MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thần kinh thoái hóa tác động đến trí nhớ, suy ngh và hành vi của con người. AD ảnh hư ng đến hơn 20 triệu người trên toàn thế giới bao gồm cả 4,5 triệu người Mỹ và được coi là nguyên nhân lớn thứ ba gây tử vong các nước phát triển sau bệnh tim mạch và ung thư [1]. Hiện tại không có phương thức chữa trị cho AD. Tuy nhiên, sử dụng các chất ức chế cholinesterase (AChEI) là một trong những hầu hết các chiến lược được chấp nhận trong điều trị AD [2].
Huperzin A (HupA), một Lycopodium alkaloid, được tách chiết lần đầu tiên từ một cây thảo dược truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. Sau khi các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc được công bố, thì các nhà khoa học Phương Tây đã kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh suy giảm về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. Alkaloid này có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram.
Trên thực tế, HupA ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, một enzym tạo ra sự suy thoái của acetylcholine. Khi mà enzym này bị thiếu hụt, hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp thì hàm lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện. So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [5].
Các nghiên cứu về hoạt chất Huperzine A trong cây H. serrata làm nguyên liệu trong sản xuất thuốc chữa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ và AD 3 đã thu được các thành tựu rất đáng quan tâm. Các kế hoạch bảo tồn, phát triển loài này được một số nước trong đó có Trung Quốc chú trọng phát triển. Ngoài phát triển trồng trọt, nhân giống invitro cũng đã được quan tâm nhằm nhân nhanh sản lượng cây và tăng cao sản lượng hoạt chất HupA [6, 7].
Tuy nhiên, do điều kiện nuôi trồng thực vật cây H. serrata cũng như nuôi cấy cây in vitro rất khó khăn (đòi hỏi phải mất nhiều thời gian kéo dài nhiều năm, chi phí nhiều cho trồng trọt nhân cây) để có thể thu được một lượng lớn cây nguyên liệu cho chiết tách được một lượng lớn HupA phục vụ việc sản xuất thuốc, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh ra HupA là quan trọng, cần được quan tâm và là một hướng đi mới nhằm hướng tới một nguồn nguyên liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp dược trong nước và trong điều trị bệnh suy giảm trí nhớ tại Việt Nam, đáp ứng cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Vi sinh vật nội sinh thường sống trong mô thực vật được tìm thấy vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật. Nấm nội sinh trong thực vật thường sinh trư ng, phát triển nội sinh hoàn toàn hoặc một phần trong mô của các tế bào cây chủ, thường không gây triệu chứng rõ ràng của bệnh.
Gần đây, nấm nội sinh được phân lập từ các loại cây trồng đã được chấp nhận như là một nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác nhau đã được chiết xuất từ các nấm nội sinh này [8]. Do đó, việc nghiên cứu phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata có khả năng sản sinh hoạt chất HupA đã được các nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành công nghiệp dược.
Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis.
Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách 4 "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam trước đây đã có nhiều nghiên cứu về vi nấm nội sinh trong một số loại cây trồng, tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay là chưa có công bố. Hiện tại, lần đầu tiên tại Việt Nam, từ năm 2015 đến nay, Viện Công nghệ sinh học đã và đang có các nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài cấp cơ s và cấp Nhà nước về các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Việt Nam.
Nhóm đề tài đã thu được các kết quả rất khả quan, trong đó chủng vi nấm Penicillium sp.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt là một trong những chủng giống có tiềm năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA cao. Vì vậy, đề tài: ạ ừ y T ạ ù ư được thực hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, từ đó tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc trong nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer sau này. Mụ đí đề à : Nâng cao được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của chủng nấm Penicillium sp.4 nhằm tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc cho nghiên cứu, sản xuất HupA trong h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer. d : - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp.
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp.4 bằng phương pháp đột biến chủng. - Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp.4 bằng phương pháp nuôi cấy chủng. 5 rất nhiều năm (có khi tới 15 năm) phát triển trong tự nhiên mới có thể để sử dụng làm thuốc. Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất HupA từ cây Thạch tùng răng cưa làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc là không cao (khoảng 0,1%).
B i vậy, có rất nhiều sự n lực để thực hiện việc sản xuất HupA như nuôi cấy in vitro cây H. serrata và tổng hợp hóa học [6]. Họ Huperziaceae bao gồm 2 chi: Huperia và Phlegmariurus. Loài Huperzia hiện đang nằm trong danh sách tuyệt chủng của các loài thực vật, hầu hết chúng được sử dụng trong mục đích y tế.
Trong các loài khác nhau của Huperziaceae, hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy Phlegmariurus caritus cao hơn loài Huperzia serata. Cây trồng trong điều kiện độ ẩm cao ( các khu rừng ẩm ướt) cũng cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với cây trồng trong môi trường có độ ẩm thấp. Lượng HupA cũng thay đổi đáng kể theo mùa, cao nhất giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân. Hàm lượng Huperzine A cao nhất loài H.9 µg g-1 dw), hàm lượng Huperzia elmeri từ Philippines (60 µg g-1 ) và H.
carinata (1030 µg g-1) từ Queensland, Australia. serrata từ Trung Quốc đạt từ 80,2- 182,6 µg g-1 [5]. Trong điều kiện Việt Nam chỉ có thể nuôi trồng được H. serrata như của Trung Quốc.
Hoạt chất Huperzine A (HupA) Huperzine A là một Lycopodium alkaloid, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa. Các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên cô lập được chất này từ cây và tiến hành các thí nghiệm lâm sàng cũng như các ứng dụng điều trị các bệnh rối loạn trí nhớ tại Trung Quốc. Sau đó, các nhà khoa học phương Tây cũng nghiên cứu và đã kết luận HupA có tác dụng rất tốt trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer.1 2 1 Bệ Bệnh Alzheimer (AD, SDAT) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất. Vào năm 1906, lần đầu tiên bác s tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer đã chỉ ra căn bệnh này không thể chữa được, mang tính thoái hóa và gây tử vong.
Căn bệnh này được đặt theo 7 tên ông. Trong những năm 1970 - 1985 khoa học nhận thấy người mất trí các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau. Khi bệnh tiến triển, các triệu chứng bao gồm sự nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, mất khả năng phân tích ngôn ngữ, mất trí nhớ dài hạn, suy giảm các giác quan. Dần dần, cơ thể sẽ mất đi một số chức năng, cuối cùng dẫn đến cái chết.
Bệnh Alzheimer có thể phát triển tiềm tàng trong một thời gian dài trước khi xuất hiện những triệu chứng có thể phát hiện được bệnh. Thông thường khi các triệu chứng này bộc lộ, thì người bệnh chỉ có thể sống được khoảng 7 năm, dưới % bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau khi phát hiện bệnh. Bệnh này thường xuất hiện người trên 65 tuổi, tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới.
Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1,18% vào năm 2050. Hiện nay khoa học vẫn chưa hiểu rõ nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer. Nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có liên quan với các mảng và đám rối trong não. Các phương pháp điều trị hiện tại chỉ giúp giảm một phần nhỏ triệu chứng bệnh, chưa có phương pháp trị liệu nào có thể ngăn chặn hoặc làm chậm tiến triển của bệnh.
Tính tới thời điểm 200 , đã có hơn 500 thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp chữa trị bệnh Alzheimer, nhưng vẫn chưa biết có kết quả nào khả quan trong các phương pháp đã được thử nghiệm. Một số thói quen sống đã được đưa ra khuyến cáo nhằm phòng ngừa bệnh Alzheimer, nhưng cũng chưa có đủ chứng cớ cho thấy những khuyến cáo này có thể làm giảm sự thoái hóa não.