Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị alzheimer trên thực nghiệm của đan sâm di thực salvia miltiorrhiza bunge lamiaceae

Luận án tiến sĩ y tế nghiên cứu dược học nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị alzheimer trên thực nghiệm của đan sâm di thực, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Trần Thị Loan
• Người hướng dẫn: PGS. Đào Thị Vui
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược lý - Dược lâm sàng
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Của Đan Sâm Di Thực Trong Điều Trị Alzheimer
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
• 1.3. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• 1.4. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.5. Tổng quan về bệnh Alzheimer
• 1.5.1. Khái niệm
• 1.5.2. Dịch tễ
• 1.5.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng
• 1.5.4. Cơ chế bệnh sinh và các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh
• 1.5.5. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer và hợp chất đang nghiên cứu
• 1.5.5.1. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer
• 1.5.5.2. Tổng quan về các hợp chất đang nghiên cứu trong điều trị bệnh Alzheimer
• 1.5.6. Tổng quan một số mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm và phương pháp đánh giá trong nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer
• 1.5.6.1. Các mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm
• 1.5.6.2. Phương pháp đánh giá tác dụng thông qua các test hành vi
• 1.5.6.3. Phương pháp đánh giá tác dụng trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.5.7. Tổng quan về Đan sâm
• 1.5.7.1. Tên khoa học
• 1.5.7.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
• 1.5.7.3. Bộ phận dùng
• 1.5.7.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ Đan sâm
• 1.5.7.5. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm
• 1.6. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.6.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 1.6.2. Dược liệu nghiên cứu
• 1.6.3. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu
• 1.6.4. Động vật nghiên cứu
• 1.6.5. Tế bào nghiên cứu
• 1.6.6. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
• 1.6.7. Hóa chất nghiên cứu
• 1.6.8. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
• 1.6.9. Địa điểm nghiên cứu
• 1.6.10. Nội dung nghiên cứu
• 1.6.11. Phương pháp nghiên cứu
• 1.6.11.1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi
• 1.6.11.2. Phương pháp đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.6.12. Xử lý số liệu
• 1.7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.7.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi
• 1.7.1.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin
• 1.7.1.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35
• 1.7.1.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin
• 1.7.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.7.2.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết cholinergic
• 1.7.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid
• 1.7.2.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa
• 1.7.3. Đối tượng nghiên cứu và liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu
• 1.7.3.1. Dược liệu nghiên cứu
• 1.7.3.2. Chiết xuất mẫu nghiên cứu
• 1.7.3.3. Liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu
• 1.7.4. Tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi
• 1.7.4.1. Các test hành vi sử dụng trong nghiên cứu
• 1.7.4.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin
• 1.7.4.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35
• 1.7.4.4. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin
• 1.7.5. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
• 1.7.5.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên đích liên quan đến giả thuyết cholinergic
• 1.7.5.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid
• 1.7.5.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa
• 1.8. Bàn luận chung
• 1.9. Đóng góp và hạn chế của đề tài
• 1.9.1. Đóng góp của đề tài
• 1.9.2. Hạn chế của đề tài
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Theo thống kê, số lượng bệnh nhân mắc bệnh này đang gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao. Theo báo cáo của World Alzheimer Report năm 2019, có khoảng 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ, trong đó 60-80% là bệnh Alzheimer. Tỷ lệ mắc mới tăng từ 5-7 triệu người mỗi năm, dự đoán sẽ có khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 2050. Bệnh Alzheimer không chỉ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu tại Hoa Kỳ mà còn tạo ra gánh nặng lớn về chi phí điều trị cho xã hội. Hiện tại, chỉ có bốn loại thuốc được chấp thuận để điều trị triệu chứng rối loạn nhận thức của bệnh này, chủ yếu tập trung vào việc ức chế enzym acetylcholinesterase. Tuy nhiên, nghiên cứu hiện nay đang mở rộng ra nhiều giả thuyết khác nhau về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, bao gồm giả thuyết β-amyloid và stress oxy hóa.

1.1. Dịch tễ học

Bệnh Alzheimer có tỷ lệ mắc cao ở người cao tuổi, với khoảng 4% dân số trên 60 tuổi và 20-40% dân số trên 85 tuổi mắc bệnh. Tại Mỹ, ước tính có 5,8 triệu người trên 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer, và con số này dự kiến sẽ tăng lên 13,8 triệu vào năm 2050. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm khoảng 4,5% dân số. Điều này cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh Alzheimer.

II. Đan sâm di thực và tác dụng của nó

Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge) đã được sử dụng trong y học cổ truyền hơn 1000 năm qua. Nghiên cứu cho thấy các hoạt chất trong rễ Đan sâm có khả năng cải thiện suy giảm trí nhớ thông qua việc ức chế enzym acetylcholinesterase và bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng Đan sâm di thực có thể có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh Alzheimer, đặc biệt là trong việc giảm thiểu các triệu chứng liên quan đến suy giảm trí nhớ. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đan sâm di thực trong điều trị Alzheimer vẫn còn hạn chế.

2.1. Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Đan sâm di thực có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase, một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Hơn nữa, Đan sâm còn có khả năng chống stress oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương. Những tác dụng này cho thấy Đan sâm di thực có tiềm năng lớn trong việc phát triển thành một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh Alzheimer, đặc biệt trong bối cảnh các phương pháp điều trị hiện tại còn nhiều hạn chế.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng của Đan sâm di thực trong điều trị Alzheimer được thực hiện thông qua các mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm. Các test hành vi được sử dụng để đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên các mô hình này. Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer, từ đó xác định được hiệu quả và cơ chế tác dụng của Đan sâm di thực.

3.1. Mô hình nghiên cứu

Các mô hình gây suy giảm trí nhớ được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm mô hình scopolamin, β-amyloid25-35 và trimethyltin. Những mô hình này cho phép đánh giá tác dụng của Đan sâm di thực trên các triệu chứng của bệnh Alzheimer một cách chính xác. Kết quả từ các test hành vi sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng cải thiện trí nhớ và chức năng nhận thức của Đan sâm di thực.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao rễ Đan sâm di thực có tác dụng tích cực trong việc cải thiện các triệu chứng suy giảm trí nhớ trên các mô hình thực nghiệm. Cụ thể, cao rễ Đan sâm đã cho thấy khả năng ức chế hoạt động của enzym acetylcholinesterase, từ đó làm tăng nồng độ acetylcholine trong não. Hơn nữa, Đan sâm di thực cũng cho thấy khả năng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid, một yếu tố chính trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Những kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh Alzheimer.

4.1. Tác dụng trên mô hình thực nghiệm

Cao rễ Đan sâm di thực đã được chứng minh là có tác dụng tích cực trên các mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin và β-amyloid25-35. Kết quả cho thấy thời gian khám phá đồ vật và khả năng nhận diện đồ vật của chuột thí nghiệm được cải thiện rõ rệt khi sử dụng cao rễ Đan sâm. Điều này chứng tỏ rằng Đan sâm di thực có thể là một phương pháp điều trị tiềm năng cho bệnh Alzheimer, giúp cải thiện chức năng nhận thức và trí nhớ.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh Alzheimer (Alzheimer's Disease - AD) là rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến nhất, chiếm từ 60% đến 80% trong tổng số hơn 50 triệu ca sa sút trí tuệ trên toàn cầu theo báo cáo của World Alzheimer Report (2019). Với tốc độ gia tăng tuổi thọ, tỷ lệ mắc mới ước tính tăng 5-7 triệu ca mỗi năm, dự báo đạt 115 triệu người vào năm 2050. Tại Hoa Kỳ, AD là nguyên nhân tử vong đứng thứ sáu với chi phí chăm sóc tạo gánh nặng kinh tế khổng lồ. Tuy nhiên, tính đến thời điểm nghiên cứu, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) mới chỉ phê duyệt bốn hoạt chất điều trị triệu chứng suy giảm nhận thức gồm ba chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) là donepezil, galantamin, rivastigmin và một chất đối kháng thụ thể NMDA là memantin. Khoảng 99,6% các thử nghiệm lâm sàng phát triển thuốc đơn mục tiêu (đặc biệt là kháng thể đơn dòng kháng β-amyloid hay ức chế γ-secretase) trong giai đoạn 2015–2019 đều thất bại do cơ chế bệnh sinh đa yếu tố phức tạp của AD.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) trọng tâm nằm ở sự thiếu hụt các nghiên cứu đánh giá toàn diện tác dụng in vivo và cơ chế đa mục tiêu của dược liệu Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà Lamiaceae) trồng tại Việt Nam. Trong khi các nghiên cứu quốc tế đã bước đầu ghi nhận tiềm năng của các diterpenoid (nhóm tanshinon) và acid phenolic trong Đan sâm bản địa Trung Quốc, nguồn dược liệu di thực tại các vùng sinh thái đặc thù phía Bắc Việt Nam (như Mộc Châu, Sơn La) mới chỉ dừng lại ở các khảo sát sơ bộ in vitro về ức chế AChE và dọn gốc tự do DPPH, hoàn toàn khuyết thiếu các chứng cứ tiền lâm sàng in vivo trên các mô hình suy giảm trí nhớ đa cơ chế.

Luận án xác lập hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Cao chiết rễ Đan sâm di thực có khả năng phục hồi các khía cạnh trí nhớ không gian, nhận diện và cảm xúc trên các mô hình động vật thực nghiệm bị gây suy giảm trí nhớ hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Cao toàn phần ethanol và cao phân đoạn n-hexan từ Đan sâm di thực tác động can thiệp như thế nào lên các đích sinh học thuộc ba giả thuyết bệnh sinh cốt lõi: cholinergic, β-amyloid và stress oxy hóa?
• Giả thuyết khoa học 1 (H1): Cao rễ Đan sâm di thực cải thiện có ý nghĩa thống kê các chỉ số hành vi nhận thức trên chuột nhắt trắng thông qua việc đảo ngược tổn thương do scopolamin, β-amyloid25-35 và trimethyltin (TMT) gây ra.
• Giả thuyết khoa học 2 (H2): Phân đoạn n-hexan giàu hoạt chất diterpenoid lipophilic thể hiện hoạt tính ức chế AChE theo cơ chế động học xác định, đồng thời bảo vệ tế bào thần kinh NG108-15 trước độc tính của β-amyloid25-35 và ức chế peroxid hóa lipid mô não.

Khung lý thuyết của đề tài vận dụng mô hình phối hợp đa đích (Multi-Target Directed Ligands - MTDLs), tích hợp giả thuyết cholinergic (Davies, 1976), giả thuyết dòng thác β-amyloid (Hardy & Higgins, 1991) và giả thuyết stress oxy hóa (Volicer, 1990). Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được triển khai trên 10,0 kg bột rễ Đan sâm di thực thu hái tại Mộc Châu - Sơn La, dòng tế bào lai thần kinh NG108-15 và hàng trăm chuột nhắt trắng chủng Swiss albino (7-8 tuần tuổi, 20-25 g), tạo dựng luận cứ khoa học thực nghiệm vững chắc nhằm định hướng phát triển nguồn dược liệu di thực thành dược phẩm điều trị AD tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế ghi nhận sự tiến triển của các dòng lý thuyết bệnh sinh Alzheimer. Dòng nghiên cứu khởi nguồn từ giả thuyết cholinergic của Davies P. (1976) nhấn mạnh sự suy thoái của các nơ-ron cholinergic tại nhân nền Meynert và vỏ não trước, dẫn đến sụt giảm nghiêm trọng acetylcholin (ACh) do enzym AChE thủy phân thành cholin và acetat. Tiếp đó, Hardy J. & Higgins G. (1991) thiết lập giả thuyết dòng thác β-amyloid, giải thích quá trình cắt bệnh lý protein tiền chất amyloid (APP) bởi enzym β-secretase (BACE1) và γ-secretase tạo ra các peptid độc tính cao $\beta\text{-amyloid}{1-42}$ và $\beta\text{-amyloid}{25-35}$, kích hoạt viêm thần kinh và chết tế bào. Đồng thời, giả thuyết stress oxy hóa của Volicer L. (1990) chứng minh sự mất cân bằng giữa các gốc tự do ($O_2^{\bullet-}$, $\text{OH}^{\bullet}$, $\text{ONOO}^-$) và hệ enzym nội sinh (SOD, GPx, CAT), thúc đẩy peroxid hóa lipid màng tạo malondialdehyd (MDA).

Y văn thế giới tồn tại cuộc tranh luận học thuật sâu sắc giữa quan điểm điều trị "đơn đích ái lực cao" (one-target, one-drug) và "đa đích đồng vận" (multi-target approach). Các nghiên cứu quốc tế như của Cummings et al. (2019) chỉ rõ sự thất bại liên tiếp của các kháng thể đơn dòng nhắm vào mảng β-amyloid đơn lẻ, khẳng định căn nguyên phức tạp của AD không thể đảo ngược bằng một đích tác động duy nhất. Về dược liệu Salvia miltiorrhiza, nhóm nghiên cứu của Wong et al. (2010) và Kim et al. (2009) tại Trung Quốc và Hàn Quốc đã phân lập các tanshinon (tanshinon I, IIA, cryptotanshinon, dihydrotanshinon I) và acid salvianolic (salvianolic acid B), chứng minh khả năng ức chế AChE in vitro ($IC_{50}$ dao động từ 1,0 đến 50 µg/mL) và cải thiện hành vi trên chuột tiêm scopolamin hoặc $\text{A}\beta_{25-35}$. Tuy nhiên, các công trình quốc tế chủ yếu tập trung vào các hoạt chất tinh khiết đơn lẻ hoặc cao chiết chuẩn hóa từ Đan sâm bản địa, trong khi việc đánh giá toàn diện phổ tác dụng của phân đoạn chiết xuất từ Đan sâm di thực tại các tiểu vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa vẫn là một khoảng trống lớn.

So sánh với các nghiên cứu tiền lâm sàng quốc tế tiêu biểu:

• Nghiên cứu của Ren et al. (2004) tại Anh ghi nhận cao toàn phần ethanol 50% rễ Đan sâm ở liều 200 mg/kg trên chuột cống không thể hiện tác dụng cải thiện trí nhớ rõ rệt trong test né tránh thụ động và nhận diện đồ vật, dù có ức chế AChE mô não.
• Nghiên cứu của Zhong et al. (2016) trên mô hình $\text{A}\beta_{25-35}$ chứng minh acid salvianolic B đơn chất cải thiện trí nhớ nhưng đòi hỏi quy trình tinh chế tốn kém.

Luận án định vị nghiên cứu vào việc khai thác cao toàn phần ethanol 95% (EĐS) và cao phân đoạn n-hexan (HĐS) giàu diterpenoid của Đan sâm di thực Sơn La. Bước tiến khoa học của luận án là chứng minh phân đoạn n-hexan không chỉ đạt hàm lượng tanshinon IIA cao (5,6%) mà còn thể hiện tác dụng đồng thời trên cả ba trục: phục hồi trí nhớ hành vi in vivo trên 3 mô hình bệnh sinh, ức chế thuận nghịch enzym AChE có phân tích động học enzym học chuyên sâu (Lineweaver-Burk và Dixon), và ức chế trực tiếp quá trình peroxid hóa lipid mô não.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp quan trọng vào việc củng cố và mở rộng mô hình đa đích MTDLs trong dược lý học thần kinh hiện đại:

1. Mở rộng giả thuyết Cholinergic (Davies, 1976): Cung cấp bằng chứng thực nghiệm rằng cao phân đoạn n-hexan Đan sâm di thực ức chế enzym AChE theo cơ chế ức chế hỗn hợp không cạnh tranh (mixed non-competitive inhibition), chứng minh khả năng tương tác đồng thời với cả trung tâm hoạt động (catalytic active site - CAS) và vị trí ngoại diện (peripheral anionic site - PAS) của enzym AChE, mở ra hướng bảo vệ acetylcholin bền vững hơn so với các chất ức chế cạnh tranh đơn thuần.
2. Bổ trợ giả thuyết Dòng thác $\beta$-amyloid (Hardy & Higgins, 1991): Minh chứng rằng các hoạt chất thân dầu trong Đan sâm di thực ngăn chặn độc tính thần kinh trực tiếp của phân đoạn $\text{A}\beta_{25-35}$ hoạt hóa dạng oligomer trên tế bào lai thần kinh NG108-15, giải cứu tế bào khỏi quá trình chết theo chương trình (apoptosis) do suy giảm chức năng ty thể.
3. Hiện thực hóa giả thuyết Stress Oxy hóa (Volicer, 1990): Xác lập mối liên hệ định lượng giữa việc dọn dẹp các gốc tự do anion superoxid ($O_2^{\bullet-}$), gốc tự do DPPH và sự sụt giảm nồng độ MDA nội sinh trong mô não chuột bị gây độc bởi TMT và $\text{A}\beta_{25-35}$.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột phương pháp luận: Dược liệu học - Dược lý hành vi - Hóa sinh enzym học:

• Tích hợp đa tầng sinh học: Đánh giá từ mức độ phân tử (tương tác enzym AChE in vitro, động học cơ chất ATCI), mức độ tế bào (độc tính ty thể qua phản ứng khử MTT trên dòng tế bào NG108-15), đến mức độ cơ quan (định lượng MDA và hoạt độ AChE trong dịch nghiền mô não chuột) và mức độ toàn thể sinh vật (các phản xạ hành vi thần kinh cấp cao).
• Hệ chỉ tiêu đánh giá hành vi toàn diện: Tích hợp 4 bài test hành vi chuẩn hóa quốc tế gồm Mê lộ chữ Y (Y-maze), Mê lộ nước Morris (Morris Water Maze - MWM), Test nhận diện đồ vật mới (Novel Object Recognition - NOR) và Test né tránh thụ động (Step-through Passive Avoidance), bao phủ trọn vẹn các miền trí nhớ: trí nhớ không gian ngắn hạn, trí nhớ không gian dài hạn, trí nhớ nhận diện và trí nhớ cảm xúc liên kết.
• Điều kiện biên (Boundary conditions): Tác dụng dược lý của cao chiết phụ thuộc chặt chẽ vào độ phân cực của dung môi chiết xuất (phân đoạn n-hexan ưu thế vượt trội so với phân đoạn nước trong ức chế AChE) và khoảng liều tối ưu in vivo (tác dụng thể hiện rõ rệt ở khoảng liều tương đương dược liệu khô 2,5 - 5,0 g/kg/ngày).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng triết lý thực chứng (positivism/empirical paradigm) với thiết kế thực nghiệm can thiệp có đối chứng ngẫu nhiên (randomized controlled laboratory design):

• Đối tượng dược liệu: Rễ Đan sâm di thực 1 năm tuổi thu hái tại xã Tân Lập, huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La (tọa độ: 20,9089°B; 104,6377°Đ) vào tháng 12/2017. Tiêu bản mẫu lưu giữ tại Bảo tàng thực vật Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội (HNU 022613) và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (DSL2668).
• Quy trình chiết xuất và chuẩn hóa: 10,0 kg bột thô rễ Đan sâm (hàm ẩm 9,4%) chiết ngâm lạnh kiệt với ethanol 95% (tốc độ rút dịch 1,5 L/giờ), thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 55°C, thu được 1520,20 g cao toàn phần ethanol (EĐS, hiệu suất 15,0%, tanshinon IIA đạt 3,1%, acid salvianolic B đạt 11,6%). Tiến hành chiết phân đoạn 734,16 g EĐS phân tán trong nước (tỷ lệ 1:2) với n-hexan (tỷ lệ 1:5, lặp lại 3 lần), thu được 19,74 g cao phân đoạn n-hexan (HĐS, hiệu suất 2,9%, hàm ẩm 2,8%, tanshinon IIA đạt 5,6%, acid salvianolic B đạt 3,0%). Hệ số quy đổi liều: 1 g EĐS tương đương 0,0292 g HĐS.
• Mô hình động vật: Chuột nhắt trắng giống đực chủng Swiss albino (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương), 7-8 tuần tuổi, trọng lượng 20-25 g, nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn (nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 60-70%, chu kỳ sáng/tối đảo ngược 12h/12h).
• Dòng tế bào: Tế bào lai thần kinh NG108-15 (Neuroblastoma N18TG2 x Glioma C6BU-1) do Giáo sư Michihisa Tohda (Đại học Toyama, Nhật Bản) tài trợ, nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung huyết thanh bào thai bò.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Thiết kế thực nghiệm in vivo triển khai trên ba mô hình suy giảm trí nhớ bệnh sinh chuyên biệt:

1. Mô hình Scopolamin: Chuột được tiêm phúc mạc (i.p.) scopolamin hydrobromid liều 1 mg/kg hoặc 3 mg/kg trước khi thực hiện test hành vi 30 phút nhằm phong bế thụ thể muscarinic cấp tính.
2. Mô hình $\beta\text{-amyloid}_{25-35}$: Chuột được cố định trên khung định vị không gian ba chiều (Stoelting, Mỹ), gây mê bằng cloral hydrat, tiêm vi thẩm tách vào não thất phải (intracerebroventricular - i.c.v.) với tọa độ lập thể xác định bằng bơm micro CMA402 (Harvard Apparatus). Phân đoạn $\text{A}\beta_{25-35}$ được ủ hoạt hóa ở 37°C trong 4 ngày để tạo dạng oligomer trước khi tiêm với liều 9 nmol (thể tích 3 µL, tốc độ 1 µL/phút).
3. Mô hình Trimethyltin (TMT): Tiêm phúc mạc liều đơn TMT clorid 2,4 mg/kg để gây thoái hóa nơ-ron vùng hải mã và kích hoạt bùng phát stress oxy hóa sau 3 ngày.

Quy trình đánh giá hành vi và thu thập mô não:

• Mê lộ chữ Y: Đo lường hành vi chuyển tiếp tự nhiên (spontaneous alternation) trong 8 phút; tính tỷ lệ % chuyển tiếp đúng ba cánh liên tiếp.
• Test nhận diện đồ vật mới (NOR): Pha luyện tập cho khám phá 2 vật giống nhau ($A_1, A_2$); pha kiểm tra sau 24h thay thế bằng vật thể mới ($A, B$). Ghi nhận thời gian khám phá và tính Chỉ số phân biệt $DI = (T_B - T_A) / (T_B + T_A)$.
• Test né tránh thụ động: Huấn luyện chuột nhận biết buồng tối bị kích điện (0,2 - 0,4 mA trong 3 giây); kiểm tra thời gian tiềm tàng (step-through latency) bước vào buồng tối sau 24h (cut-off time 300 giây).
• Mê lộ nước Morris (MWM): Bể bơi đường kính 120 cm chia 4 góc phần tư, bến đỗ ngầm 1 cm dưới mặt nước đục; ghi nhận thời gian tiềm tàng tìm bến đỗ trong 4 ngày luyện tập và thời gian lưu lại góc phần tư đích trong ngày kiểm tra (bỏ bến đỗ).

Data và phân tích

• Định lượng hoạt độ enzym AChE: Phương pháp đo quang Ellman (1961) sử dụng cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử DTNB, đo mật độ quang tại bước sóng 412 nm trên máy đọc ELISA đa bước sóng Bio-Tek Instruments. Xây dựng đồ thị Lineweaver-Burk ($1/v$ theo $1/[\text{ATCI}]$) và đồ thị Dixon ($1/v$ theo nồng độ chất ức chế $[I]$) để xác định loại ức chế enzym và hằng số ức chế $K_i$.
• Đánh giá tỷ lệ sống sót tế bào NG108-15: Thử nghiệm khử muối MTT bởi enzym dehydrogenase ty thể thành tinh thể formazan màu tím, hòa tan trong DMSO và đo quang phổ tại bước sóng 540 nm.
• Định lượng peroxid hóa lipid mô não: Phương pháp Wasowicz (1993) dựa trên phản ứng giữa MDA trong dịch đồng thể não và acid thiobarbituric (TBA) ở 95°C tạo phức chất trimethin hồng, đo quang tại 532 nm bằng máy quang phổ. Chuẩn hóa nồng độ MDA theo đương lượng tetramethoxypropan (TMP).
• Đánh giá hoạt tính dọn gốc tự do in vitro: Thử nghiệm dọn gốc DPPH đo tại bước sóng 517 nm ($IC_{50}/\text{SC}_{50}$); thử nghiệm dọn gốc anion superoxid ($O_2^{\bullet-}$) sinh ra từ hệ enzym xanthin/xanthin oxidase phản ứng với NBT đo tại 560 nm, đối chứng dương bằng Quercetin.
• Xử lý thống kê: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng Trung bình ± Sai số chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SEM}$). Phân tích phương sai một chiều (One-way ANOVA) hoặc hai chiều (Two-way ANOVA) kèm kiểm định hậu định Tukey hoặc Dunnett bằng phần mềm SPSS và GraphPad Prism; giá trị $p < 0,05$ được coi là có ý nghĩa thống kê.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phục hồi toàn diện các miền trí nhớ trên mô hình suy giảm nhận thức cấp và bán cấp:

   • Trên mô hình scopolamin (3 mg/kg, i.p.), cao rễ Đan sâm di thực ở các mức liều tương đương cải thiện có ý nghĩa thống kê tỷ lệ chuyển tiếp trong mê lộ chữ Y ($p < 0,01$), nâng cao rõ rệt chỉ số phân biệt đồ vật mới $DI$ trong test NOR ($p < 0,001$) và kéo dài thời gian tiềm tàng vào buồng tối trong test né tránh thụ động từ $42,3 \pm 8,5$ giây ở lô bệnh lý lên hơn $210,5 \pm 18,2$ giây ở lô điều trị ($p < 0,001$).
   • Trên mô hình tiêm $\text{A}\beta_{25-35}$ não thất (9 nmol), cao phân đoạn n-hexan rễ Đan sâm (HĐS) ngăn chặn sự suy thoái trí nhớ ngắn hạn và kéo dài độ trễ thâm nhập buồng tối tương đương với thuốc đối chứng Donepezil.
   • Trên mô hình thoái hóa do Trimethyltin (TMT 2,4 mg/kg), trong bài test Mê lộ nước Morris, Đan sâm rút ngắn thời gian tiềm tàng tìm bến đỗ trong các ngày luyện tập 3 và 4 ($p < 0,01$) và gia tăng đáng kể thời gian bơi ở góc phần tư đích ($p < 0,001$).

2. Cơ chế ức chế enzym AChE và đặc tính động học enzym độc đáo:

   • Cao phân đoạn n-hexan (HĐS) ức chế mạnh hoạt độ AChE in vitro với giá trị $IC_{50}$ đạt mức ấn tượng, vượt trội so với cao chiết nước.
   • Phân tích đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon chứng minh HĐS ức chế enzym AChE theo cơ chế hỗn hợp không cạnh tranh (mixed non-competitive inhibition), làm giảm vận tốc phản ứng cực đại $V_{max}$ đồng thời làm biến đổi hằng số Michaelis-Menten $K_m$, với hằng số ức chế $K_i$ được lượng hóa chính xác. Trên mô hình động vật, HĐS làm giảm hoạt độ AChE trong mô não chuột bị gây độc bởi scopolamin và TMT ($p < 0,01$).

3. Bảo vệ tế bào thần kinh trước độc tính phân đoạn $\text{A}\beta_{25-35}$:

   • Trên dòng tế bào lai NG108-15 bị gây độc bởi $\text{A}\beta_{25-35}$ hoạt hóa ($25\text{ }\mu\text{M}$), tiền xử lý bằng cao Đan sâm làm gia tăng tỷ lệ tế bào sống sót từ $51,2 \pm 3,4%$ ở lô mô hình lên $78,6 \pm 4,1%$ ($p < 0,001$) theo phép thử MTT, chứng minh tác dụng bảo tồn ty thể và ngăn chặn chết tế bào thần kinh.

4. Ức chế peroxid hóa lipid mô não và trung hòa gốc tự do:

   • Định lượng MDA trong dịch nghiền mô não chuột ghi nhận Đan sâm di thực làm giảm hàm lượng MDA từ mức tăng vọt $8,92 \pm 0,64\text{ nmol/mg protein}$ (ở lô tiêm $\text{A}\beta_{25-35}$) và $9,45 \pm 0,72\text{ nmol/mg protein}$ (ở lô tiêm TMT) xuống tiệm cận mức sinh lý bình thường ($p < 0,001$).
   • Thử nghiệm in vitro chứng minh HĐS có khả năng dọn gốc tự do DPPH và gốc anion superoxid ($O_2^{\bullet-}$) với đường cong đáp ứng nồng độ tuyến tính, giá trị $\text{SC}_{50}$ tiệm cận với chất chống oxy hóa chuẩn Quercetin.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Kết quả nghiên cứu xác nhận hiệu lực của học thuyết MTDLs trên thực thể dược liệu tự nhiên, chứng minh Đan sâm di thực có khả năng can thiệp đa tầng vào các nút giao bệnh sinh (pathological crosstalk) giữa suy giảm dẫn truyền cholinergic, nhiễm độc amyloid và stress peroxid màng nơ-ron.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình tiêm vi thẩm tách $\text{A}\beta_{25-35}$ vào não thất phải chuột nhắt trên khung lập thể ba chiều kết hợp hệ thống 4 bài test hành vi đa miền nhận thức, tạo tiền đề phương pháp luận chuẩn xác cho các nghiên cứu sàng lọc thuốc hướng thần kinh tại Việt Nam.
• Về mặt thực tiễn y dược: Mở ra tiềm năng ứng dụng cao phân đoạn n-hexan giàu diterpenoid tanshinon của Đan sâm di thực làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị sa sút trí tuệ Alzheimer, giảm thiểu sự phụ thuộc vào nguồn dược liệu nhập khẩu.

Limitations và Future Research

1. Hạn chế về mô hình bệnh học: Mô hình tiêm hóa chất ($\text{A}\beta_{25-35}$, Scopolamin, TMT) phản ánh các tổn thương thoái hóa cấp tính hoặc bán cấp, chưa mô phỏng trọn vẹn tiến trình bệnh sinh mạn tính kéo dài hàng thập kỷ của AD tự nhiên kèm theo các mảng amyloid già hóa và đám rối sợi thần kinh tau (NFTs) toàn diện như trên mô hình chuột chuyển gen (APP/PS1 hoặc 3xTg-AD).
2. Hạn chế về phân lập hoạt chất: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc chuẩn hóa và đánh giá trên cao phân đoạn n-hexan (chứa 5,6% tanshinon IIA), chưa tách chiết và khảo sát động học phân tử đơn lẻ của từng đồng phân tanshinon (tanshinon I, dihydrotanshinon I, cryptotanshinon) trên cùng hệ thống thử nghiệm.
3. Chưa đánh giá dược động học xuyên hàng rào máu não: Chưa định lượng trực tiếp nồng độ các hoạt chất diterpenoid trong dịch não tủy và nhu mô não sau khi dùng thuốc đường uống.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối (Future Research Agenda):

• Ứng dụng mô hình động vật biến đổi gen mang đột biến APP/PS1/tau để đánh giá khả năng ức chế tích tụ mảng thoái hóa thần kinh và đám rối sợi thần kinh nội bào dài hạn.
• Nghiên cứu cơ chế phân tử chuyên sâu: Định lượng biểu hiện gen và protein của enzym BACE1, thụ thể NMDA, yếu tố BDNF, enzym chống oxy hóa SOD/GPx qua kỹ thuật Western Blot và Real-time RT-PCR.
• Phát triển hệ dẫn thuốc công nghệ nano (liposome, hạt nano polyme phân hủy sinh học) nhằm tối ưu hóa sinh khả dụng và khả năng hướng đích qua hàng rào máu não của phân đoạn n-hexan Đan sâm di thực.
• Triển khai các nghiên cứu độc tính bán trường diễn và thử nghiệm lâm sàng pha 1/pha 2 trên bệnh nhân suy giảm nhận thức nhẹ (MCI).

Tác động và ảnh hưởng

Công trình nghiên cứu tạo nền tảng học thuật và thực tiễn vững chắc:

• Tác động học thuật: Là luận án tiến sĩ tiên phong tại Việt Nam khảo sát có hệ thống tác dụng chống Alzheimer của Đan sâm di thực trên cả 3 mô hình in vivo và hệ thống in vitro enzym/tế bào; cung cấp bộ dữ liệu tham chiếu quan trọng cho các công bố quốc tế thuộc danh mục ISI/Scopus chuyên ngành Dược lý học Thần kinh.
• Phát triển ngành Dược: Nâng cao giá trị kinh tế và chuẩn hóa chuỗi giá trị nông nghiệp công nghệ cao cho vùng trồng dược liệu di thực tại Mộc Châu - Sơn La và các tỉnh miền núi phía Bắc; định hướng quy trình chiết xuất công nghiệp thu hồi phân đoạn giàu hoạt chất diterpenoid lipophilic.
• Lợi ích y tế cộng đồng: Cung cấp giải pháp tiềm năng từ thảo dược bản địa hóa giúp kiểm soát hội chứng sa sút trí tuệ cho hơn 500.000 người cao tuổi tại Việt Nam, mang lại hiệu quả điều trị an toàn, chi phí hợp lý và giảm thiểu tác dụng phụ so với các thuốc tổng hợp hóa dược.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên chuyên ngành Dược lý - Hóa sinh: Tiếp cận quy trình sàng lọc thuốc thần kinh chuẩn mực, kết hợp giữa kỹ thuật định vị không gian ba chiều não bộ, thử nghiệm tế bào lai NG108-15 và phân tích động học enzym học chuyên sâu.
• Các nhà phát triển R&D Dược phẩm: Sở hữu công thức quy trình chiết xuất và thông số định lượng kiểm nghiệm (hàm lượng tanshinon IIA $\ge 5,6%$ trong phân đoạn n-hexan) để phát triển dạng bào chế hiện đại điều trị Alzheimer.
• Nhà hoạch định chính sách y tế và Nông nghiệp: Có cơ sở khoa học phê duyệt và hỗ trợ mở rộng quy hoạch vùng trồng chuyên canh cây thuốc Đan sâm di thực tại các vùng kinh tế khó khăn phía Bắc.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Luận án đã chứng minh cao phân đoạn n-hexan Đan sâm di thực ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) theo cơ chế ức chế hỗn hợp không cạnh tranh (mixed non-competitive inhibition) qua việc xác lập đồng thời đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon, mở rộng giả thuyết cholinergic của Davies (1976) khi chỉ ra cơ chế tương tác đa vị trí trên enzym mục tiêu.
2. Điểm đổi mới phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây? So với công trình của Ren et al. (2004) chỉ thử nghiệm đơn lẻ cao ethanol 50% trên chuột cống hay nghiên cứu của Đào Thị Vui et al. (2018) chỉ khảo sát in vitro, luận án đã thiết lập quy trình triangulation đa phương pháp: tích hợp đồng thời 3 mô hình suy giảm trí nhớ bệnh sinh in vivo (Scopolamin, $\text{A}\beta_{25-35}$ tiêm định vị não thất, Trimethyltin), kết hợp 4 test hành vi nhận thức đa miền và thử nghiệm bảo vệ tế bào NG108-15.
3. Phát hiện thực nghiệm bất ngờ nhất thu được là gì? Phân đoạn n-hexan (HĐS) – vốn trước đây trong một số thử nghiệm sơ bộ bị xem là ít hoạt tính do độ phân cực thấp – lại thể hiện hoạt tính ức chế AChE in vitro và in vivo mạnh mẽ nhất, đồng thời chứa hàm lượng tanshinon IIA cao gấp 1,8 lần cao toàn phần EĐS (5,6% so với 3,1%), chứng minh vai trò then chốt của nhóm diterpenoid thân dầu trong điều trị AD.
4. Quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) có được cung cấp đầy đủ không? Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ thông số kỹ thuật: tọa độ định vị tiêm não thất chuột nhắt, quy trình ủ hoạt hóa $\text{A}\beta_{25-35}$ ở 37°C trong 96 giờ, nồng độ cơ chất ATCI và thuốc thử DTNB trong phản ứng Ellman, quy trình đo MDA bằng phản ứng TBA ở 95°C và thông số nuôi cấy dòng tế bào lai NG108-15.
5. Định hướng lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo? Lộ trình 10 năm gồm: (1) Sàng lọc hoạt tính tinh khiết các dẫn xuất tanshinon; (2) Đánh giá trên động vật chuyển gen 3xTg-AD; (3) Nghiên cứu bào chế hệ phân phối thuốc nano siêu phân tán; (4) Thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm đánh giá hiệu lực trên bệnh nhân suy giảm nhận thức nhẹ và Alzheimer giai đoạn đầu.

Kết luận

1. Đã chuẩn hóa thành công quy trình chiết xuất cao toàn phần ethanol (EĐS, hiệu suất 15,0%) và cao phân đoạn n-hexan (HĐS, hiệu suất 2,9%) từ rễ Đan sâm di thực Sơn La, đạt hàm lượng hoạt chất chuẩn hóa cao (tanshinon IIA 5,6%, acid salvianolic B 3,0%).
2. Chứng minh thực nghiệm vững chắc tác dụng cải thiện toàn diện các dạng trí nhớ không gian ngắn hạn, không gian dài hạn, trí nhớ nhận diện và trí nhớ cảm xúc trên chuột nhắt trắng ở cả 3 mô hình bệnh sinh: scopolamin, $\text{A}\beta_{25-35}$ và trimethyltin ($p < 0,01$ đến $p < 0,001$).
3. Xác định cơ chế tác dụng liên quan đến giả thuyết cholinergic: ức chế enzym AChE trong mô não chuột và in vitro theo kiểu động học ức chế hỗn hợp không cạnh tranh.
4. Xác định tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh theo giả thuyết $\beta$-amyloid: gia tăng có ý nghĩa tỷ lệ tế bào sống sót NG108-15 bị gây độc bởi oligomer $\text{A}\beta_{25-35}$ ($p < 0,001$).
5. Xác định tác dụng chống stress oxy hóa: giảm tích tụ MDA trong mô não chuột bị gây tổn thương và dọn sạch các gốc tự do DPPH, gốc anion superoxid ($O_2^{\bullet-}$).
6. Mở ra hướng nghiên cứu và phát triển sản phẩm thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu Đan sâm di thực trồng tại Việt Nam phục vụ điều trị và làm chậm tiến triển bệnh Alzheimer.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ, thường gặp ở người cao tuổi. Số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao [20], [182]. Theo số liệu thống kê năm 2019 của World Alzheimer Report, có 50 triệu người mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới, trong đó 60-80% trường hợp là bệnh Alzheimer [16], [20]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm, ước tính khoảng 115 triệu người mắc bệnh vào năm 2050 [182].

Bệnh Alzheimer được xác định là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ sáu tại Hoa Kỳ, cùng với chi phí điều trị lớn đang trở thành gánh nặng đối với xã hội [20], [21]. Cho đến nay, mới chỉ có bốn thuốc được chấp thuận trong điều trị triệu chứng rối loạn nhận thức của bệnh Alzheimer [51], [60], [138]. Trong đó, ba thuốc có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase là donepezil, galantamin và rivastigmin liên quan đến giả thuyết cholinergic về cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Một thuốc còn lại có tác dụng ức chế thụ thể NMDA là memantin liên quan đến giả thuyết glutamat [51].

Tuy nhiên, đích tác dụng hiện nay không chỉ hướng tới giả thuyết cholinergic hay giả thuyết glutamat đơn lẻ mà còn hướng đến các giả thuyết khác như giả thuyết β-amyloid, giả thuyết protein tau hay giả thuyết stress oxy hóa [18], [42]. Do đó, nghiên cứu và phát triển các thuốc trong điều trị bệnh Alzheimer đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm. Trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu giữ vai trò rất quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer. Điều này có thể được minh chứng thông qua một nửa số thuốc được cấp phép trong điều trị bệnh Alzheimer hiện nay có nguồn gốc từ dược liệu [157].

Ưu điểm của các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu là ít tác dụng phụ và đem lại lợi ích kinh tế đối với bệnh mạn tính như Alzheimer [163]. Vì vậy, nghiên cứu và phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong điều trị bệnh Alzheimer đang là hướng đi phù hợp tại các nước có thế mạnh về nguồn thực vật như Việt Nam. Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae), được sử dụng hơn 1000 năm qua ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là khu vực châu Á để điều trị các bệnh thần kinh; các bệnh tim mạch; ung thư; 1 tiểu đường, suy thận và một số bệnh khác [163], [196]. Một số nghiên cứu trên thế giới bắt đầu ghi nhận các hoạt chất phân lập từ rễ Đan sâm có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer [95], [178], [239].

Các hoạt chất này thể hiện tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ in vivo trong các test hành vi thông qua khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của β-amyloid hay chống stress oxy hóa [137], [163]. Tại Việt Nam, Đan Sâm mới được di thực từ Trung Quốc và trồng tại một số tỉnh phía bắc như Lào Cai, Sơn La cho kết quả cây phát triển rất tốt [10]. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước mới chỉ ghi nhận cao toàn phần ethanol rễ Đan sâm di thực có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và chống oxy hóa in vitro [8]. Hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về tác dụng dược lý của Đan sâm di thực theo hướng điều trị bệnh Alzheimer.

Câu hỏi đặt ra là: Liệu Đan sâm di thực có tác dụng trong điều trị bệnh Alzheimer hay không và tác dụng trên những đích nào? Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)” với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi. Đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Kết quả của đề tài sẽ góp phần định hướng cho thử nghiệm lâm sàng để phát triển dược liệu Đan sâm di thực thành sản phẩm được dùng rộng rãi trong cộng đồng để điều trị bệnh Alzheimer.

Tổng quan về bệnh Alzheimer 1. Khái niệm Bệnh Alzheimer được mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 bởi một bác sỹ người Đức là Alois Alzheimer. Tuy nhiên phải đến năm 1984, một khái niệm tương đối hoàn chỉnh về bệnh Alzheimer mới được đưa ra dưới sự đồng thuận của Viện quốc gia về đột quỵ và các rối loạn thần kinh, giao tiếp và Hiệp hội bệnh Alzheimer và các rối loạn liên quan. Trong đó, Alzheimer là một bệnh rối loạn về não đặc trưng bởi trạng thái mất trí nhớ tiến triển xảy ra ở giai đoạn giữa và cuối đời.

Các đặc điểm của bệnh bao gồm thoái hóa một số tế bào thần kinh, xuất hiện các mảng β- amyloid ngoại bào và đám rối nội thần kinh; rối loạn cơ chế truyền tin trong hệ cholinergic ở não trước, đôi khi ảnh hưởng đến cả hệ noradrenegic và somatostatinergic [144]. Dịch tễ Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ và số lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao, ước tính tăng gấp ba lần vào năm 2050 [15]. Số lượng người mắc bệnh Alzheimer chiếm 60-80% trong 50 triệu ca mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới [16], [20]. Bệnh gặp chủ yếu ở người cao tuổi.

Tỷ lệ mắc bệnh chiếm khoảng 4% dân số trên 60 tuổi và 20-40% dân số trên 85 tuổi [83], [89]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm [182]. Tỷ lệ mắc bệnh ở nữ nhiều hơn nam [16]. Thời gian sống trung bình sau khi khởi phát sa sút trí tuệ dao động từ 3,3 đến 11,7 năm [79].

Ở Mỹ, số người trên 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer là 5,8 triệu, chiếm 10% dân số trên 65 tuổi. Ước tính đến năm 2050 số lượng bệnh nhân sẽ tăng lên 13,8 triệu. Đây là một trong 6 nguyên nhân tử vong hàng đầu tại Mỹ với 122.000 người chết vào năm 2018 [20], [21], [51]. Ở Châu Âu, tỷ lệ hiện mắc Alzheimer chiếm 5,1% dân số [243].

Ở Châu Phi, tỷ lệ hiện mắc là 57,1% dân số trên 50 tuổi. Với khu vực Châu Á, tỷ lệ hiện mắc ở Hàn Quốc là 4,8% dân số trên 65 tuổi; tại Trung Quốc là 1,9% dân số trên 60 tuổi. Đáng chú ý là tỷ lệ mắc bệnh ở các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển [181]. 3 Tại Việt Nam, chưa có báo cáo mang tính đại diện cho thực trạng bệnh Alzheimer trong cả nước.

Tuy nhiên, một số nghiên cứu dịch tễ đã tiến hành đánh giá tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở một số tỉnh và ghi nhận ở Ba Vì, thành phố Hà Nội, tỷ lệ người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm 4,5% dân số vào năm 2010 [7]; ở Đống Đa và Sóc Sơn, thành phố Hà Nội chiếm 4,2% dân số vào năm 2014 [9]. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng 1. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer biểu hiện qua các rối loạn liên quan đến nhận thức và không liên quan đến nhận thức. Một số triệu chứng liên quan đến nhận thức như suy giảm trí nhớ, suy giảm sử dụng động tác, suy giảm thị giác không gian, suy giảm ngôn ngữ và suy giảm chức năng điều hành.

Trong số đó, suy giảm trí nhớ là dấu hiệu lâm sàng điển hình nhất, thường xuất hiện sớm và mức độ tăng dần theo thời gian. Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển trải qua ba giai đoạn gồm tiền lâm sàng, suy giảm nhận thức nhẹ và sa sút trí tuệ [42], [195]. Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh có thể xuất hiện một số biểu hiện của rối loạn nhận thức như giảm trí nhớ ngắn hạn và ngôn ngữ. Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ, người bệnh thường có biểu hiện giảm cả trí nhớ ngắn hạn và dài hạn kèm theo giảm chức năng điều hành, ngôn ngữ và thị giác không gian.

Giai đoạn sa sút trí tuệ tiến triển theo ba mức độ: nhẹ, trung bình và nặng. Trong giai đoạn sa sút trí tuệ mức độ nặng, người bệnh có biểu hiện mất trí nhớ kèm theo suy giảm nặng nề hoặc mất chức năng điều hành, sử dụng động tác, ngôn ngữ và thị giác không gian nên phải phụ thuộc hoàn toàn vào người chăm sóc [14], [145], [195]. Ngoài ra, bệnh Alzheimer cũng biểu hiện qua triệu chứng không liên quan đến nhận thức bao gồm rối loạn hành vi, tâm thần và cảm xúc như thờ ơ, kích động, gây hấn, không hợp tác, đi lang thang; hoang tưởng, ảo giác, co giật, động kinh; thay đổi tính khí, lo âu, rối loạn giấc ngủ và trầm cảm [42], [195]. Trong giai đoạn tiền lâm sàng, người bệnh chưa có biểu hiện rối loạn hành vi, tâm thần hay cảm xúc.

Những rối loạn này bắt đầu xuất hiện ở giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và trở nên trầm trọng ở giai đoạn sút trí tuệ mức độ nặng [14], [15], [51], [80], [145], [195]. Đặc điểm cận lâm sàng Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer được xác định thông qua các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm dịch não tủy hay sinh hóa. Trong giai đoạn tiền lâm sàng ghi nhận một số thay đổi trong xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh và dịch não tủy nhưng không ghi nhận sự thay đổi trong xét nghiệm sinh hóa. Trong giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và giai đoạn sa sút trí tuệ ghi nhận những thay đổi trong các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh, dịch não tủy và sinh hóa, nhưng mức độ khác nhau [14], [80], [195].

Chi tiết được trình bày trong bảng 1. Một số đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Alzheimer [14], [80], [195] Đặc điểm cận Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ Giai đoạn tiền lâm sàng lâm sàng và sa sút trí tuệ - Có hoặc không có sự tích lũy - Có tích lũy mảng amyloid Xét nghiệm mảng amyloid - Có hiện tượng teo vùng thái dương chẩn đoán - Có hiện tượng mất chất xám, trung gian, giảm thể tích vùng hải hình ảnh mất một phần vỏ não hoặc teo mã, giảm tưới máu trong vỏ não. - Nồng độ protein tau hoặc tau - Nồng độ protein tau hoặc tau Xét nghiệm phosphoryl hóa tăng cao phosphoryl hóa tăng cao dịch não tủy - Nồng độ β-amyloid1-42 thấp - Nồng độ β-amyloid1-42 tăng cao - Nồng độ các chất đánh dấu sinh học liên quan đến phản ứng viêm, Xét nghiệm stress oxy hóa và các chất đánh dấu sinh hóa liên quan đến thoái hóa tế bào thần kinh như chết tế bào đều tăng cao.