CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bacterioxin Vi sinh vật là một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh có liên quan tới thực phẩm. Ngay trong những ngày đầu tiên, kể từ khi người ta phát hiện ra vi sinh vật và ảnh hưởng của chúng đối với con người, người ta đã tìm mọi cách để có thể kiểm soát được sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm. Ngoài các biện pháp truyền thống như sấy, bảo quản lạnh, thanh trùng, ướp muối… thì một biện pháp khác cũng rất phổ biến đó là sử dụng các chất phụ gia bảo quản thực phẩm.
Trong các chất phụ gia bảo quản thực phẩm, phải kể đến một nhóm các chất bảo quản có tên gọi là bacterioxin. Bacterioxin được tạo ra bởi vi khuẩn, bản chất thường là oligo hoặc polypeptit và có các đặc tính tiêu diệt các vi khuẩn có quan hệ họ hàng với chủng sản [16]. Bacterioxin được biết đến đầu tiên là colicin - được tạo ra bởi chủng vi khuẩn Gram âm E. Được phát hiện lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925, “principe V” là sản phẩm của 1 chủng E.
coli để chống lại các chủng E. Gratia và Fredericq (1946) đã gọi chất này bằng thuật ngữ “colicin”, sau đó đến năm 1953, Jacob và một số cộng sự đã gọi bằng thuật ngữ “bacterioxin” để chỉ các protein khả năng kháng khuẩn. Thuật ngữ colicin hiện nay dùng để nhấn mạnh các protein kháng khuẩn được tạo ra bởi các vi khuẩn E. coli và các chủng thuộc Enterobacteriaceae [44].
Ban đầu, các bacterioxin (cũng như colicin) được định nghĩa là các protein kháng khuẩn có phổ tác dụng hẹp, có thể hấp phụ lên các vị trí đặc biệt trên bề mặt của tế bào. Khi phát hiện ra một kháng sinh mới, để dự đoán 4 chất này có phải là một bacterixin hay không, người ta thường xác định bản chất protein của chúng thông qua việc sử dụng các enzym proteaza. Người ta có thể xác định một chất là bacterioxin thông qua 6 tiêu chuẩn sau đây [1] [20]: − Phổ tác dụng hẹp, chỉ có tác dụng ức chế với các loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng với vi khuẩn sinh ra nó. − Trong phân tử có một phần là protein cần thiết cho tác dụng ức chế của nó.
− Chúng là chất gây độc đối với vi khuẩn đối kháng. − Để ức chế được các vi khuẩn nhạy cảm, bacterioxin phải được gắn vào một chất mang đặc hiệu trên tế bào nhạy cảm. − Vi khuẩn sinh ra bacterioxin phải tự sinh ra chất kháng bacterioxin của nó và hai phân tử này đều nằm ở plasmit. − Được tổng hợp khi có tác động qua lại với vi khuẩn đối kháng.
Bacterioxin gồm nhiều loại khác nhau, trong đó bacterioxin của vi khuẩn lactic được quan tâm nhất bởi hiệu quả và mức độ an toàn của chúng. Mỗi bacterioxin được chọn lọc và dùng để chống lại các chủng vi khuẩn cụ thể. Tuy nhiên, hiệu quả của nó trong thực phẩm còn bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác. Bacterioxin của vi khuẩn lactic được chia thành 3 nhóm chính (bảng 1.1), trong đó nhóm I (lantibiotic) là nhóm được chú ý nhất trong các nghiên cứu hiện nay.1: Bacterioxin của vi khuẩn lactic [51].
Bacterioxin Chủng sản Phổ tác dụng Kích thước (aa a ) Nhóm I: Lantibiotic Nisin (A và Z) Lactococcus lactis Rộng 34 Lacticin 481 Lactococcus lactis Rộng 27 Lactocin S Lactococcus sake Rộng 37 Carnocin U149 Carnobacterium pisicola Rộng 35-37 Variacin Micrococcus varians Rộng 25 Nhóm II: Phi - lantibiotic, kích thước nhỏ, bền nhiệt Lactococcin A Lactococcus lactis Hẹp 54 Lactococcin B Lactococcus lactis Hẹp 47 Lactococcin M Lactococcus lactis Hẹp 48 Mesenterocin 52B Leuconostoc mesenteroides Hẹp 32 Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus TB 31 Bacterioxin giống Pediocin: Sakacin A Lactobacillus sake TBb 41 Sakacin P Lactobacillus sake TB 41 Carnobacterioxin A, B Carnobacterium piscicola TB 53, 48 Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici TB 44 Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum TB 37 Enterocin 1146/A Enterococcus faecium TB 47 Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola TB 44 Nhóm III: Kích thước lớn, kém bền nhiệt Helveticin J Lactobacillus helveticus Hẹp 333 Chú thích: : aa: axit amin; TB : Trung bình a b Nhóm lantibotic bao gồm các peptit kích thước nhỏ (65 kDa) chứa các axit amin bất thường (các axit amin thioete) lanthionin (Lan) L- 6 metyllanthionin (MeLan) và một số các axit amin dehydrat (dehydrated amino acids) như 2,3-didehydroalanin (Dha) (do serin khử nước) và 2,3- didehydrobutyrin (Dhb) (do threonin khử nước) [58]. Lịch sử nghiên cứu về nisin Nisin là một bacterioxin được tạo ra bởi một số chủng vi khuẩn Lactococcus lactis. Cho đến này, nisin được nghiên cứu nhiều nhất về các tính chất và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Lịch sử nghiên cứu nisin kéo dài gần một thể kỷ qua, kể từ những năm 1925, khi người ta lần đầu tiên phát hiện ra nisin [20].
Khi xem xét những bất thường trong quá trình xuất phomat như hiện tượng lên men diễn ra chậm hoặc hỏng, người ta đã phát hiện ra nguyên nhân của hiện tượng này là do thực khuẩn thể và một số chủng vi khuẩn hình cầu có trong sữa có khả năng ức chế các chủng vi sinh vật khác trong quá trình lên men. Năm 1928, Rogers và Whittier là người đầu tiên công bố về tác động ức chế của nisin sinh ra do Streptococcus lactis (hiện nay Lactococcus lactis subsp. lactis) đối với Lactobacillus bulgaricus [20]. Tên nisin được Mattick và Hirsch (1947) gọi là xuất phát từ ý nghĩa “ chất ức chế N” (N inhibitory substance), bởi vì Lactococcus lactis ban đầu được phân vào nhóm N Streptococcus.
Ban đầu người ta chỉ nghiên cứu ứng dụng nisin trong y học và nisin chủ yếu được nghiên cứu để ứng dụng vào chống bệnh viêm vú của bò sữa [37]. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu sau đó đã chỉ ra là nisin không thích hợp cho mục đích đó bởi độ hoà tan thấp ở pH sinh lý, và bị thuỷ phân bởi proteaza của hệ tiêu hóa. Ngược lại, xuất phát từ những ưu điểm: không độc, không kích thích tăng trưởng, có hoạt tính chống Clostridium, nisin có thể trở thành chất bảo 7 quản thực phẩm có hiệu quả. Năm 1951, Hirsch và một số tác giả khác bắt đầu kiểm tra khả năng ứng dụng vào thực phẩm của nisin.
Hirch đã chứng minh: sử dụng chủng vi khuẩn lactic sinh nisin làm giống lên men ban đầu (starter culture) có thể ngăn chặn sự hư hỏng phomat gây ra bởi Clostridium botulium [36]. Cùng lúc đó, nhiều nhà nghiên cứu khác cũng đã sử dụng chủng vi khuẩn sinh nisin vào quá trình lên men phomat để ức chế sự lên men butyric của các vi khuẩn gây hư hỏng và gây thối phomat [20]. Cho tới năm 1957, nisin bắt đầu xuất hiện trong các phân xưởng sản xuất pho mát quy mô nông trại để bảo quản các sản phẩm làm ra. Cũng trong năm này, hãng Aplin and Barrett đã đưa ra chế phẩm thương mại của nisin để sử dụng trong thực phẩm [20].
Dạng chế phẩm của nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường đó là Nisaplin TM, với thành phần 2,5 % nisin, 77,5 % NaCl và sữa gầy [16, 51, 75]. Gross và Morrell là người đầu tiên làm sáng tỏ cấu trúc của nisin vào năm 1971 [31]. Sau đó, có ít nhất là 6 loại nisin được phát hiện thấy và được xác định các tính chất (các loại này được ký hiệu bằng các ký tự từ A đến E và Z), trong đó loại nisin A là dạng hoạt động nhất. Mức độ an toàn của nisin Người ta đã thử nghiệm mức độ an toàn của nisin trên 2 loại động vật chuột và lợn và đã khẳng định nisin không có hại hoặc gây ảnh hưởng rất ít đối với động vật thí nghiệm [27, 70].
Giá trị LD50 đối với động vật thí nghiệm là 7 g/kg trọng lượng cơ thể [38]. Tổ chức nông lương thực và thực phẩm quốc tế, tổ chức y tế thế giới (FAO/WHO) đồng ý cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969 [15, 16, 20]. Hiện nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng với ký hiệu quốc tế E234. Tổ chức FAO/WHO cũng 8 khuyến cáo mức hấp phụ tối đa hàng ngày nisin vào trong cơ thể cho 1 người nặng 70 kg là 60 mg nisin tinh khiết, tương đương với 33000 đơn vị hoạt tính quốc tế [15, 16, 20].
Tuy nhiên, ở Australia, Pháp, Anh, người ta cho phép sử dụng nisin không hạn chế trong công nghiệp chế biến phomat. Ở Mỹ, lượng nisin sử dụng tối đa trong thực phẩm là 10000 đơn vị hoạt tính trên 1 gam thực phẩm; ở Nga là 8000 đơn vị hoạt tính trên 1 gam sản phẩm [15]. Trong khi đó ở Argentina, Italy và Mexico, giới hạn này lại thấp, chỉ khoảng 500 đơn vị hoạt tính quốc tế trên 1 gam đối với sản phẩm format chế biến và các sản phẩm khác [15]. Ở Mỹ, cơ quản quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) cho phép sử dụng bacterioxin nisin như là phụ gia thực phẩm an toàn (GRAS - generally recognized as safe).
Khi một chất kháng sinh tự nhiên được sử dụng như là chất bảo quản thực phẩm thì chủng vi sinh vật sinh ra chất kháng sinh đó cũng được coi là vi sinh vật an toàn (GRAS - generally recognized as safe microorganism). Do vậy, việc sử dụng các chủng vi khuẩn sinh nisin như các lactococci không bị hạn chế [15, 16]. Hướng nghiên cứu chính về nisin hiện nay Hiện nay, nisin đã được sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thế giới [20]. Tuy nhiên, những nghiên cứu về nisin vẫn đang diễn ra liên tục theo một số hướng chính: − Nghiên cứu mở rộng tác động của nisin với các chủng vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc - vốn có tính kháng nisin ở điều kiện thông thường.
− Nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm, thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm. Tính chất của nisin 1. Cấu trúc của nisin. Cấu trúc hoàn thiện của nisin được làm sáng tỏ bởi Gross và Morell vào đầu những năm 70.
Nisin được xếp vào nhóm 1: lantibiotics chứa các axit amin dị thường [40, 51, 75]. Phân tử nisin bao gồm 34 axit amin trong đó có 1 số là axit amin đã cải biến. Những cải biến đó là sự khử nước ở xerin và threonin, tạo ra axit amin dehydroalanin và axit amin dehydrobutyrin. Các axít amin này liên kết với các axit amin khác thông qua cầu lưu huỳnh, tạo thành 5 vòng đặc trưng (hình 1.1: Cấu trúc phân tử nisin [30, 32].
Năm nội vòng phân tử được tạo bởi các liên kết thioete. Trong đó vòng A 3-7, Ala-S-Ala là lanthionine, còn 4 vòng B, C, D, E tương ứng 8-11, 13- 19, 23-26, 25-28 là các β-metyl lanthionine.