CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULFATE VÀ ỨNG DỤNG 1. Cấu trúc chondroitin sulfate Chondroitin sulfate (CS) là một polysaccharid, thuộc nhóm heteropolysaccharid gọi là glycosaminoglycan (GAG), được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng một polyme mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản được cấu tạo bởi 2 loại đường là N-acetyl-D- galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D- galactosamine and D-glucuronic acid). Các gốc đường này có thể được sulphate hóa hay không bị sulphate hoá [23, 63], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA).
Chondroitin sulfate là một polyme tự nhiên có chứa 15÷150 đơn vị cấu trúc của đơn vị cơ bản gồm 2 loại đường là GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10. Năm 1950, Julia Einbinder và Maxwell Schubert lần đầu tiên phát hiện và tách chiết được chondroitin sulfate từ sụn bằng cách kỹ thuật chiết rút chondroitin sulfate trong dung dịch natri hydroxit 2%. Sau đó, Julia Einbinder và Maxwell Schubert đã tinh sạch được chondroitin sulfate bằng cách sử dụng canxi clorua khử protein ra khỏi dịch chiết, thu được chondroitin sulfate [65].
công bố nghiên cứu về CS và cho rằng CS thường gắn với các protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một phức chất proteoglycan (PG) (glucoprotein) - là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharid [56, 57, 65, 81, 84, 85]. Sự kết hợp giữa nhóm sulphate (SO42-) với các nhóm carboxyl (COO-) làm cho phân tử chondroitin sulfate có mật độ điện tích âm rất cao dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG. Trong cấu trúc của proteoglycan, CS thường gắn với nhóm OH của acid amin serine nằm trong chuỗi polypeptid của protein. Các nhà khoa học vẫn chưa biết được cách protein gắn chọn lọc chính xác với GAG.
Tuy thế, họ cho rằng GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của chuỗi GAG với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal-Gal-GlcA trong đó xylose gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [45, 48, 79]. 4 luan an Chondroitin sulfate là polyme ưa nước vì thế mô sụn có hàm lượng nước cao. Phân tử đường trong cấu trúc của CS có thể không bị sulphate hoá, bị sulphate hoá 1 lần hay 2 lần, đa phần nhóm OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulphate hoá, đối với một số chuỗi GAG có thể bị sulphate hoá ở vị trí 2 của GlcA.
Quá trình sulphate hoá là nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulphate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù cho CS [39, 45, 48÷50]. Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động enzyme và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào [39, 45, 48÷50]. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống.
Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80÷100 mạch CS) cùng với protein và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thủy động học có khả năng nén thuận nghịch giúp cho mô sụn chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [38]. Công thức và cấu trúc hoá học của một đơn vị trong cấu trúc của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n được trình bày ở hình 1.
Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi chondroitin sulfate [23,56] Chondroitin-4-sulphate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H. Chondroitin-6-sulphate: R1 = SO3H; R2, R3 = H. Cấu trúc mạch của các chondroitin sulfate [23, 56] 5 luan an Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C được đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulphate trong disaccharid lặp lại của chuỗi polysaccharid. Chondroitin sulfate A: gốc sulphate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphate, GlcA-GalNAc-4S, CS4) (Hình 1.3), kết hợp với protein tạo nên chondromucoid và có nhiều ở mô sụn.
Chondroitin sulfate C: gốc sulphate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphate, CS6). Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S, CS4): acid iduronic thay thế acid glucuronic (hình 1. CS4 còn được gọi là dermatant sulphate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường có nhiều ở da, ngoài ra còn gặp ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulphate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid [23, 56].
Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) thường được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối,. Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa nhiều hay ít các isome của CS, có tới 16 isome của CS, phụ thuộc vào vị trí sulphate hóa của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ mỗi cặp. Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG. Cấu trúc một đơn vị của Hình 1.
Cấu trúc của chondroitin chondroitin sulfate A sulfate B Hình 1. Cấu trúc của chondroitin sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S) - CS6 Người ta tách chiết được CS trước khi cấu trúc của nó được xác định. Do vậy, tên gọi của CS cũng có sự thay đổi. Phân loại CS được tóm tắt trong bảng 1.
6 luan an Bảng 1. Phân loại chondroitin sulfate [23, 56] Tên Vị trí bị sulphate hoá Tên phân loại Carbon 4 của đường - N- Chondroitin-4-sulphate (CS4); ở Chondroitin sulfate A acety-D-galactosamine người có trong: sụn khớp, giác (GalNAc) mạc, da, thành mạch,. Chondroitin sulfate B Carbon 4 của GalNAc – Chondroitin-4-sulphate (CS4) (Dermatant sulphate) L-iduronic acid Chondroitin sulfate C Carbon 6 của GalNAc Chondroitin-6-sulphate (CS6) Carbon 2 của glucuronic Chondroitin-2,6-sulphate (C2, Chondroitin sulfate D acid and 6 của GalNAc 6S) Carbon 4 và 6 của Chondroitin-4,6-sulphate (C4, Chondroitin sulfate E GalNAc 6S) CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, tan tốt trong nước và rất dễ hút ẩm nhưng không tan trong ethanol, methanol, acetone,. Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc vào khoảng 15.
Kỹ thuật thu nhận chondroitin sulfate Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp nên người ta chưa thể tổng hợp được CS bằng con đường tổng hợp hoá học. Hiện nay người ta mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharid ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS ở dạng tetrasaccharid (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hóa của neron thần kinh, còn phân tử CS dạng disaccharid thì không có tác dụng trên [23, 56]. CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các nguồn tự nhiên bằng con đường chiết rút CS từ các loại mô sụn động vật. Sụn vi cá mập (xương sọ, xương sống, vây, .) là nguồn nguyên liệu thu nhận CS phổ biến nhất dùng làm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng [58, 63, 66].
Trong mô sụn của động vật, chondroitin sulfate liên kết chặt với protein tạo thành dạng phức proteoglycan. Vì vậy, muốn thu nhận CS, việc đầu tiên người ta phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết giữa CS-protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS [23, 56]. 7 luan an * Các phương pháp thu nhận chondroitin sulfate thô Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn cá có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzyme) để thuỷ phân sụn cá [23, 44, 56, 58, 81]. Trong phương pháp hoá học, mô sụn được xử lý bằng nước nóng hoặc dung dịch muối hoặc kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH,.) để tách GAG khỏi các phân tử (protein, hyaluronic acid, …) [56].
Phương pháp này đã được áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò [23, 57, 63, 65, 71, 88]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp hóa học là phá vỡ các liên kết glycosid của CS khi thu nhận CS. Phương pháp sinh học dùng enzyme để thủy phân mô sụn, đây là phương pháp có hiệu quả để thu nhận CS. Do CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học và phương pháp này không gây ô nhiễm môi trường do các hóa chất (muối, kiềm, acid,.
Một số nghiên cứu cho rằng có thể sử dụng enzyme protease (papain, actinase, pronase,…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết. Sau đó, loại bỏ protein thì CS được tách ra và tinh sạch. Phương pháp này đã được dùng để thu nhận GAG từ da xương cá Labeo rohita [63], sụn của mực, cá mập, cá sấu, cá đuối,. Các chuỗi dài hydrophilic polyme GAG không tan trong ethanol, acetone và methanol.
Vì vậy, người ta có thể sử dụng các dung môi hữu cơ để kết tủa thu CS thô. Một số nghiên cứu cho thấy ethanol 60÷80% có khả năng kết tủa được CS và tách CS ra khỏi các polysaccharid khác [56]. * Các phương pháp tinh sạch chondroitin sulfate Chế phẩm CS thô thu được thường có chứa một lượng tạp chất, chẳng hạn như collagen, protein, hyaluronic acid, muối khoáng,. Do vậy, người ta cần phải tiến hành các bước tinh sạch để loại các tạp chất trên.
Để thu CS tinh khiết, người ta có thể sử dụng các muối của ammonium như cetylpyridium chloride (CPC) hoặc cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) để tạo phức kết tủa với các GAG và các polysacharid khác sau đó loại collagen ra khỏi kết tủa [56]. Các GAG có gốc sulphate trong phức hợp kết tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ bị hòa tan trong một số muối NaCl hoặc KCl ở nồng độ thấp (0,3÷0,4M). Sau khi loại bỏ các GAG có gốc sulphate như hyaluronic acid, chỉ còn lại tủa CPC-GAG và CTAB-GAG [56]. CS trong phức tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ được hòa tan phần lớn trong một số loại muối ở nồng độ 8 luan an cao (0,9-2,0M KCl; 2,0M NaCl; 1N MgCl2 và 0,7N÷1,5 M MgSO4,.), sau đó tiếp tục tinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng dung môi hữu cơ để thu CS tinh khiết.
Scott cho rằng phương pháp trên là phương pháp hiệu quả để tách và tinh sạch các loại polysaccharid và nucleic acid ra khỏi CS [56]. CS là một polyanion có điện tích âm (-) rất cao, nên CS rất dễ liên kết và bám dính trên các cột sắc ký. Vì vậy, người ta có thể tinh sạch CS bằng sàng lọc phân tử nhờ các cột sắc ký trao đổi ion (DEAE-Sephacel, DOWEX 50, DEAE-Cellulose, .) hoặc bằng sắc ký lọc gel (Sepharose CL-6B, sephacryl S-300, sephadex - G25,. * Các phương pháp định tính và định lượng chondroitin sulfate Người ta thường xác định hàm lượng CS dựa vào sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) khi gắn với CS.