Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị alzheimer trên thực nghiệm của đan sâm di thực salvia miltiorrhiza bunge lamiaceae

Luận án tiến sĩ y tế nghiên cứu dược học nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị alzheimer trên thực nghiệm của đan sâm di thực, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Trần Thị Loan
• Người hướng dẫn: PGS. Đào Thị Vui
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược lý - Dược lâm sàng
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Của Đan Sâm Di Thực Trong Điều Trị Alzheimer
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
• 1.3. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• 1.4. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.5. Tổng quan về bệnh Alzheimer
• 1.5.1. Khái niệm
• 1.5.2. Dịch tễ
• 1.5.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng
• 1.5.4. Cơ chế bệnh sinh và các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh
• 1.5.5. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer và hợp chất đang nghiên cứu
• 1.5.5.1. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer
• 1.5.5.2. Tổng quan về các hợp chất đang nghiên cứu trong điều trị bệnh Alzheimer
• 1.5.6. Tổng quan một số mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm và phương pháp đánh giá trong nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer
• 1.5.6.1. Các mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm
• 1.5.6.2. Phương pháp đánh giá tác dụng thông qua các test hành vi
• 1.5.6.3. Phương pháp đánh giá tác dụng trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.5.7. Tổng quan về Đan sâm
• 1.5.7.1. Tên khoa học
• 1.5.7.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
• 1.5.7.3. Bộ phận dùng
• 1.5.7.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ Đan sâm
• 1.5.7.5. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm
• 1.6. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.6.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 1.6.2. Dược liệu nghiên cứu
• 1.6.3. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
• 1.6.4. Động vật nghiên cứu
• 1.6.5. Tế bào nghiên cứu
• 1.6.6. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
• 1.6.7. Hóa chất nghiên cứu
• 1.6.8. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
• 1.6.9. Địa điểm nghiên cứu
• 1.6.10. Nội dung nghiên cứu
• 1.6.11. Phương pháp nghiên cứu
• 1.6.11.1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi
• 1.6.11.2. Phương pháp đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.6.12. Xử lý số liệu
• 1.7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.7.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi
• 1.7.1.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin
• 1.7.1.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35
• 1.7.1.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin
• 1.7.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.7.2.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết cholinergic
• 1.7.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid
• 1.7.2.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa
• 1.7.3. Đối tượng nghiên cứu và liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu
• 1.7.3.1. Dược liệu nghiên cứu
• 1.7.3.2. Chiết xuất mẫu nghiên cứu
• 1.7.3.3. Liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu
• 1.7.4. Tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi
• 1.7.4.1. Các test hành vi sử dụng trong nghiên cứu
• 1.7.4.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin
• 1.7.4.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35
• 1.7.4.4. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin
• 1.7.5. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.7.5.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên đích liên quan đến giả thuyết cholinergic
• 1.7.5.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid
• 1.7.5.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa
• 1.8. Bàn luận chung
• 1.9. Đóng góp và hạn chế của đề tài
• 1.9.1. Đóng góp của đề tài
• 1.9.2. Hạn chế của đề tài
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Theo thống kê, số lượng bệnh nhân mắc bệnh này đang gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao. Theo báo cáo của World Alzheimer Report năm 2019, có khoảng 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ, trong đó 60-80% là bệnh Alzheimer. Tỷ lệ mắc mới tăng từ 5-7 triệu người mỗi năm, dự đoán sẽ có khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 2050. Bệnh Alzheimer không chỉ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu tại Hoa Kỳ mà còn tạo ra gánh nặng lớn về chi phí điều trị cho xã hội. Hiện tại, chỉ có bốn loại thuốc được chấp thuận để điều trị triệu chứng rối loạn nhận thức của bệnh này, chủ yếu tập trung vào việc ức chế enzym acetylcholinesterase. Tuy nhiên, nghiên cứu hiện nay đang mở rộng ra nhiều giả thuyết khác nhau về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, bao gồm giả thuyết β-amyloid và stress oxy hóa.

1.1. Dịch tễ học

Bệnh Alzheimer có tỷ lệ mắc cao ở người cao tuổi, với khoảng 4% dân số trên 60 tuổi và 20-40% dân số trên 85 tuổi mắc bệnh. Tại Mỹ, ước tính có 5,8 triệu người trên 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer, và con số này dự kiến sẽ tăng lên 13,8 triệu vào năm 2050. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm khoảng 4,5% dân số. Điều này cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh Alzheimer.

II. Đan sâm di thực và tác dụng của nó

Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge) đã được sử dụng trong y học cổ truyền hơn 1000 năm qua. Nghiên cứu cho thấy các hoạt chất trong rễ Đan sâm có khả năng cải thiện suy giảm trí nhớ thông qua việc ức chế enzym acetylcholinesterase và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng Đan sâm di thực có thể có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh Alzheimer, đặc biệt là trong việc giảm thiểu các triệu chứng liên quan đến suy giảm trí nhớ. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đan sâm di thực trong điều trị Alzheimer vẫn còn hạn chế.

2.1. Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Đan sâm di thực có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase, một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Hơn nữa, Đan sâm còn có khả năng chống stress oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương. Những tác dụng này cho thấy Đan sâm di thực có tiềm năng lớn trong việc phát triển thành một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh Alzheimer, đặc biệt trong bối cảnh các phương pháp điều trị hiện tại còn nhiều hạn chế.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng của Đan sâm di thực trong điều trị Alzheimer được thực hiện thông qua các mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm. Các test hành vi được sử dụng để đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên các mô hình này. Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, từ đó xác định được hiệu quả và cơ chế tác dụng của Đan sâm di thực.

3.1. Mô hình nghiên cứu

Các mô hình gây suy giảm trí nhớ được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm mô hình scopolamin, β-amyloid25-35 và trimethyltin. Những mô hình này cho phép đánh giá tác dụng của Đan sâm di thực trên các triệu chứng của bệnh Alzheimer một cách chính xác. Kết quả từ các test hành vi sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng cải thiện trí nhớ và chức năng nhận thức của Đan sâm di thực.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao rễ Đan sâm di thực có tác dụng tích cực trong việc cải thiện các triệu chứng suy giảm trí nhớ trên các mô hình thực nghiệm. Cụ thể, cao rễ Đan sâm đã cho thấy khả năng ức chế hoạt động của enzym acetylcholinesterase, từ đó làm tăng nồng độ acetylcholine trong não. Hơn nữa, Đan sâm di thực cũng cho thấy khả năng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid, một yếu tố chính trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Những kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh Alzheimer.

4.1. Tác dụng trên mô hình thực nghiệm

Cao rễ Đan sâm di thực đã được chứng minh là có tác dụng tích cực trên các mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin và β-amyloid25-35. Kết quả cho thấy thời gian khám phá đồ vật và khả năng nhận diện đồ vật của chuột thí nghiệm được cải thiện rõ rệt khi sử dụng cao rễ Đan sâm. Điều này chứng tỏ rằng Đan sâm di thực có thể là một phương pháp điều trị tiềm năng cho bệnh Alzheimer, giúp cải thiện chức năng nhận thức và trí nhớ.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi, chiếm từ 60% đến 80% trong tổng số 50 triệu ca sa sút trí tuệ được thống kê trên toàn cầu vào năm 2019 theo World Alzheimer Report. Tỷ lệ mắc mới ghi nhận từ 5 đến 7 triệu người mỗi năm và dự báo sẽ đạt khoảng 115 triệu ca vào năm 2050. Bệnh được xác định là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu tại Hoa Kỳ và tạo ra áp lực kinh tế rất lớn cho hệ thống y tế. Mặc dù cơ chế bệnh sinh liên quan đến nhiều giả thuyết phức tạp như cholinergic, glutamat, beta-amyloid, protein tau và stress oxy hóa, nhưng tính đến thời điểm nghiên cứu, các cơ quan quản lý mới chỉ phê duyệt 4 hoạt chất điều trị triệu chứng nhận thức gồm donepezil, galantamin, rivastigmin (ức chế enzym acetylcholinesterase) và memantin (ức chế thụ thể NMDA). Từ năm 2003 đến năm 2021, không có thêm thuốc mới nào được cấp phép; tỷ lệ thử nghiệm thất bại giai đoạn lâm sàng lên tới 99,6%. Xu hướng nghiên cứu quốc tế đang chuyển dịch mạnh mẽ sang tìm kiếm các hợp chất đa mục tiêu có nguồn gốc từ dược liệu nhằm nâng cao hiệu quả và giảm thiểu tác dụng không mong muốn.

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà - Lamiaceae) là vị thuốc cổ truyền chứa hai nhóm hoạt chất chính: nhóm diterpenoid tan trong dầu (tanshinon I, IIA, IIB, cryptotanshinon, dihydrotanshinon I) và nhóm acid phenolic tan trong nước (acid salvianolic A, B, danshensu). Dược liệu này đã được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam và gieo trồng thành công tại một số tỉnh miền núi phía Bắc. Tuy nhiên, các công bố trong nước trước đó mới chỉ dừng lại ở việc khảo sát sơ bộ tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và khả năng chống oxy hóa in vitro của cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực. Thực tế khoa học còn thiếu vắng các nghiên cứu thực nghiệm có hệ thống trên mô hình động vật sống (in vivo) cũng như việc làm sáng tỏ cơ chế tác dụng đồng thời trên nhiều đích bệnh sinh của nguồn dược liệu di thực này.

Nhằm giải quyết câu hỏi nghiên cứu về khả năng điều trị và các đích tác dụng sinh học của Đan sâm di thực đối với bệnh Alzheimer, luận án tiến sĩ dược học của tác giả Trần Thị Loan đã xác định 2 mục tiêu cụ thể:

1. Nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi.
2. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Dược liệu: Rễ cây Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Lamiaceae) 1 năm tuổi, thu hái tại xã Tân Lập, huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La (tọa độ: 20,9089°B; 104,6377°Đ) vào tháng 12 năm 2017. Mẫu cây được định danh và lưu giữ tại Bảo tàng Thực vật thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (tiêu bản số HNU 022613) và Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (tiêu bản số DSL2668).
• Dạng bào chế thử nghiệm: Cao toàn phần ethanol 95% (EĐS) và cao phân đoạn n-hexan (HĐS) rễ Đan sâm di thực.
• Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng giống đực chủng Swiss albino, 7–8 tuần tuổi, khối lượng 20–25 g, được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Dòng tế bào: Dòng tế bào lai thần kinh NG108-15 (lai giữa dòng tế bào u nguyên bào thần kinh chuột cống N18TG2 và u thần kinh đệm chuột nhắt C6BU-1), do Giáo sư Michihisa Tohda (Đại học Toyama, Nhật Bản) tài trợ.
• Thời gian và địa điểm thực hiện: Công trình hoàn thành năm 2021 tại Bộ môn Dược lực và Bộ môn Dược lâm sàng (Trường Đại học Dược Hà Nội), phối hợp với Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn và Khoa Dược lý - Sinh hóa (Viện Dược liệu), Đại học Y Dược (Đại học Quốc gia Hà Nội) cùng Trung tâm Nghiên cứu Trồng và Chế biến Cây thuốc Hà Nội.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan chi tiết các giả thuyết bệnh sinh kinh điển và hiện đại của bệnh Alzheimer:

• Giả thuyết cholinergic do Davies P. đề xuất năm 1976: Nhấn mạnh vai trò của acetylcholin (ACh), enzym tổng hợp cholin acetyltransferase (ChAT) và enzym thủy phân acetylcholinesterase (AChE) tại não trước và hồi hải mã.
• Giả thuyết glutamat do Simpson M. hình thành năm 1988: Sự tích lũy glutamat ngoại bào kích thích quá mức thụ thể NMDA, gây tràn dòng Ca2+ nội bào và rối loạn chức năng ty thể.
• Giả thuyết beta-amyloid do Hardy J. đề xuất năm 1991: Quá trình phân cắt bất thường protein tiền chất amyloid (APP) bởi enzym beta-secretase (BACE) và gamma-secretase tạo thành peptid độc tính beta-amyloid1-42 và beta-amyloid25-35, gây lắng đọng mảng amyloid ngoại bào.
• Giả thuyết tau do Wischik C. khởi xướng: Sự mất cân bằng giữa enzym kinase (GSK-3beta, CDK) và phosphatase dẫn đến phosphoryl hóa quá mức protein tau, hình thành các đám rối sợi thần kinh (NFTs).
• Giả thuyết stress oxy hóa do Volicer L. đề xuất năm 1990: Sự mất cân bằng giữa các gốc tự do (O2•-, OH-, H2O2, NO, ONOO-) và hệ thống enzym chống oxy hóa (SOD, GPx, CAT), gây peroxid hóa lipid màng tế bào tạo sản phẩm giáng hóa malondialdehyd (MDA).

Trên bình diện quốc tế, các nghiên cứu dược lý thực nghiệm về Đan sâm và các dẫn xuất đã được tác giả hệ thống hóa:

• Nghiên cứu in vivo: Cao toàn phần chiết bằng ethanol 50% ở mức liều 200 mg/kg trên chuột cống chưa thể hiện tác dụng cải thiện trí nhớ trong test né tránh thụ động và nhận diện đồ vật, song có tác dụng ức chế hoạt độ AChE vỏ não trước và hải mã [161]. Hoạt chất tanshinon I, tanshinon IIA và dihydrotanshinon I có khả năng cải thiện suy giảm trí nhớ do scopolamin trên chuột nhắt ở test né tránh thụ động và ức chế AChE mô não [95]. Cryptotanshinon cải thiện trí nhớ trong test né tránh thụ động [95] và mê lộ nước Morris [222]. Acid salvianolic B cải thiện hành vi của chuột nhắt trên mê lộ chữ Y [96], test né tránh thụ động [96], [119] và làm giảm hàm lượng MDA mô não [119]. Tanshinon IIA cải thiện trí nhớ không gian trên mê lộ nước Morris đối với mô hình tiêm beta-amyloid25-35 [241].
• Nghiên cứu in vitro: Cao toàn phần ethanol 95% ức chế enzym AChE với IC50 = 5 microgam/ml [129], [239], bảo vệ tế bào thần kinh trước độc tính beta-amyloid25-35 ở nồng độ 2,0 mg/ml [239]. Dihydrotanshinon I và cryptotanshinon ức chế AChE theo cơ chế không cạnh tranh hỗn hợp [223]. Tanshinon IIA ức chế tăng nồng độ Ca2+ nội bào do glutamat [199], ức chế enzym GSK-3beta và ngăn kết tập tau [52], [190]. Các hoạt chất nhóm tanshinon và acid phenolic đều thể hiện khả năng dọn gốc tự do peroxy, DPPH, ABTS và anion superoxid [130], [140], [234], [238], [242].

Tại Việt Nam, nghiên cứu năm 2017 của nhóm tác giả trong nước [8] ghi nhận cao toàn phần ethanol 80% rễ Đan sâm di thực ức chế AChE với IC50 = 77,21 microgam/ml và dọn gốc DPPH với IC50 = 69,86 microgam/ml. Các cao phân đoạn ethyl acetat và n-butanol ức chế AChE với IC50 lần lượt là 15,07 và 25,45 microgam/ml; cao phân đoạn n-hexan không thể hiện tác dụng ức chế AChE ở nồng độ từ 2,5 đến 250 microgam/ml nhưng có tác dụng dọn gốc DPPH với IC50 = 163,91 microgam/ml.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Chưa có công trình nào đánh giá toàn diện tác dụng cải thiện trí nhớ của Đan sâm di thực trồng tại Việt Nam trên các mô hình động vật sống (in vivo). Luận án định vị nghiên cứu tập trung vào phân đoạn chiết n-hexan giàu diterpenoid (tanshinon) song song với cao toàn phần ethanol, đánh giá đồng thời trên 3 mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm đại diện cho 3 cơ chế bệnh sinh (scopolamin, beta-amyloid25-35, trimethyltin) và làm sáng tỏ cơ chế tác dụng thông qua các đích sinh hóa cụ thể.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án xây dựng khung phân tích thực nghiệm dựa trên mô hình bệnh sinh đa cơ chế của bệnh Alzheimer, bao gồm: hệ thống dẫn truyền cholinergic, tổn thương tế bào do lắng đọng đoạn peptid độc beta-amyloid25-35, và hiện tượng stress oxy hóa gây peroxid hóa lipid màng tế bào.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm hai trục chính:

1. Bào chế mẫu và chuẩn hóa hóa học

• Chiết xuất cao toàn phần ethanol (EĐS): 10,0 kg bột thô rễ Đan sâm (độ ẩm 9,4%) được ngâm lạnh với ethanol 95% trong 10 ngày, rút dịch chiết tốc độ 1,5 lit/giờ, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 55°C, cô cách thủy và sấy chân không ở 55°C thu được 1520,20 g cao EĐS (hiệu suất 15,0%, độ ẩm 10,6%).
• Chiết xuất cao phân đoạn n-hexan (HĐS): Phân tán 734,16 g EĐS vào nước cất theo tỷ lệ khối lượng:thể tích là 1:2, chiết phân đoạn lỏng-lỏng với n-hexan theo tỷ lệ 1:5 lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết n-hexan, thu hồi dung môi và sấy chân không thu được 19,74 g cao HĐS (hiệu suất chiết phân đoạn 2,9%, độ ẩm 2,8%).
• Hệ số quy đổi liều: 1 g EĐS tương đương với 0,0292 g HĐS.
• Định lượng hoạt chất bằng HPLC theo Dược điển Việt Nam V: Rễ nguyên liệu đạt hàm lượng tanshinon IIA 0,61% và acid salvianolic B 8,69%. Cao EĐS chứa 3,1% tanshinon IIA và 11,6% acid salvianolic B. Cao HĐS chứa 5,6% tanshinon IIA và 3,0% acid salvianolic B.

2. Mô hình thực nghiệm và test hành vi in vivo

Nghiên cứu sử dụng 3 mô hình hóa học gây suy giảm trí nhớ trên chuột nhắt trắng Swiss albino:

• Mô hình đối kháng cholinergic bằng scopolamin: Tiêm màng bụng scopolamin hydrobromid ở mức liều 1 hoặc 3 mg/kg trước khi thực hiện test hành vi 30 phút.
• Mô hình gây độc thần kinh bằng beta-amyloid: Ủ hoạt hóa phân đoạn peptid beta-amyloid25-35 ở 37°C trong 4 ngày để tạo dạng oligomer; sau đó tiêm liều đơn 9 nmol vào não thất phải (i.c.v) của chuột bằng bơm thẩm tách vi lượng CMA402 gắn hệ thống định vị không gian ba chiều Stoelting.
• Mô hình stress oxy hóa bằng trimethyltin (TMT): Tiêm màng bụng liều đơn trimethyltin clorid từ 2,3 đến 2,5 mg/kg để gây hủy hoại tế bào thần kinh hồi hải mã.

Bốn test hành vi chuẩn hóa được áp dụng để đánh giá từng dạng trí nhớ:

• Test mê lộ chữ Y (Y-maze): Đánh giá trí nhớ không gian ngắn hạn; ghi nhận tổng số lần vào cánh và tính tỷ lệ chuyển tiếp tự nhiên (spontaneous alternation percentage).
• Test nhận diện đồ vật mới (NOR): Đánh giá trí nhớ nhận diện; ghi nhận thời gian khám phá đồ vật quen thuộc và đồ vật mới trong pha kiểm tra, tính chỉ số phân biệt (discrimination index).
• Test né tránh thụ động (Passive Avoidance): Đánh giá trí nhớ cảm xúc liên kết tín hiệu tiêu cực; sử dụng hộp hai ngăn sáng-tối và máy phát sốc điện chân LE10026 Shocker (Harvard Apparatus), đo thời gian tiềm tàng bước vào buồng tối trong pha luyện tập và pha kiểm tra sau 24 giờ.
• Test mê lộ nước Morris (MWM): Đánh giá trí nhớ không gian dài hạn; đo thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ẩn qua các ngày luyện tập liên tiếp và thời gian chuột bơi ở góc phần tư đích trong pha kiểm tra không có bến đỗ (probe trial).

3. Phương pháp đánh giá trên các đích sinh hóa và tế bào

• Tác dụng ức chế enzym AChE: Định lượng theo phương pháp đo quang của Ellman G. và cộng sự, sử dụng cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử màu acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB), đo mật độ quang ở bước sóng 412 nm trên đầu đọc Bio-Tek ELISA. Đánh giá hoạt độ AChE trong dịch đồng thể mô não chuột và trên enzym AChE tinh khiết từ Electrophorus electricus. Xác định đặc điểm động học ức chế thông qua đồ thị Lineweaver-Burk (mối tương quan 1/v và 1/[ATCI]) và đồ thị Dixon xác định hằng số ức chế Ki. Thuốc đối chứng: donepezil hydroclorid.
• Đánh giá khả năng bảo vệ tế bào trước độc tính beta-amyloid25-35: Nuôi cấy dòng tế bào lai thần kinh NG108-15 trong môi trường DMEM bổ sung thymidin, hypoxanthin, aminopterin và huyết thanh bào thai bò; đo tỷ lệ tế bào sống sót bằng thử nghiệm chuyển hóa muối tetrazolium MTT ở bước sóng 540 nm.
• Đánh giá tác dụng chống stress oxy hóa:
  • Định lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não chuột theo phương pháp Wasowicz W., dựa trên phản ứng giữa MDA và acid thiobarbituric (TBA) trong môi trường acid tạo phức màu trimethin đo ở bước sóng 532 nm.
  • Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro tại bước sóng 517 nm.
  • Đánh giá khả năng dọn gốc tự do anion superoxid (O2•-) sinh ra từ hệ xanthin/xanthin oxidase phản ứng với nitro blue tetrazolium (NBT) đo ở bước sóng 560 nm. Chất đối chiếu: quercetin.

Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SEM), phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) kèm kiểm định sau đó hoặc kiểm định phi tham số phù hợp, có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Chương này khẳng định gánh nặng bệnh tật của bệnh Alzheimer trên quy mô toàn cầu và thực trạng thiếu hụt trầm trọng các thuốc điều trị có hiệu quả bền vững. Phân tích bối cảnh nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu tự nhiên, vị trí của Đan sâm di thực tại Sơn La và lý do khoa học của việc triển khai đề tài nhằm xác lập dữ liệu thực nghiệm về tác dụng cải thiện trí nhớ và cơ chế bệnh sinh đa đích của nguồn dược liệu này tại Việt Nam.

Chương 1: Tổng quan

Nội dung chương tổng hợp 4 khối kiến thức học thuật:

• Bệnh Alzheimer: Dịch tễ học, phân loại giai đoạn lâm sàng (tiền lâm sàng, suy giảm nhận thức nhẹ, sa sút trí tuệ) và các chỉ số cận lâm sàng (chẩn đoán hình ảnh mảng amyloid, teo hồi hải mã; định lượng nồng độ protein tau, tau phosphoryl hóa và beta-amyloid1-42 dịch não tủy). Phân tích chi tiết 5 giả thuyết bệnh sinh: cholinergic, glutamat, beta-amyloid, protein tau, stress oxy hóa cùng các phản ứng viêm liên quan.
• Thuốc điều trị: Tổng quan nhóm ức chế cholinesterase (donepezil, galantamin, rivastigmin) và nhóm đối kháng thụ thể NMDA (memantin). Thống kê 132 hợp chất trong 156 thử nghiệm lâm sàng năm 2019, trong đó 28 hợp chất đang ở pha 3 với đích tác dụng tập trung vào beta-amyloid.
• Các mô hình thực nghiệm: So sánh ưu nhược điểm của các mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng hóa chất (scopolamin, acid ibotenic, beta-amyloid25-35, acid okadaic, trimethyltin). Tổng quan nguyên lý và thông số định lượng của các test hành vi: mê lộ chữ Y, mê lộ chữ T, mê lộ nước Morris, mê lộ cánh tay xuyên tâm, mê lộ Barnes, nhận diện đồ vật, né tránh thụ động và điều kiện sợ hãi.
• Dược liệu Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge): Mô tả hình thái thực vật, vùng trồng di thực, thành phần hóa học chính gồm các diterpenoid (nhóm tanshinon) và acid phenolic (nhóm acid salvianolic). Tổng hợp các công trình nghiên cứu dược lý thực nghiệm của Đan sâm trên thế giới và tại Việt Nam liên quan đến tác dụng ức chế AChE, bảo vệ thần kinh và chống oxy hóa.

Mẫu nghiên cứu	Độ ẩm (%)	Hàm lượng Tanshinon IIA (%)	Hàm lượng Acid salvianolic B (%)	Hiệu suất chiết (%)
Dược liệu thô	9,4	0,61	8,69	-
Cao toàn phần ethanol (EĐS)	10,6	3,1	11,6	15,0 (so với dược liệu)
Cao phân đoạn n-hexan (HĐS)	2,8	5,6	3,0	2,9 (so với EĐS)

Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày nguồn gốc xuất xứ dược liệu Đan sâm di thực Mộc Châu - Sơn La, quy trình chiết ngâm phân đoạn, tiêu chuẩn hóa hàm ẩm, định tính và định lượng bằng HPLC. Mô tả chi tiết quy trình nuôi chuột nhắt Swiss albino trong điều kiện đảo ngược chu kỳ chiếu sáng (pha tối: 7h–19h; pha sáng: 19h–7h). Trình bày đầy đủ phương pháp gây tổn thương thực nghiệm (tiêm màng bụng scopolamin, tiêm não thất beta-amyloid25-35, tiêm màng bụng trimethyltin), thiết kế các lô thử nghiệm test hành vi, phương pháp định lượng hoạt độ AChE, phương pháp đo động học enzym Lineweaver-Burk và Dixon, quy trình nuôi tế bào NG108-15 thử MTT, và phương pháp định lượng MDA, dọn gốc tự do DPPH, superoxid.

Test hành vi	Dạng trí nhớ đánh giá	Mô hình thực nghiệm áp dụng	Thông số đo lường chính
Mê lộ chữ Y	Trí nhớ không gian ngắn hạn	Scopolamin, Aβ25-35, TMT	Tỷ lệ chuyển tiếp tự nhiên (%), tổng số lần vào cánh
Nhận diện đồ vật	Trí nhớ nhận diện	Scopolamin	Thời gian khám phá đồ vật cũ/mới, chỉ số phân biệt
Né tránh thụ động	Trí nhớ cảm xúc	Scopolamin, Aβ25-35	Thời gian tiềm tàng vào buồng tối (giây)
Mê lộ nước Morris	Trí nhớ không gian dài hạn	Trimethyltin (TMT)	Thời gian tìm bến đỗ (giây), thời gian ở góc đích (giây)

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được theo hai trục nội dung:

• Tác dụng trên mô hình suy giảm trí nhớ qua các test hành vi:
  • Trên mô hình scopolamin: Cao EĐS và HĐS thể hiện tác dụng làm tăng tỷ lệ chuyển tiếp tự nhiên trong test mê lộ chữ Y; kéo dài thời gian khám phá đồ vật mới và cải thiện chỉ số phân biệt trong test nhận diện đồ vật; kéo dài rõ rệt thời gian tiềm tàng bước vào buồng tối trong test né tránh thụ động so với lô mô hình chứng bệnh.
  • Trên mô hình tiêm beta-amyloid25-35 vào não thất: Cao rễ Đan sâm di thực phục hồi tỷ lệ chuyển tiếp tự nhiên trong mê lộ chữ Y và bảo lưu thời gian tiềm tàng vào buồng tối trong test né tránh thụ động.
  • Trên mô hình trimethyltin: Cao rễ Đan sâm di thực cải thiện tỷ lệ chuyển tiếp ở mê lộ chữ Y; trong test mê lộ nước Morris, làm rút ngắn thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ qua các ngày luyện tập và kéo dài thời gian bơi ở góc phần tư đích trong ngày kiểm tra không bến đỗ.
• Tác dụng trên các đích bệnh sinh của bệnh Alzheimer:
  • Đích cholinergic: Cao EĐS và HĐS làm giảm hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin và trimethyltin. Thử nghiệm in vitro xác định cao phân đoạn n-hexan (HĐS) có nồng độ ức chế 50% hoạt độ AChE (IC50) xác định; phân tích đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon chứng minh HĐS ức chế AChE theo kiểu ức chế cạnh tranh hoặc không cạnh tranh hỗn hợp với hằng số ức chế Ki cụ thể.
  • Đích beta-amyloid: Thử nghiệm độc tính và hiệu ứng bảo vệ tế bào chỉ ra cao rễ Đan sâm di thực làm gia tăng đáng kể tỷ lệ sống sót của tế bào lai thần kinh NG108-15 khi bị gây độc bằng phân đoạn beta-amyloid25-35 thông qua đo độ hấp thụ màu MTT.
  • Đích stress oxy hóa: Cao rễ Đan sâm di thực làm giảm có ý nghĩa hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não chuột trên cả hai mô hình gây tổn thương bằng beta-amyloid25-35 và trimethyltin. Trên thử nghiệm in vitro, cao phân đoạn HĐS thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do DPPH và dọn gốc anion superoxid (O2•-) phụ thuộc nồng độ, tương quan với chất đối chứng quercetin.

Bàn luận chung

Tác giả phân tích sự phù hợp của nguồn dược liệu di thực tại Mộc Châu - Sơn La, tính đại diện của các hàm lượng hoạt chất đạt chuẩn Dược điển Việt Nam V. Bàn luận cơ chế cải thiện hành vi của chuột trên các dạng trí nhớ ngắn hạn, nhận diện, cảm xúc và không gian dài hạn tương ứng với sự phục hồi hệ truyền tin cholinergic, bảo toàn tính toàn vẹn của tế bào thần kinh trước mảng độc beta-amyloid và ngăn chặn tổn thương màng tế bào do peroxid hóa lipid. Phân tích mối liên hệ tương hỗ giữa ba giả thuyết bệnh sinh và khẳng định hướng tiếp cận đa mục tiêu của cao chiết Đan sâm di thực.

Kết quả và những đóng góp mới

Công trình của tác giả Trần Thị Loan ghi nhận các đóng góp khoa học chính:

• Về mặt lý luận: Cung cấp hệ thống luận cứ khoa học thực nghiệm chứng minh rễ Đan sâm di thực trồng tại Sơn La thể hiện tác dụng sinh học theo hướng điều trị Alzheimer thông qua cơ chế đa đích. Công trình làm sáng tỏ khả năng can thiệp đồng thời vào 3 cơ chế bệnh sinh cốt lõi: cải thiện hệ dẫn truyền cholinergic thông qua ức chế enzym AChE (xác định rõ kiểu động học và hằng số ức chế Ki của phân đoạn n-hexan); bảo vệ trực tiếp tế bào thần kinh NG108-15 trước độc tính của đoạn peptid beta-amyloid25-35; và chống stress oxy hóa thông qua giảm peroxid hóa lipid mô não (hạ nồng độ MDA) và dọn các gốc tự do DPPH, superoxid.
• Về mặt thực tiễn: Xác lập quy trình chiết xuất cao toàn phần ethanol (EĐS) và cao phân đoạn n-hexan (HĐS) giàu hàm lượng tanshinon IIA; thiết lập hệ số quy đổi liều thực nghiệm (1 g EĐS tương đương 0,0292 g HĐS). Chứng minh Đan sâm di thực trồng tại Việt Nam đạt tiêu chuẩn hàm lượng hoạt chất theo Dược điển Việt Nam V và có hiệu lực cải thiện suy giảm trí nhớ trên động vật tương đương với các công bố quốc tế về Đan sâm bản địa.
• Kiến nghị và giải pháp: Luận án đề xuất tiếp tục triển khai các nghiên cứu bán trường diễn, độc tính mạn và thử nghiệm lâm sàng nhằm phát triển các sản phẩm thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ nguồn dược liệu Đan sâm di thực trồng trong nước, góp phần tự chủ nguồn nguyên liệu điều trị suy giảm trí nhớ và hỗ trợ bệnh nhân Alzheimer trong cộng đồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài được tác giả nêu trong văn bản:

• Chưa tiến hành sàng lọc và đánh giá tác dụng in vivo của tất cả các phân đoạn phân cực khác (như phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn n-butanol hoặc cắn nước) mà mới chỉ tập trung sâu vào cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan.
• Các mô hình thực nghiệm sử dụng trên chuột nhắt trắng là các mô hình gây tổn thương cấp tính hoặc bán cấp bằng hóa chất (scopolamin, beta-amyloid25-35, trimethyltin), do đó chưa phản ánh hoàn toàn diễn tiến bệnh học thoái hóa thần kinh mạn tính kéo dài qua nhiều năm ở cơ thể người.
• Nghiên cứu chưa đi sâu phân lập và thử nghiệm độc lập từng hợp chất đơn lẻ từ nguồn Đan sâm di thực Sơn La trên các thụ thể chuyên biệt của màng tế bào thần kinh.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng khảo sát tác dụng dược lý của các phân đoạn chiết xuất còn lại trên mô hình thực nghiệm.
• Nghiên cứu cơ chế tác dụng ở mức độ biểu hiện gen và protein liên quan đến các con đường truyền tin nội bào, phản ứng viêm thần kinh và yếu tố dinh dưỡng thần kinh (BDNF).
• Triển khai nghiên cứu độc tính dài hạn và chuẩn bị các bước thử nghiệm tiền lâm sàng sâu hơn hướng tới ứng dụng điều trị.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho nhiều đối tượng chuyên môn:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Dược lý - Dược lâm sàng, Hóa dược và Dược liệu: Tham khảo phương pháp chuẩn hóa chiết xuất phân đoạn, quy trình định lượng hoạt chất bằng HPLC theo Dược điển, và thiết kế nghiên cứu sàng lọc thuốc đa đích.
• Các nhà nghiên cứu thần kinh học thực nghiệm: Kế thừa quy trình chuẩn hóa kỹ thuật vi phẫu tiêm beta-amyloid25-35 vào não thất chuột bằng bơm vi lượng CMA402 trên hệ thống định vị không gian 3 chiều; phương pháp bố trí chuỗi 4 test hành vi nhận thức (mê lộ chữ Y, nhận diện đồ vật, né tránh thụ động, mê lộ nước Morris) kết hợp nuôi động vật trong điều kiện đảo ngược chu kỳ chiếu sáng.
• Giảng viên và chuyên gia phát triển thuốc: Khai thác dữ liệu về động học enzym AChE (đồ thị Lineweaver-Burk, Dixon), thử nghiệm độc tính tế bào MTT trên dòng tế bào lai thần kinh NG108-15, và các phương pháp đánh giá stress oxy hóa mô não làm tài liệu giảng dạy và nghiên cứu phát triển dược phẩm mới từ nguồn thảo dược di thực.

Câu hỏi thường gặp

1. Dược liệu Đan sâm di thực sử dụng trong luận án có nguồn gốc từ đâu và hàm lượng hoạt chất đạt tiêu chuẩn ra sao?

Dược liệu rễ Đan sâm di thực 1 năm tuổi được thu hái vào tháng 12 năm 2017 tại xã Tân Lập, huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La (tọa độ 20,9089°B; 104,6377°Đ). Dược liệu đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm theo Dược điển Việt Nam V với hàm lượng tanshinon IIA đạt 0,61% (quy định không dưới 0,2%) và hàm lượng acid salvianolic B đạt 8,69% (quy định không dưới 3,0%) tính theo dược liệu khô kiệt.

2. Cao phân đoạn n-hexan (HĐS) được điều chế như thế nào và hàm lượng hoạt chất thay đổi ra sao so với cao toàn phần ethanol (EĐS)?

Cao HĐS được điều chế bằng cách phân tán cao toàn phần ethanol (EĐS) trong nước cất tỷ lệ 1:2, sau đó lắc phân đoạn với n-hexan theo tỷ lệ 1:5 lặp lại 3 lần, thu hồi dung môi và sấy chân không (hiệu suất đạt 2,9% so với EĐS). Hàm lượng tanshinon IIA trong cao HĐS được làm giàu lên mức 5,6% (so với 3,1% ở cao EĐS), trong khi hàm lượng acid salvianolic B giảm xuống còn 3,0% (so với 11,6% ở cao EĐS). Hệ số quy đổi liều thực nghiệm là 1 g EĐS tương đương 0,0292 g HĐS.

3. Luận án đã áp dụng những mô hình thực nghiệm nào để gây suy giảm trí nhớ trên chuột nhắt trắng?

Luận án sử dụng 3 mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng tác nhân hóa học:

• Mô hình đối kháng cholinergic: Tiêm phúc mạc scopolamin hydrobromid liều 1 hoặc 3 mg/kg trước test hành vi 30 phút.
• Mô hình lắng đọng mảng amyloid: Tiêm liều đơn 9 nmol beta-amyloid25-35 đã hoạt hóa tạo oligomer vào não thất phải bằng bơm vi lượng CMA402 trên khung định vị không gian 3 chiều.
• Mô hình stress oxy hóa và thoái hóa tế bào: Tiêm phúc mạc liều đơn trimethyltin clorid từ 2,3 đến 2,5 mg/kg.

4. Hiệu quả cải thiện trí nhớ của cao rễ Đan sâm di thực được định lượng qua những thông số hành vi nào?

Tác dụng được lượng hóa qua các chỉ số:

• Trí nhớ không gian ngắn hạn (Mê lộ chữ Y): Tỷ lệ chuyển tiếp tự nhiên (%) và tổng số lượt vào cánh.
• Trí nhớ nhận diện (Test nhận diện đồ vật): Thời gian khám phá đồ vật mới/cũ và chỉ số phân biệt đồ vật.
• Trí nhớ cảm xúc (Test né tránh thụ động): Thời gian tiềm tàng bước vào buồng tối (giây) ở pha kiểm tra sau 24 giờ kể từ khi bị sốc điện.
• Trí nhớ không gian dài hạn (Mê lộ nước Morris): Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ẩn qua các ngày luyện tập và thời gian bơi ở góc phần tư đích trong pha kiểm tra không bến đỗ.

5. Những cơ chế bệnh sinh nào của bệnh Alzheimer đã được chứng minh là đích tác dụng của Đan sâm di thực trong nghiên cứu?

Cao rễ Đan sâm di thực tác động trên 3 đích bệnh sinh chính:

• Đích cholinergic: Ức chế hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột và in vitro (phân đoạn n-hexan ức chế enzym AChE có đặc điểm động học xác định qua đồ thị Lineweaver-Burk và hằng số Ki từ đồ thị Dixon).
• Đích beta-amyloid: Bảo vệ dòng tế bào lai thần kinh NG108-15 khỏi sự suy giảm khả năng sống sót do độc tính của peptid beta-amyloid25-35 trên thử nghiệm MTT.
• Đích stress oxy hóa: Làm giảm nồng độ malondialdehyd (MDA) - sản phẩm peroxid hóa lipid trong mô não chuột trên mô hình beta-amyloid25-35 và trimethyltin; dọn gốc tự do DPPH và gốc anion superoxid in vitro.

Kết luận

Luận án tiến sĩ dược học của tác giả Trần Thị Loan đã cung cấp bằng chứng thực nghiệm khoa học toàn diện về tác dụng cải thiện trí nhớ của cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge) gieo trồng tại Mộc Châu, Sơn La. Tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn, trí nhớ nhận diện, trí nhớ cảm xúc và trí nhớ không gian dài hạn của chuột thực nghiệm đã được chứng minh trên 3 mô hình gây suy giảm nhận thức bằng scopolamin, beta-amyloid25-35 và trimethyltin. Nghiên cứu xác lập cơ chế tác dụng sinh học đa đích của Đan sâm di thực thông qua ức chế enzym acetylcholinesterase, bảo vệ tế bào thần kinh trước độc tính beta-amyloid và chống stress oxy hóa màng não, tạo tiền đề khoa học định hướng cho việc phát triển các chế phẩm điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer từ nguồn thảo dược trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao [20], [182]. Theo số liệu thống kê năm 2019 của World Alzheimer Report, có 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới, trong đó 60-80% trường hợp là bệnh Alzheimer [16], [20]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm, ước tính khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 2050 [182].

Bệnh Alzheimer được xác định là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu tại Hoa Kỳ, cùng với chi phí điều trị lớn đang trở thành gánh nặng đối với xã hội [20], [21]. Cho đến nay, mới chỉ có bốn thuốc được chấp thuận trong điều trị triệu chứng rối loạn nhận thức của bệnh Alzheimer [51], [60], [138]. Trong đó, ba thuốc có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase là donepezil, galantamin và rivastigmin liên quan đến giả thuyết cholinergic về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Một thuốc còn lại có tác dụng ức chế thụ thể NMDA là memantin liên quan đến giả thuyết glutamat [51].

Tuy nhiên, đích tác dụng hiện nay không chỉ hướng tới giả thuyết cholinergic hay giả thuyết glutamat đơn lẻ mà còn hướng đến các giả thuyết khác như giả thuyết β-amyloid, giả thuyết protein tau hay giả thuyết stress oxy hóa [18], [42]. Do đó, nghiên cứu và phát triển các thuốc trong điều trị bệnh Alzheimer đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm. Trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu giữ vai trò rất quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer. Điều này có thể được minh chứng thông qua một nửa số thuốc được cấp phép trong điều trị bệnh Alzheimer hiện nay có nguồn gốc từ dược liệu [157].

Ưu điểm của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu là ít tác dụng phụ và đem lại lợi ích kinh tế đối với bệnh mạn tính như Alzheimer [163]. Vì vậy, nghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị bệnh Alzheimer đang là hướng đi phù hợp tại các nước có thế mạnh về nguồn thực vật như Việt Nam. Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae), được sử dụng hơn 1000 năm qua ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là khu vực châu Á để điều trị các bệnh thần kinh; các bệnh tim mạch; ung thư; 1 tiểu đường, suy thận và một số bệnh khác [163], [196]. Một số nghiên cứu trên thế giới bắt đầu ghi nhận các hoạt chất phân lập từ rễ Đan sâm có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer [95], [178], [239].

Các hoạt chất này thể hiện tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ in vivo trong các test hành vi thông qua khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid hay chống stress oxy hóa [137], [163]. Tại Việt Nam, Đan Sâm mới được di thực từ Trung Quốc và trồng tại một số tỉnh phía bắc như Lào Cai, Sơn La cho kết quả cây phát triển rất tốt [10]. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước mới chỉ ghi nhận cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và chống oxy hóa in vitro [8]. Hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về tác dụng dược lý của Đan sâm di thực theo hướng điều trị bệnh Alzheimer.

Câu hỏi đặt ra là: Liệu Đan sâm di thực có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer hay không và tác dụng trên những đích nào? Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)” với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Kết quả của đề tài sẽ góp phần định hướng cho thử nghiệm lâm sàng để phát triển dược liệu Đan sâm di thực thành sản phẩm được dùng rộng rãi trong cộng đồng để điều trị bệnh Alzheimer.

Tổng quan về bệnh Alzheimer 1. Khái niệm Bệnh Alzheimer được mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 bởi một bác sỹ người Đức là Alois Alzheimer. Tuy nhiên phải đến năm 1984, một khái niệm tương đối hoàn chỉnh về bệnh Alzheimer mới được đưa ra dưới sự đồng thuận của Viện quốc gia về đột quỵ và các rối loạn thần kinh, giao tiếp và Hiệp hội bệnh Alzheimer và các rối loạn liên quan. Trong đó, Alzheimer là một bệnh rối loạn về não đặc trưng bởi trạng thái mất trí nhớ tiến triển xảy ra ở giai đoạn giữa và cuối đời.

Các đặc điểm của bệnh bao gồm thoái hóa một số tế bào thần kinh, xuất hiện các mảng β- amyloid ngoại bào và đám rối nội thần kinh; rối loạn cơ chế truyền tin trong hệ cholinergic ở não trước, đôi khi ảnh hưởng đến cả hệ noradrenegic và somatostatinergic [144]. Dịch tễ Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ và số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao, ước tính tăng gấp ba lần vào năm 2050 [15]. Số lượng người mắc bệnh Alzheimer chiếm 60-80% trong 50 triệu ca mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới [16], [20]. Bệnh gặp chủ yếu ở người cao tuổi.

Tỷ lệ mắc bệnh chiếm khoảng 4% dân số trên 60 tuổi và 20-40% dân số trên 85 tuổi [83], [89]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm [182]. Tỷ lệ mắc bệnh ở nữ nhiều hơn nam [16]. Thời gian sống trung bình sau khi khởi phát sa sút trí tuệ dao động từ 3,3 đến 11,7 năm [79].

Ở Mỹ, số người trên 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer là 5,8 triệu, chiếm 10% dân số trên 65 tuổi. Ước tính đến năm 2050 số lượng bệnh nhân sẽ tăng lên 13,8 triệu. Đây là một trong 6 nguyên nhân tử vong hàng đầu tại Mỹ với 122.000 người chết vào năm 2018 [20], [21], [51]. Ở Châu Âu, tỷ lệ hiện mắc Alzheimer chiếm 5,1% dân số [243].

Ở Châu Phi, tỷ lệ hiện mắc là 57,1% dân số trên 50 tuổi. Với khu vực Châu Á, tỷ lệ hiện mắc ở Hàn Quốc là 4,8% dân số trên 65 tuổi; tại Trung Quốc là 1,9% dân số trên 60 tuổi. Đáng chú ý là tỷ lệ mắc bệnh ở các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển [181]. 3 Tại Việt Nam, chưa có báo cáo mang tính đại diện cho thực trạng bệnh Alzheimer trong cả nước.

Tuy nhiên, một số nghiên cứu dịch tễ đã tiến hành đánh giá tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở một số tỉnh và ghi nhận ở Ba Vì, thành phố Hà Nội, tỷ lệ người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm 4,5% dân số vào năm 2010 [7]; ở Đống Đa và Sóc Sơn, thành phố Hà Nội chiếm 4,2% dân số vào năm 2014 [9]. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng 1. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer biểu hiện qua các rối loạn liên quan đến nhận thức và không liên quan đến nhận thức. Một số triệu chứng liên quan đến nhận thức như suy giảm trí nhớ, suy giảm sử dụng động tác, suy giảm thị giác không gian, suy giảm ngôn ngữ và suy giảm chức năng điều hành.

Trong số đó, suy giảm trí nhớ là dấu hiệu lâm sàng điển hình nhất, thường xuất hiện sớm và mức độ tăng dần theo thời gian. Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển trải qua ba giai đoạn gồm tiền lâm sàng, suy giảm nhận thức nhẹ và sa sút trí tuệ [42], [195]. Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh có thể xuất hiện một số biểu hiện của rối loạn nhận thức như giảm trí nhớ ngắn hạn và ngôn ngữ. Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ, người bệnh thường có biểu hiện giảm cả trí nhớ ngắn hạn và dài hạn kèm theo giảm chức năng điều hành, ngôn ngữ và thị giác không gian.

Giai đoạn sa sút trí tuệ tiến triển theo ba mức độ: nhẹ, trung bình và nặng. Trong giai đoạn sa sút trí tuệ mức độ nặng, người bệnh có biểu hiện mất trí nhớ kèm theo suy giảm nặng nề hoặc mất chức năng điều hành, sử dụng động tác, ngôn ngữ và thị giác không gian nên phải phụ thuộc hoàn toàn vào người chăm sóc [14], [145], [195]. Ngoài ra, bệnh Alzheimer cũng biểu hiện qua triệu chứng không liên quan đến nhận thức bao gồm rối loạn hành vi, tâm thần và cảm xúc như thờ ơ, kích động, gây hấn, không hợp tác, đi lang thang; hoang tưởng, ảo giác, co giật, động kinh; thay đổi tính khí, lo âu, rối loạn giấc ngủ và trầm cảm [42], [195]. Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh chưa có biểu hiện rối loạn hành vi, tâm thần hay cảm xúc.

Những rối loạn này bắt đầu xuất hiện ở giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và trở nên trầm trọng ở giai đoạn sút trí tuệ mức độ nặng [14], [15], [51], [80], [145], [195]. Đặc điểm cận lâm sàng Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer được xác định thông qua các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm dịch não tủy hay sinh hóa. Trong giai đoạn tiền lâm sàng ghi nhận một số thay đổi trong xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh và dịch não tủy nhưng không ghi nhận sự thay đổi trong xét nghiệm sinh hóa. Trong giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và giai đoạn sa sút trí tuệ ghi nhận những thay đổi trong các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, dịch não tủy và sinh hóa, nhưng mức độ khác nhau [14], [80], [195].

Chi tiết được trình bày trong bảng 1. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer [14], [80], [195] Đặc điểm cận Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ Giai đoạn tiền lâm sàng lâm sàng và sa sút trí tuệ - Có hoặc không có sự tích lũy - Có tích lũy mảng amyloid Xét nghiệm mảng amyloid - Có hiện tượng teo vùng thái dương chẩn đoán - Có hiện tượng mất chất xám, trung gian, giảm thể tích vùng hải hình ảnh mất một phần vỏ não hoặc teo mã, giảm tưới máu trong vỏ não. - Nồng độ protein tau hoặc tau - Nồng độ protein tau hoặc tau Xét nghiệm phosphoryl hóa tăng cao phosphoryl hóa tăng cao dịch não tủy - Nồng độ β-amyloid1-42 thấp - Nồng độ β-amyloid1-42 tăng cao - Nồng độ các chất đánh dấu sinh học liên quan đến phản ứng viêm, Xét nghiệm stress oxy hóa và các chất đánh dấu sinh hóa liên quan đến thoái hóa tế bào thần kinh như chết tế bào đều tăng cao.