EPS thô trước khi tiến hành các bước tinh sạch sâu hơn.

4.3. Phân tích cấu trúc EPS bằng sắc ký và quang phổ

Để xác định thành phần monosaccharide của EPS thu được, các kỹ thuật phân tích hiện đại được sử dụng. Phổ biến là phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Bảo (2022), mẫu EPS sau khi thủy phân đã được phân tích bằng TLC. Kết quả cho thấy sự xuất hiện của hai vết có hệ số lưu (Rf) tương ứng với chất chuẩn glucose và galactose, xác nhận đây là hai thành phần đường chính cấu tạo nên EPS của chủng Lb. fermentum BR11. Ngoài ra, kỹ thuật phổ hồng ngoại FTIR cũng thường được sử dụng để xác định các nhóm chức đặc trưng và liên kết glycosidic trong cấu trúc hóa học EPS, cung cấp những thông tin quan trọng về đặc tính của polymer.

V. Top ứng dụng của exopolysaccharide trong thực phẩm và y dược

Nhờ các đặc tính chức năng độc đáo, ứng dụng của exopolysaccharide ngày càng trở nên phổ biến trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là công nghệ thực phẩm và dược phẩm. Trong ngành thực phẩm, EPS từ vi khuẩn lactic được xem là một chất phụ gia tự nhiên, an toàn (GRAS). Chúng được sử dụng như chất làm đặc, chất ổn định và chất tạo gel trong các sản phẩm sữa lên men như sữa chua và phô mai. Khả năng giữ nước và cải thiện độ nhớt của EPS giúp tạo ra kết cấu mềm mịn, đồng nhất và ngăn ngừa hiện tượng tách nước, nâng cao giá trị cảm quan cho sản phẩm. Trong lĩnh vực y dược phẩm, EPS thể hiện nhiều hoạt tính sinh học của EPS đầy hứa hẹn. Chúng hoạt động như những prebiotics, kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm, điều hòa miễn dịch và thậm chí là kháng ung thư của các EPS này. Những đặc tính này mở ra tiềm năng ứng dụng EPS trong việc phát triển thực phẩm chức năng và các liệu pháp hỗ trợ điều trị bệnh, biến chúng thành một nguồn tài nguyên sinh học quý giá.

5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm chất làm đặc tạo gel

Trong công nghệ thực phẩm, ứng dụng của exopolysaccharide chủ yếu tập trung vào vai trò cải thiện tính chất lưu biến của sản phẩm. EPS có khả năng tạo thành một mạng lưới ba chiều trong dung dịch, giúp tăng độ nhớt, tạo độ đặc và ổn định cấu trúc. Trong sản xuất sữa chua, việc sử dụng các chủng Lactobacillus có khả năng sinh EPS giúp tạo ra sản phẩm có kết cấu mịn, chắc và giảm thiểu việc sử dụng các chất ổn định công nghiệp. Khả năng tạo gel và giữ nước của EPS cũng giúp cải thiện cảm quan và kéo dài thời gian bảo quản của nhiều sản phẩm thực phẩm khác.

5.2. Tiềm năng dược phẩm và mỹ phẩm chống oxy hóa kháng khuẩn

Lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm đang khai thác mạnh mẽ hoạt tính sinh học của EPS. Khả năng chống oxy hóa giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do, làm chậm quá trình lão hóa. Hoạt tính kháng khuẩn của EPS có thể được ứng dụng để phát triển các tác nhân chống lại vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, khả năng giữ ẩm và tạo màng phim của EPS cũng rất được quan tâm trong ngành mỹ phẩm, giúp tạo ra các sản phẩm chăm sóc da có tác dụng dưỡng ẩm và bảo vệ da hiệu quả. Các nghiên cứu về tác dụng điều hòa miễn dịch và chống khối u cũng đang mở ra những hướng đi mới cho việc sử dụng EPS như một liệu pháp hỗ trợ trong y học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong xu hướng phát triển các hợp chất có nguồn gốc sinh học, exopolysaccharide (EPS) sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) đang trở thành tâm điểm nghiên cứu nhờ tính an toàn cao đạt chuẩn GRAS (Generally Recognized As Safe). Tuy nhiên, rào cản lớn nhất đối với việc thương mại hóa là năng suất sinh tổng hợp của vi khuẩn lactic thường ở mức khiêm tốn, chỉ dao động từ vài chục đến dưới 500 µg/ml trong môi trường truyền thống. Nhằm giải quyết điểm nghẽn về mặt công nghệ này, luận văn thạc sĩ "Nghiên cứu tách chiết và thu nhận exopolysaccharide sinh tổng hợp bởi Lactobacillus fermentum" do học viên Nguyễn Ngọc Bảo thực hiện đã tập trung tối ưu hóa các điều kiện lên men và thiết lập quy trình tách chiết tinh sạch hiệu suất cao từ chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum BR11.

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu gồm: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian, nguồn dinh dưỡng carbon và nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp EPS; xác định các thông số tối ưu cho quá trình loại bỏ protein bằng acid trichloroacetic (TCA) và kết tủa bằng ethanol; phân tích thành phần monosaccharide của polymer thu nhận được. Đề tài được triển khai thực nghiệm toàn diện trong 12 tháng, từ tháng 12/2020 đến tháng 11/2021 tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội. Ý nghĩa của nghiên cứu được khẳng định qua việc nâng hàm lượng EPS thu nhận lên mức cực đại 451,56 µg/ml, tăng hơn 139% so với thời điểm 24 giờ lên men ban đầu (đạt 188,35 µg/ml), đồng thời tiết kiệm 50% lượng dung môi hữu cơ nhờ chuẩn hóa tỷ lệ kết tủa ethanol 1:1, mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong công nghệ thực phẩm và y dược.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai trục lý thuyết sinh hóa và vi sinh học cốt lõi:

Thứ nhất là lý thuyết chuyển hóa carbohydrate và con đường sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào ở vi khuẩn lactic. Quá trình này diễn ra qua chuỗi phản ứng enzyme nội bào: glucose ngoại bào đi vào tế bào chất được hexokinase phosphoryl hóa thành Glucose-6-phosphate (Glc-6P), sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) chuyển vị thành Glucose-1-phosphate (Glc-1P). Tiếp theo, enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) xúc tác tạo thành nucleotide-đường Uridine diphosphate glucose (UDP-glc), đóng vai trò là cơ chất tiền thể để enzyme glycosyltransferase (GTF) liên kết các gốc đường thành chuỗi polymer.

Thứ hai là lý thuyết cấu trúc polysaccharide vi sinh vật, phân định rõ giữa Homopolysaccharide (HoPS - polymer đồng thể cấu tạo từ một loại monosaccharide) và Heteropolysaccharide (HePS - polymer dị thể cấu thành từ hai hay nhiều loại gốc đường khác nhau như glucose, galactose, rhamnose).

Các khái niệm chính được vận dụng bao gồm: tiêu chuẩn an toàn sinh học GRAS của FDA, đặc tính sinh học probiotic của chi Lactobacillus, phương pháp tủa điểm đẳng điện protein bằng acid mạnh và cơ chế khử nước tạo tủa polymer của dung môi phân cực.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và cỡ mẫu: Đối tượng nghiên cứu là chủng thuần khiết Lactobacillus fermentum BR11 do Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử cung cấp. Toàn bộ các mẻ thí nghiệm nuôi cấy và tách chiết được thực hiện ở quy mô 250 - 500 ml môi trường MRS cải tiến. Các chuỗi khảo sát (7 mức nhiệt độ từ 20°C đến 44°C; 11 mốc thời gian từ 12 đến 78 giờ; 5 mức nồng độ glucose từ 18 đến 26 g/l; 5 mức cao nấm men từ 4 đến 8 g/l; 7 nồng độ TCA từ 10% đến 40%; 5 tỷ lệ dung môi ethanol) đều được bố trí lặp lại độc lập 3 lần (cỡ mẫu n = 3) theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên hoàn toàn nhằm kiểm soát sai số ngẫu nhiên và đảm bảo độ tin cậy thực nghiệm.

Phương pháp phân tích:

• Xác định mật độ tế bào vi khuẩn: Đo mật độ quang OD tại bước sóng 600 nm, đối chiếu chuẩn OD600nm = 1 tương ứng mật độ 8 x 10^8 CFU/ml.
• Định lượng EPS: Sử dụng phản ứng tạo màu Phenol - Acid Sulfuric đo độ hấp thụ tại bước sóng 490 nm, ngoại suy từ phương trình đường chuẩn D-glucose Y = 0,0169x + 0,0221 có độ tương quan tuyến tính rất cao với R² = 0,9995.
• Định lượng protein tồn dư: Sử dụng phương pháp Bradford đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm với phương trình đường chuẩn BSA Y = 0,0073x - 0,0097 (R² = 0,996). Lý do lựa chọn hai phương pháp quang phổ này là tính chuyên biệt cao, thao tác nhanh, độ nhạy vượt trội trong dải nồng độ microgram và sai số phân tích dưới 5%.
• Phân tích định tính thành phần monosaccharide: Thủy phân mẫu EPS tinh khiết bằng acid trifluoroacetic (TFA) 2M ở 100°C trong 5 giờ, sau đó phân tách sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản silica gel kích thước 20 x 20 cm với hệ dung môi khai triển n-butanol : ethanol : nước (tỷ lệ 2:1:1 thể tích) và hiện màu bằng N-(1-naphthyl)-ethylenediamine.
• Xử lý thống kê: Toàn bộ số liệu được phân tích phương sai một yếu tố ANOVA trên phần mềm SPSS 26, kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 5 phát hiện quan trọng có giá trị thực nghiệm cao:

Thứ nhất, nhiệt độ lên men tối ưu của Lactobacillus fermentum BR11 đạt tại 36°C với hàm lượng EPS thu được là 441,204 µg/ml. Mức này cao hơn 115,0% so với khi nuôi ở 20°C (205,215 µg/ml) và cao hơn 45,7% so với khi nuôi ở 44°C (302,876 µg/ml).

Thứ hai, động học lên men cho thấy hàm lượng EPS tăng trưởng mạnh từ sau 24 giờ (188,35 µg/ml) và đạt trạng thái ổn định ở 66 - 72 giờ với nồng độ 445,42 µg/ml cùng mật độ tế bào đạt OD600nm = 3,95, trước khi bước vào giai đoạn suy thoái ở 78 giờ.

Thứ ba, dinh dưỡng môi trường tối ưu được xác lập ở mức 22 g/l glucose (đạt 449,38 µg/ml EPS, tăng 10,9% so với mức 18 g/l đạt 405,24 µg/ml) và 7 g/l cao nấm men (đạt đỉnh 451,56 µg/ml EPS, tăng 6,7% so với mức 4 g/l đạt 423,22 µg/ml).

Thứ tư, nồng độ acid trichloroacetic (TCA) 35% cho hiệu quả loại bỏ protein tốt nhất, hạ hàm lượng protein trong dịch nổi xuống còn 287,55 µg/ml và bảo toàn nồng độ EPS ở mức 452,11 µg/ml. Khi tăng nồng độ TCA lên 40%, lượng protein giảm không đáng kể (284,95 µg/ml) nhưng hàm lượng EPS bị giảm xuống còn 449,63 µg/ml do hiện tượng thủy phân acid.

Thứ năm, tỷ lệ ethanol lạnh bổ sung vào dịch nổi tối ưu là 1:1 (v/v) với thời gian ủ tủa 24 giờ ở 4°C, thu được hàm lượng EPS là 450,24 µg/ml. Phân tích TLC xác định sản phẩm có 2 vết sắc ký rõ nét với hệ số lưu giữ Rf lần lượt là 0,66 và 0,76, trùng khớp hoàn toàn với chất chuẩn Galactose (Rf = 0,66) và Glucose (Rf = 0,76).

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng Lactobacillus fermentum BR11 là chủng vi sinh vật ưa ấm, có hệ enzyme chuyển hóa glycosyltransferase hoạt động mạnh nhất ở khoảng nhiệt độ 35°C - 37°C. Khi nhiệt độ môi trường giảm dưới 30°C hoặc vượt quá 40°C, vận tốc phản ứng enzyme suy giảm nghiêm trọng làm giảm hiệu suất sinh tổng hợp. Dữ liệu động học có thể biểu diễn rất trực quan qua biểu đồ kết hợp giữa đường biểu diễn mật độ quang OD600nm và biểu đồ cột thể hiện hàm lượng EPS theo thời gian. Sự tích lũy EPS diễn ra song hành cùng pha lũy thừa của tế bào từ 12 đến 48 giờ và đạt đỉnh ở cuối pha cân bằng (72 giờ). Sau mốc này, lượng EPS giảm nhẹ do chất dinh dưỡng cạn kiệt và vi khuẩn tiết enzyme phân giải ngược polysaccharide để duy trì trao đổi chất.

Việc nồng độ cao nấm men 7 g/l và glucose 22 g/l kích thích tối đa quá trình sinh sản cho thấy vi khuẩn đòi hỏi nguồn carbon dễ hấp thu kết hợp cùng nguồn nitơ hữu cơ dồi dào để tổng hợp sinh khối và enzyme nội bào. Kết quả phân tích TLC xác nhận EPS thu được thuộc nhóm Heteropolysaccharide (HePS) phân nhánh chứa hai đơn vị đường cơ bản là Glucose và Galactose. Phát hiện này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế về cấu trúc HePS của chi Lactobacillus, khẳng định tiềm năng ứng dụng của chế phẩm làm chất tạo đặc, tạo nhũ tự nhiên và prebiotic trong công nghệ thực phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao và phát triển các kết quả của luận văn vào thực tiễn sản xuất, 4 khuyến nghị hành động cụ thể được đề xuất:

1. Chuẩn hóa quy trình lên men quy mô pilot 50 - 100 lít: Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học cần áp dụng công thức môi trường MRS cải tiến gồm 22 g/l glucose và 7 g/l cao nấm men, duy trì chế độ nhiệt 36°C - 37°C trong thời gian 72 giờ. Mục tiêu hướng tới nâng hiệu suất thu hồi polymer sinh học đạt trên 500 mg/l trong giai đoạn thử nghiệm 6 tháng tới.

2. Tối ưu hóa dây chuyền thu hồi và tái sử dụng dung môi: Doanh nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm cần triển khai công nghệ tủa protein bằng TCA 35% kết hợp tủa cồn ethanol tỷ lệ 1:1 ở 4°C trong 24 giờ. Quy trình này giúp cắt giảm 50% đến 66,7% lượng dung môi hữu cơ so với tỷ lệ 1:2 và 1:3 truyền thống, giúp tiết kiệm ước tính 30% chi phí xử lý và tái chế cồn trong vòng 1 năm vận hành.

3. Giải mã cấu trúc phân tử bậc cao: Các nhóm nghiên cứu chuyên sâu tại các trường đại học cần ứng dụng kỹ thuật sắc ký lọc gel hiệu năng cao (HPGPC) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong giai đoạn tiếp theo để xác định chính xác khối lượng phân tử (dự kiến nằm trong khoảng 10^5 đến 10^6 Da) cùng trật tự liên kết glycoside của EPS từ chủng BR11.

4. Khảo nghiệm hoạt tính sinh học in vitro và in vivo: Các phòng thí nghiệm dược lý cần tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch qua đại thực bào THP-1 và năng lực làm giảm cholesterol máu của chế phẩm EPS trong vòng 12 tháng, tạo cơ sở pháp lý để đăng ký các dòng thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo học thuật và công nghệ giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học và Hóa sinh: Tài liệu cung cấp quy chuẩn thực nghiệm mẫu mực về phương pháp bố trí thí nghiệm vi sinh, kỹ thuật dựng đường chuẩn quang phổ (với hệ số tin cậy R² trên 0,996) và kỹ thuật phân tích sắc ký lớp mỏng TLC để định tính monosaccharide.

2. Kỹ sư R&D tại các doanh nghiệp sản xuất sữa lên men, sữa chua và đồ uống dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp các thông số kỹ thuật (tỷ lệ tủa 1:1, nồng độ TCA 35%) để thu hồi chất ổn định kết cấu tự nhiên, thay thế phụ gia nhân tạo và nâng cao độ nhớt sản phẩm mà không làm biến đổi hương vị.

3. Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các viện, trường đại học khối khoa học sức khỏe: Khai thác các dữ liệu về đặc tính an toàn GRAS và cấu trúc Heteropolysaccharide của chủng Lactobacillus fermentum làm luận cứ khoa học để mở rộng các đề tài phát triển chất bổ trợ điều hòa miễn dịch và phòng chống ung thư.

4. Doanh nghiệp khởi nghiệp và nhà đầu tư trong ngành công nghệ sinh học xanh: Nắm bắt các chỉ số kinh tế kỹ thuật (thời gian 72 giờ, nhiệt độ 36°C, năng suất 451,56 µg/ml) để xây dựng mô hình dự toán tài chính và báo cáo khả thi thương mại hóa polymer sinh học vi sinh.

Câu hỏi thường gặp

Chủng Lactobacillus fermentum BR11 và exopolysaccharide sinh ra có an toàn cho người dùng không? Chủng Lactobacillus fermentum là vi khuẩn lactic đường ruột lành tính, được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ công nhận đạt chuẩn an toàn GRAS. Exopolysaccharide do chủng BR11 tiết ra là polymer sinh học tự nhiên, hoàn toàn không chứa độc tố tế bào và rất thân thiện với sức khỏe con người.

Tại sao nồng độ acid trichloroacetic (TCA) 35% là lựa chọn tối ưu để loại bỏ protein? Số liệu thực nghiệm chứng minh TCA 35% giúp khử protein tồn dư xuống mức 287,55 µg/ml và đạt hàm lượng EPS 452,11 µg/ml. Nếu tăng TCA lên 40%, lượng protein giảm không đáng kể (284,95 µg/ml) nhưng nồng độ acid quá cao sẽ thủy phân mạch polysaccharide, khiến hàm lượng EPS hao hụt còn 449,63 µg/ml.

Tỷ lệ thể tích ethanol 1:1 mang lại ưu thế kinh tế gì so với tỷ lệ 1:2 hay 1:3? Nghiên cứu khẳng định tỷ lệ ethanol : dịch nổi là 1:1 (v/v) đã tủa hoàn toàn lượng EPS đạt mức 450,24 µg/ml sau 24 giờ. Việc tăng lượng ethanol lên gấp 2 hay 3 lần không làm tăng thêm lượng tủa mà gây lãng phí dung môi, do đó tỷ lệ 1:1 giúp doanh nghiệp tiết kiệm hơn 50% chi phí dung môi.

Thành phần cấu tạo của exopolysaccharide từ chủng BR11 gồm những loại monosaccharide nào? Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng TLC sau khi thủy phân bằng TFA 2M ở 100°C đã xác định 2 vết sắc ký có hệ số lưu giữ Rf = 0,66 và Rf = 0,76, trùng khớp hoàn toàn với chất chuẩn Galactose và Glucose, chứng minh EPS thuộc loại Heteropolysaccharide (HePS).

Vì sao quá trình lên men nên kết thúc ở mốc 72 giờ mà không kéo dài hơn? Sau 72 giờ, hàm lượng EPS đạt đỉnh 451,56 µg/ml và vi khuẩn hoàn tất pha cân bằng. Kéo dài thời gian nuôi cấy sẽ khiến nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, vi khuẩn bước vào pha suy vong và kích hoạt enzyme nội tại tự phân giải EPS làm năng lượng, dẫn đến suy giảm chất lượng và sản lượng polymer.

Kết luận

• Công trình đã tối ưu hóa thành công các thông số lên men chủng Lactobacillus fermentum BR11 ở nhiệt độ 36°C - 37°C trong 72 giờ trên môi trường MRS cải tiến bổ sung 22 g/l glucose và 7 g/l cao nấm men, đưa năng suất EPS đạt mức kỷ lục 451,56 µg/ml.
• Thiết lập quy trình tách chiết tinh sạch hiệu quả cao với nồng độ TCA 35% giúp loại bỏ triệt để protein lạ và kết tủa bằng ethanol tỷ lệ 1:1 (v/v) trong 24 giờ ở 4°C, tiết kiệm hơn 50% chi phí dung môi hữu cơ.
• Phân tích sắc ký lớp mỏng TLC chứng minh exopolysaccharide thu được là một Heteropolysaccharide (HePS) được cấu thành từ hai đơn vị monosaccharide chủ đạo là Glucose (Rf = 0,76) và Galactose (Rf = 0,66).
• Đóng góp nguồn dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác, có tính lặp lại cao, tạo tiền đề vững chắc cho việc khai thác nguồn polymer tự nhiên đạt chuẩn an toàn GRAS phục vụ ngành công nghiệp thực phẩm và y dược tại Việt Nam.
• Đề ra lộ trình 12 đến 24 tháng tới nhằm mở rộng quy mô sản xuất bán công nghiệp và khảo sát sâu các hoạt tính dược lý chống oxy hóa, hạ cholesterol máu.

Các nhà nghiên cứu, kỹ sư công nghệ và doanh nghiệp hãy khai thác ngay nguồn cơ sở dữ liệu thực nghiệm giá trị từ luận văn để tối ưu hóa quy trình sản xuất và phát triển các dòng sản phẩm sinh học đột phá.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Exopolysaccharid (EPS) đƣợc phân lập từ vi sinh vật đặc biệt từ vi khuẩn Lactobacillus fermentum (LAB) có rất nhiều ứng dụng quan trọng. Nhiều ứng dụng thực tế đã đƣợc rõ tác dụng chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn nhƣ ức chế tế bào ung thƣ biểu mô (dòng SiHa) và kích thích sản xuất Il-6 và TNF- α bởi dòng đại thực bào THP-1. Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng tính kháng khuẩn cũng chỉ ra đặc tính khử trùng tốt của các exopolysaccharid đƣợc nghiên cứu chống lại S. Một số ứng dụng hoạt tính sinh học đƣợc mô tả có tác dụng hạ cholesterol máu.

Việc thu nhận, tạo chế phẩm từ EPS đáp ứng nhu cầu sử dụng gia tăng các polymer tự nhiên ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và công nghệ mỹ phẩm, EPS đóng vai trò là tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel. Những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS nhƣ khả năng chống oxy hóa, chống ung thƣ, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng đƣợc nghiên cứu. Do đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng nhƣ sự an toàn đối với sức khỏe con ngƣời thì vi khuẩn lactic lactic (LAB) đƣợc "công nhận là vi sinh vật an toàn" (GRAS-Generally Recognized As Safe). Vì vậy các chủng LAB đƣợc quan tâm nhiều để lên men sinh tổng hợp EPS và đồng thời chủng này có lợi thế hơn với EPS từ các loài khác (Vivek và cộng sự, 2016).

Bên cạnh nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học đã đƣợc ghi nhận, EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhƣợc điểm là năng suất thu nhận thấp là lý do chính khiến khả năng thƣơng mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) nói riêng. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết ra bên ngoài môi 1 trƣờng. Các PS tách chiết đƣợc có sự đa dạng về cấu trúc và tính chất, chức năng (Zhou và Li, 2015). Việc nghiên cứu, lên men tăng hiệu suất sinh tổng hợp EPS và cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS đƣợc coi là điểm mấu chốt để sản xuất EPS nhằm ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, y học.

Để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS từ lên men, đến thu nhận, tách chiết EPS sinh tổng hợp từ một chủng LAB là chủng Lactobacillus fermentum BR11, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tách chiết và thu nhận exopolysaccharide sinh tổng hợp bởi Lactobacillus fermentum”. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát đƣợc các điều kiện lên men thích hợp và xây dựng đƣợc quy trình thu nhận và tách chiết exopolyschacaride tạo ra từ chủng Lactobacillus fermentum BR11. Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu các điều kiện thích hợp lên men thu nhận EPS từ chủng Lactobacillus fermentum.  Xây dựng quy trình tách và thu nhận EPS.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2020 đến tháng 11/2021. Địa điểm nghiên cứu: Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của Khoa Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội tại Nhà C, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về Lactobacilus fermentum Lactobacillus fermentum là chủng vi khuẩn Gram dƣơng thuộc chi Lactobacillus, thƣờng đƣợc tìm thấy trong lên men từ động vật hoặc thực vật (Ramchandran cs, 2009, Amjres và cs. Lactobacillus fermentum là những vi khuẩn ƣa ẩm, có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, lên men dị hình và có thể lên men đƣờng nhƣ glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose.

Lactobacillus fermentum (LAB) là vi khuẩn Gram (+), là vi khuẩn đƣờng ruột lên men hữu ích thuộc chi Lactobacillus, thƣờng có mặt trong hệ tiêu hoá của ngƣời và động vật. Một số chủng Lactobacillus đƣợc coi là vi khuẩn có lợi hoặc vi khuẩn thân thiện ở động vật. Chủng đã đƣợc "công nhận là vi sinh vật an toàn" theo đánh giá cục dƣợc của Mỹ (GRAS-Generally Recognized As Safe) (hình 1. Vi khuẩn lactic có dạng lƣỡng cầu, tứ cầu, liên cầu hoặc hình que, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi.

Chúng có nhu cầu dinh dƣỡng cao và khả năng sinh tổng hợp thuộc dạng yếu. Hầu hết các vi sinh vật sinh axít lactic đều thuộc họ Lactobacillaceae và đƣợc xếp vào 4 chi: Streptoccocus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Vi khuẩn Lactobacillus sinh axít lactic và các cơ chất khác nhau tạo môi trƣờng bất lợi cho vi khuẩn gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hoá. Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết (ruột già, đại tràng) tạo ra các enzyme beta-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase, thúc đẩy sự xuất hiện của carcinogen (chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u) bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trƣờng axít không thuận lợi.

Ngƣợc lại, vi khuẩn Lactobacillus kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết dẫn tới làm giảm sự hình thành carcinogen gây ung thƣ đại tràng. fermentum có thể tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đƣờng kính khoảng 1μm (Hình 1. Hình dạng khuẩn lạc có thể lồi 3 lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1. Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc Lb.

fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm khi đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi (Hình 1. Hầu hết các tế bào vi khuẩn đƣợc sắp xếp dƣới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp, không có khả năng sinh bào tử và không di động Hình 1. Hình dạng khuẩn lạc Lactobacillus fermentum Từ lâu, Lb. fermentum đã đƣợc sử dụng nhƣ là giống khởi đầu cho quá trình lên men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống.Giống nhƣ các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbonhydrate, ngoài sản phẩm chính là acid latic, Lb.

fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hƣơng (diacetyl/acetoin) và đặc biệt là các EPS. Do có tính tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm nên chúng ngày càng quan trọng và có giá trị. Chúng có tiềm năng làm probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thƣ.2 Expolysacharide từ vi khuẩn LAB 1.1 Cấu trúc EPS Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thƣờng đƣợc coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng nhƣ là nguồn năng lƣợng dự trữ (tinh bột, glycogen), tạo nên cấu trúc vững chắc cho 4 thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin), là chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật) (De Vuyst L. Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều loại PS khác nhau.

Tùy theo vị trí trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào hoặc ngoại bào. Những PS đƣợc tiết ra bên ngoài màng tế bào đƣợc gọi là PS ngoại bào. Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt gọi là PS dạng màng bao, hoặc cũng có thể đƣợc gắn lỏng lẻo hay đƣợc bài tiết hoàn toàn ra môi trƣờng dƣới dạng chất nhờn gọi là EPS, theo các nghiên cứu đã công bố của Cerning J. và cộng sự (2012).

Cụ thể hơn, đây là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của monosaccharide (Nwodo U. và cộng sự, 2012). Trong các nghiên cứu lần lƣợt bởi Sutherland I. và cộng sự (2011), căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các EPS từ vi khuẩn lactic đƣợc chia thành hai nhóm lớn là các polysaccharide dị thể - heteropolysaccharide (HePS) và các polysaccharide đồng thể - homopolysaccharide (HoPS).2: Cấu trúc dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS 5 - Nhóm homopolysaccharide (HoPS) HoPS là những PS đƣợc cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) nhƣ D-glucose hoặc D-fructose.

Các chi thuộc vi khuẩn lactic nhƣ Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.) đƣợc biết đến nhƣ là nguồn sinh tổng hợp HoPS. Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS - Nhóm heteropolysaccharide (HePS) Khác với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại, cũng nhƣ đặc điểm cấu tạo và khối lƣợng phân tử của polymer (Hình 1. Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào, gồm một chuỗi các phản ứng phức tạp liên quan đến hệ enzyme nội bào của vi khuẩn lactic và thƣờng trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đƣờng trung gian và (c) quá trình tổng hợp PS (Kumar và cộng sự, 2007).Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS 6 1.2 Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn lactic có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào. Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme (Laws và cộng sự, 2008; Patel và Prajapati, 2013).

Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyl- transferase (FTF - fructansucrase). Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ tín hiệu xuất. Sau đó, chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glucose (glc) và fructose (fruc), tạo ra liên kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận thành chuỗi glucan hoặc fructan. Đây chính là các HoPS ngoại bào hay các EPS (Hình 1.3: Mô hình về quá trình sinh tổng hợp EPS 7 Một số vi khuẩn sản xuất một lƣợng lớn các phân tử polysaccharide có trọng lƣợng phân tử cao, còn gọi là exopolysaccharide.

Lớp áo ngoại bào này đƣợc gọi là vỏ vi khuẩn. Khả năng sản xuất vỏ là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất của vi khuẩn về phƣơng diện xâm nhập tại vị trí viêm. Cụ thể, vỏ vi khuẩn giúp vi khuẩn chống lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng nhƣ đề kháng kháng sinh.3 Sự chuyển hóa tạo nên các loại đƣờng trung gian Quá trình chuyển hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đƣờng. Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa.

Đây là chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp EPS và các quá trình dị hóa để phân giải đƣờng. Trƣớc hết, dƣới tác dụng của hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P). Sau đó, dƣới tác dụng của phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P đƣợc chuyển thành Glc-1P.4 Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đƣờng Glc-1P tiếp tục đƣợc chuyển hóa thành các nucleotide-đƣờng (NDP) nhƣ Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDP- glc), nhờ xúc tác của các enzyme tƣơng ứng là UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP). Nhƣ vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn đƣợc cấu tạo bởi các monome đa dạng hơn nhƣ D-gal, L-rham, v.