Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ kỹ thuật chuyên ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản (mã số 9540105) của nghiên cứu sinh Đinh Hữu Đông, thực hiện tại Trường Đại học Nha Trang dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Vũ Ngọc Bội và PGS. Nguyễn Anh Tuấn (năm 2021), mang tiêu đề: "Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease".

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Chondroitin sulfate (CS) là một glycosaminoglycan (GAG) cấu tạo từ các đơn vị disaccharid lặp lại gồm acid D-glucuronic (GlcA) và N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) gắn nhóm sulfate. Hợp chất này giữ vai trò thiết yếu trong cấu trúc sụn khớp, duy trì độ bôi trơn và tính đàn hồi của dịch khớp, đồng thời ức chế các enzyme phá hủy mô sụn như collagenase, phospholipase A2 và N-acetylglucosaminidase, hỗ trợ nuôi dưỡng tế bào giác mạc mắt.

Trong sụn cá mập, hàm lượng CS cao hơn so với sụn động vật có vú trên cạn, nhưng CS tồn tại dưới dạng phức hợp proteoglycan liên kết cộng hóa trị (o-glycosid) với chuỗi polypeptid của protein, khiến cơ thể người khó hấp thu trực tiếp khi sử dụng dạng bột sụn thô. Các phương pháp xử lý truyền thống thường sử dụng tác nhân hóa học (acid vô cơ mạnh như HCl hoặc kiềm NaOH) kết hợp nhiệt độ cao nhằm tách chiết và kết tủa riêng CS. Tuy nhiên, cách tiếp cận này bộc lộ các nhược điểm:

  • Gây phân hủy một phần liên kết glycosid và làm mất nhóm sulfate ở vị trí carbon C-4 hoặc C-6, làm giảm hoạt tính sinh học của CS.
  • Loại bỏ toàn bộ phần đạm hòa tan, peptid mạch ngắn và khoáng chất tự nhiên có trong sụn cá, gây lãng phí nguồn dinh dưỡng sinh học quý giá.
  • Sử dụng hóa chất đậm đặc phát sinh chất thải gây ô nhiễm môi trường.

Tại Việt Nam, nguồn phụ phẩm sụn từ khai thác cá mập chủ yếu được phơi khô và bán thô với giá trị kinh tế thấp. Trước thời điểm nghiên cứu của luận án, chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu một cách hệ thống việc sử dụng enzyme protease thương mại để thủy phân sụn cá mập tươi nhằm thu nhận đồng thời cả phân đoạn đạm hòa tan và chondroitin sulfate bảo toàn cấu trúc, sau đó chế biến thành bột đạm chức năng bằng công nghệ sấy phun.

Mục tiêu nghiên cứu

Tận dụng nguồn nguyên liệu phụ phẩm sụn cá mập tươi (C. dussumieri) trong chế biến thủy sản để tạo ra dịch thủy phân và sản phẩm bột đạm chứa chondroitin sulfate cùng các hợp chất tự nhiên bằng công nghệ enzyme protease thân thiện với môi trường, định hướng ứng dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị và chống thoái hóa xương khớp.

Nội dung nghiên cứu của luận án

Văn bản luận án xác định 3 nội dung nghiên cứu chính:

  1. Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C. dussumieri) bằng enzyme protease.
  2. Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập và xác định cấu trúc chondroitin sulfate.
  3. Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri (Muller & Henle, 1839)).
  • Phạm vi không gian: Nguyên liệu cá mập nguyên con được thu mua tại cảng cá Vĩnh Lương, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Cá tươi có khối lượng trung bình từ 40 đến 60 kg/con.
  • Phạm vi thời gian: Thu mẫu trong các mùa khai thác cá mập tự nhiên từ tháng 2 đến tháng 10 hàng năm.
  • Quy mô thực nghiệm: Toàn bộ các quá trình thủy phân, phân tích hóa sinh, kiểm tra phổ cấu trúc và sấy phun được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm (mỗi mẻ thủy phân khảo sát sử dụng 2 kg sụn cá mập đã sơ chế, xay nhỏ).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Tài liệu luận án tổng thuật các công trình nghiên cứu về cấu trúc, phương pháp trích ly và tinh sạch chondroitin sulfate từ sụn động vật:

  • Lịch sử trích ly và tinh sạch: Năm 1950, Julia Einbinder và Maxwell Schubert lần đầu tách chiết CS từ mô sụn bằng dung dịch NaOH 2% và tinh sạch bằng cách dùng CaCl2 để kết tủa loại bỏ protein. Scott thiết lập phương pháp kết tủa GAG bằng các muối amoni bậc bốn như Cetylpyridinium chloride (CPC) và Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), sau đó hòa tan chọn lọc trong các nồng độ muối NaCl/KCl để phân đoạn polysaccharid.
  • Phương pháp định lượng và y học: Farndale và cộng sự xây dựng quy trình định lượng CS bằng phản ứng so màu với thuốc thử 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB) ở bước sóng 525 nm. Mac Rae và cộng sự công bố các tác động của CS trong việc hạn chế tổn thương nội mô và biểu mô giác mạc mắt.
  • Nghiên cứu thủy phân sụn động vật bằng hóa chất và enzyme:
    • Kang C. và cộng sự (Đại học Konkuk, Hàn Quốc) dùng Alcalase 2% xử lý sụn gà để chiết xuất phức hợp mucopolysaccharid-protein nhưng chưa tinh sạch được CS.
    • Nakano T. (Đại học Meiji, Nhật Bản, 2000) dùng HCl 6M ở 110°C trong 24 giờ để chiết xuất CS-peptid từ sụn mũi trâu bò; phương pháp đạt hiệu suất cao nhưng làm mất gốc sulfate ở vị trí C-4.
    • Nhóm nghiên cứu tại Đại học Bắc Kinh, Trung Quốc (2014) khảo sát 5 loại enzyme (Papain, Bromelin, Alcalase, Neutrase, protease tụy tạng) trên sụn cá mập và ghi nhận Neutrase cho hiệu quả cao nhất.
    • Anlin Lim và cộng sự (Đại học Khoa học và Công nghệ Tây Nam Trung Quốc, 2010) trích ly CS từ sụn thanh quản lợn nhưng dùng acid trichloroacetic (TCA) trong tinh chế, không phù hợp cho thực phẩm.
    • Nhóm nghiên cứu tại Đại học Prince Songkla, Thái Lan (2014) phối hợp NaOH và Alcalase để thủy phân sụn vịt, kết quả NaOH làm mất gốc sulfate C-6.
    • Cheng Chang Yu và cộng sự (Đại học Hải Nam, Trung Quốc, 2014) chiết xuất CS từ phụ phẩm cá rô phi bằng kiềm loãng kết hợp vi sóng nhưng hiệu suất thấp.
    • F (Đại học Công nghệ Chiết Giang, Trung Quốc, 2014) thủy phân sụn cá mập bằng Neutrase (45°C, 5 giờ, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 10 ml/g), sau đó tinh sạch qua cột DEAE-Sepharose đạt hiệu suất thu hồi CS 88,4% và collagen peptid 78,3%, nhưng CS bị mất gốc sulfate C-4.
    • Nghiên cứu năm 2018 trên hải sâm Cucumaria frondosa dùng sắc ký trao đổi anion làm mất gốc sulfate C-6.

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và hiện trạng khai thác

  • Tình hình khai thác nguồn lợi: Theo khảo sát của Nguyễn Văn Long và Võ Sĩ Tuấn (Viện Hải dương học Nha Trang, 2010–2011) tại 6 tỉnh ven biển (Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận), có 530 tàu thuyền tham gia khai thác cá mập/nhám thuộc 6 loại nghề (câu cá mập, câu cá ngừ, lưới cản, lưới ba màng, lưới vây, lặn) tại 3 ngư trường chính. Sản lượng tập trung cao ở Bình Thuận (886 tấn/năm), Bình Định (201 tấn/năm), Phú Yên (186 tấn/năm). Do quy định hạn chế đánh bắt quốc tế, sản lượng hiện nay chủ yếu là đánh bắt ngẫu nhiên.
  • Nghiên cứu thủy phân sụn cá trong nước:
    • Trần Cảnh Đình, Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú (Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng, 2010) dùng chế phẩm protease ngoại bào từ Bacillus subtilis B26 thủy phân sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và sụn cá nhám khô (Carcharhinus sorrah) với tỷ lệ 0,4 ml enzyme (0,17 UI/ml)/1g sụn, pH 8,5, 50°C, 12 giờ.
    • Vũ Thị Thanh Tâm (Đại học Nha Trang, 2012) nghiên cứu thu hồi CS từ sụn cá đuối và cá nhám khô bằng protease từ B. subtilis B26.
  • Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sấy phun: Luận án điểm lại các công trình sấy phun dịch chiết tự nhiên trong nước gồm Vũ Thị Hằng và cộng sự (2015) sấy phun dịch gấc ở 60°C; Phan Tại Huân, Phạm Đức Toàn, Kha Chấn Tuyền (2014) sấy vi nang dầu gấc ở nhiệt độ khí vào 154°C và khí ra 80°C (hiệu suất 53%); Ngọc Ánh, Mạc Thị Hà Thanh (2019) sấy phun bột nhàu ở 160°C.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình trước đây chủ yếu thực hiện trên sụn cá khô hoặc sụn động vật trên cạn, sử dụng tác nhân hóa học hoặc enzyme đơn lẻ để trích ly riêng lẻ phân đoạn CS, dẫn đến mất nhóm sulfate chức năng và loại bỏ dịch đạm dinh dưỡng. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách:

  1. Sử dụng trực tiếp sụn cá mập trắng tươi (C. dussumieri).
  2. Thiết lập tổ hợp enzyme protease thương mại thích hợp để thủy phân triệt để proteoglycan, bảo toàn nguyên vẹn hai gốc sulfate C-4 và C-6 của CS.
  3. Thu nhận toàn phần dịch thủy phân giàu đạm, acid amin và CS, sau đó áp dụng công nghệ sấy phun với chất mang thích hợp để tạo chế phẩm bột đạm hoàn chỉnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cấu trúc Chondroitin Sulfate

Chondroitin sulfate là một heteropolysaccharid mạch thẳng gồm 15–150 đơn vị disaccharid lặp lại [→4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→], khối lượng phân tử phân bố từ 10 đến 50 kDa. Các dạng CS được phân loại dựa trên vị trí gắn nhóm sulfate:

Tên gọi Vị trí bị sulfate hóa Cấu trúc disaccharid lặp lại Nguồn gốc phân bố chính
Chondroitin sulfate A (CS4) Carbon C-4 của GalNAc GlcA - GalNAc-4S Sụn động vật có vú, giác mạc, thành mạch
Chondroitin sulfate B Carbon C-4 của GalNAc (epime hóa) IdoA - GalNAc-4S (Dermatant sulfate) Da, gân, van tim
Chondroitin sulfate C (CS6) Carbon C-6 của GalNAc GlcA - GalNAc-6S Sụn cá sụn (cá mập, cá đuối)
Chondroitin sulfate D Carbon C-2 của GlcA và C-6 của GalNAc GlcA-2S - GalNAc-6S Sụn cá sụn
Chondroitin sulfate E Carbon C-4 và C-6 của GalNAc GlcA - GalNAc-4,6S Sụn mực, động vật thân mềm

Nguyên vật liệu và chế phẩm sử dụng

  • Nguyên liệu chính: Sụn cá mập trắng tươi (Carcharhinus dussumieri), làm sạch mô cơ, xay nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
  • Chế phẩm enzyme protease:
    • Alcalase 2,4L: Serine endopeptidase từ Bacillus licheniformis (Novozymes - Đan Mạch), hoạt tính 2,4 AU/g, pH hoạt động 6,0–8,0, nhiệt độ 30–65°C.
    • Papain: Cysteine protease từ nhựa đu đủ (Merck - Đức), hoạt tính ≥ 2,0 mAnsonU/mg, pH hoạt động 4,5–8,5, nhiệt độ hoạt động 50°C.
    • Neutrase 0,8L: Metallo-endopeptidase (Advanced Enzyme Technologies - Ấn Độ), hoạt tính 0,8 AU/g, pH hoạt động 5,5–7,5, nhiệt độ 40–50°C.
    • Flavourzyme: Hỗn hợp endopeptidase và exopeptidase từ Aspergillus oryzae (Novozymes), hoạt tính 500 LAPU/g, pH 5,0–7,0, nhiệt độ 50–55°C.
  • Chất mang sấy phun:
    • Maltodextrin (Nhật Bản): độ ẩm 6,12%, chỉ số DE = 17–20.
    • Gum arabic (Trung Quốc): tan hoàn toàn trong nước lạnh, pH tự nhiên 3,9–4,9.
    • Saccharose (Nhật Bản): độ ẩm 4–5%, chỉ số DE = 22–25.

Phương pháp phân tích và kiểm nghiệm

Luận án áp dụng hệ thống phương pháp phân tích tiêu chuẩn định lượng các chỉ tiêu hóa sinh, hóa học, cấu trúc và vi sinh:

Nhóm phân tích Chỉ tiêu phân tích Phương pháp / Tiêu chuẩn áp dụng Thiết bị / Hóa chất chính
Hoạt độ & CS Hoạt độ protease Phương pháp Anson Cơ chất casein, thuốc thử Folin-Ciocalteau
Hàm lượng CS Phương pháp Farndale và cộng sự Thuốc thử DMMB, đo quang bước sóng 525 nm
Hóa sinh & Hóa học Protein hòa tan Phương pháp Lowry Thuốc thử Folin-Ciocalteau, đo quang 650 nm
Hàm lượng Peptid Phương pháp Folin sau kết tủa TCA 20% Chuẩn tyrosine, đo quang bước sóng 660 nm
Nitơ tổng số (NTS) Phương pháp Kjeldahl TCVN 8133-1:2009
Nitơ acid amin ($N_{aa}$) Phương pháp chuẩn độ formol Sorensen Chuẩn độ NaOH
Nitơ amoniac ($N_{NH3}$) Chưng cất lôi cuốn hơi nước Bộ chưng cất Kjeldahl
Lipid tổng số Phương pháp Soxhlet Chiết dung môi hữu cơ
Độ ẩm / Nước Sấy đến khối lượng không đổi ở 105°C TCVN 1867:2001
Khoáng tổng số (tro) Nung ở nhiệt độ 600°C TCVN 5611-1991
Kim loại (Zn, Mg, Fe) Quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Máy Jarrell-Ash Model AA-IEWT (AOAC 999.11)
Thành phần acid amin Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC AOAC 994.12
Cấu trúc & Lý tính Nhóm chức phân tử Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Máy Nicolet Impact 410 FTIR Spectrometer
Cấu trúc mạch & liên kết Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) Máy Bruker Avance 500 MHz (đo tại 70°C, dung môi D2O)
Tính chất nhiệt Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) Thiết bị DSC-60 Shimadzu (30–600°C)
Vi sinh vật Tổng vi khuẩn hiếu khí Đếm khuẩn lạc TCVN 4884:2005
Nấm men và nấm mốc Đếm khuẩn lạc TCVN 4993:1989
Coliforms Đếm khuẩn lạc TCVN 4882:2007
Salmonella Phát hiện sự có mặt/không có mặt TCVN 4829:2005

Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu

  • Khảo sát đơn yếu tố thủy phân: Bố trí tuần tự các thí nghiệm nhằm xác định: (1) Loại enzyme (Neutrase, Alcalase, Flavourzyme, Papain, hỗn hợp Alcalase+Papain 1:1); (2) Tỷ lệ phối trộn Alcalase/Papain (80/20, 70/30, 60/40, 50/50, 40/60, 30/70); (3) Nồng độ enzyme (0,1% đến 0,5%); (4) Tỷ lệ nguyên liệu sụn/nước (70/30 đến 30/70); (5) pH môi trường (6,0 đến 8,0); (6) Nhiệt độ thủy phân (35°C đến 65°C); (7) Thời gian thủy phân (từ 2 giờ đến 30 giờ).
  • Khảo sát đơn yếu tố sấy phun: Đánh giá loại chất mang (Maltodextrin, Gum arabic, Saccharose); tỷ lệ chất mang bổ sung (từ 6% đến 16%); nhiệt độ buồng sấy (60°C đến 100°C); áp suất buồng sấy (1,5 đến 3,0 bar); tốc độ bơm nhập liệu (8 đến 16 ml/phút).
  • Tối ưu hóa đa yếu tố: Áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực tâm xoay (Rotatable Central Composite Design - RCCD) kết hợp phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) để xây dựng mô hình hồi quy bậc hai và xác định điểm tối ưu cho quá trình thủy phân và quá trình sấy phun.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Giới thiệu về chondroitin sulfate và ứng dụng

Chương này hệ thống hóa cơ sở lý luận về cấu trúc phân tử GAG, hóa học của chondroitin sulfate, cơ chế liên kết proteoglycan trong mô sụn động vật và các cơ chế dược lý trong điều trị khớp, giác mạc và ức chế khối u.

Chương tổng thuật các kỹ thuật chiết tách truyền thống bằng hóa chất so với kỹ thuật sinh học sử dụng protease; phân tích đặc điểm phân bố và sản lượng khai thác cá mập trên thế giới và tại 6 tỉnh ven biển Việt Nam theo số liệu điều tra của Viện Hải dương học Nha Trang. Đồng thời, chương trình bày nguyên lý sấy phun chất lỏng giàu hoạt tính sinh học trong công nghệ thực phẩm.

Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu cá mập trắng (C. dussumieri) tại Khánh Hòa, quy trình sơ chế tách sụn, các đặc tính sinh hóa của 4 chế phẩm enzyme protease thương mại (Alcalase, Papain, Neutrase, Flavourzyme) và 3 chất mang sấy phun (Maltodextrin, Gum arabic, Saccharose).

Chương trình bày chi tiết các bước thực nghiệm của phương pháp Anson, phương pháp Lowry, phương pháp đo quang phổ DMMB, kỹ thuật sắc ký HPLC acid amin, quang phổ FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, quét nhiệt vi sai DSC, cùng sơ đồ bố trí thí nghiệm đơn biến và quy hoạch thực nghiệm RCCD.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

1. Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập bằng enzyme protease

  • Thành phần nguyên liệu sụn cá mập trắng: Độ ẩm 68,54 ± 1,12%; hàm lượng protein tổng số 18,22 ± 0,45%; hàm lượng chondroitin sulfate 8,42 ± 0,26%; lipid 0,86 ± 0,05%; khoáng tổng số 11,45 ± 0,38%.
  • Lựa chọn loại enzyme: Thí nghiệm so sánh 4 enzyme đơn lẻ và hỗn hợp cho thấy tổ hợp enzyme Alcalase phối hợp Papain (tỷ lệ 1:1) mang lại hiệu quả phân cắt proteoglycan cao nhất, đạt hàm lượng protein hòa tan, peptid, $N_{aa}$ và CS trong dịch thủy phân vượt trội so với các nghiệm thức dùng đơn lẻ từng loại enzyme, trong khi hàm lượng $N_{NH3}$ sinh ra ở mức thấp.
  • Xác định các thông số đơn yếu tố thích hợp:
    • Tỷ lệ phối trộn Alcalase/Papain: Tỷ lệ 60/40 (% w/w) cho hàm lượng CS và đạm hòa tan tối ưu nhất.
    • Nồng độ enzyme: 0,3% (tính trên khối lượng nguyên liệu sụn).
    • Tỷ lệ sụn/nước: 1/1 (w/v) đảm bảo độ nhớt dịch và khả năng tiếp xúc cơ chất - enzyme.
    • pH môi trường: pH tự nhiên của hỗn hợp phản ứng (pH = 6,8).
    • Nhiệt độ thủy phân: 50°C.
    • Thời gian thủy phân: Biên thời gian phù hợp được xác định trong khoảng 18–22 giờ.
  • Tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm (RCCD/RSM): Thiết lập mô hình hồi quy bậc 2 với 3 biến độc lập: Nồng độ enzyme ($X_1$), Nhiệt độ thủy phân ($X_2$) và Thời gian thủy phân ($X_3$) đối với hàm mục tiêu là Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate ($Y_1$). Mô hình tương thích cao với thực nghiệm (hệ số thiếu phù hợp Lack of fit có $p > 0,05$). Điểm tối ưu công nghệ xác định được gồm: nồng độ enzyme 0,3%, nhiệt độ 50°C, thời gian 20 giờ; hiệu suất thu hồi CS đạt 96,97%.

2. Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập và cấu trúc chondroitin sulfate

  • Chất lượng dịch thủy phân:
    • Chỉ tiêu cảm quan: Dịch có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng của đạm thủy phân, không có mùi lạ.
    • Thành phần dinh dưỡng và hóa học: Năng lượng đạt 20,42 Kcal/100 ml; hàm lượng chondroitin sulfate đạt 40,5 mg/ml; Nitơ tổng số đạt 7,46 g/l; khoáng tổng số đạt 3,02 g/l; Zn đạt 7,63 mg/l; Mg đạt 205 mg/l; Fe đạt 4,78 mg/l. Dịch chứa đầy đủ 18 loại acid amin (bao gồm cả các acid amin không thay thế).
    • Chỉ tiêu vi sinh vật: Tổng số vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, nấm men, nấm mốc và Salmonella đều nằm trong ngưỡng cho phép theo quy định an toàn vệ sinh thực phẩm của Bộ Y tế.
  • Xác định cấu trúc chondroitin sulfate:
    • Phổ FT-IR: Ghi nhận các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl (-OH) ở $3420\text{ cm}^{-1}$, nhóm carboxyl (-COO⁻) ở $1625\text{ cm}^{-1}$, liên kết amide (-NH-CO-) ở $1560\text{ cm}^{-1}$, và nhóm sulfate (-C-O-S-) tại vùng $1230–1250\text{ cm}^{-1}$, cùng các tín hiệu dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C-4 ($850\text{ cm}^{-1}$) và C-6 ($820\text{ cm}^{-1}$).
    • Phổ NMR 1D và 2D (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC): Phân tích độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) của các proton và carbon dị nhân khẳng định sản phẩm CS trong dịch thủy phân tồn tại dưới dạng hỗn hợp hai đồng phân cấu trúc: GlcA-GalNAc-4SO3⁻ (Chondroitin-4-sulfate) và GlcA-GalNAc-6SO3⁻ (Chondroitin-6-sulfate). Quá trình thủy phân bằng tổ hợp protease không làm đứt gãy mạch disaccharid cơ sở và bảo toàn nguyên vẹn cả hai vị trí gắn nhóm sulfate C-4 và C-6.

3. Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate

  • Khảo sát đơn yếu tố sấy phun:
    • Lựa chọn chất mang: Maltodextrin cho hiệu suất thu hồi bột và khả năng bảo toàn CS cao hơn đáng kể so với Gum arabic và Saccharose.
    • Tỷ lệ maltodextrin: 12% (w/v).
    • Nhiệt độ không khí buồng sấy: 80°C.
    • Tốc độ bơm nhập liệu: 12 ml/phút.
    • Áp suất buồng sấy: 2,5 bar.
  • Tối ưu hóa quá trình sấy phun bằng RCCD: Mô hình hóa mối quan hệ giữa Nhiệt độ buồng sấy ($X_4$), Tỷ lệ chất mang maltodextrin ($X_5$) và Tốc độ nhập liệu ($X_6$) đến Hiệu suất thu hồi CS ($Y_2$). Giá trị tối ưu tìm được trùng khớp với thực nghiệm, mang lại hiệu suất thu hồi CS đạt 87,81%.
  • Đặc tính chất lượng của sản phẩm bột đạm:
    • Hóa học: Hàm lượng Chondroitin sulfate đạt 203 mg/g; Nitơ tổng số đạt 5,04 g/100g; Tro tổng số đạt 3,95 g/100g; Độ ẩm đạt 4,27%.
    • Tính chất nhiệt (DSC): Giản đồ phân tích nhiệt quét vi sai cho thấy mẫu bột có độ ổn định nhiệt tốt trong khoảng nhiệt độ sử dụng và bảo quản thông thường.
    • Chỉ tiêu vi sinh vật: Đạt đầy đủ các tiêu chuẩn vi sinh vật dùng cho chế phẩm thực phẩm chức năng theo quy chuẩn kỹ thuật của Bộ Y tế.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

Văn bản luận án tổng kết 4 đóng góp mới chính:

  1. Xác định các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân sụn cá mập trắng:
    • Chế phẩm enzyme: Tổ hợp Alcalase : Papain theo tỷ lệ phối trộn 60/40 (% w/w).
    • Nồng độ hỗn hợp enzyme: 0,3% (so với khối lượng sụn).
    • Tỷ lệ nguyên liệu sụn/nước: 1/1 (w/v).
    • Điều kiện môi trường: pH tự nhiên 6,8; nhiệt độ thủy phân 50°C; thời gian thủy phân 20 giờ.
    • Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate đạt 96,97%.
    • Dịch thủy phân đạt giá trị năng lượng 20,42 Kcal/100 ml, hàm lượng CS 40,5 mg/ml, Nitơ tổng số 7,46 g/l, khoáng tổng số 3,02 g/l (Zn: 7,63 mg/l; Mg: 205 mg/l; Fe: 4,78 mg/l), chứa 18 loại acid amin và đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.
  2. Xác định bản chất cấu trúc hóa học của chondroitin sulfate sau thủy phân:
    • Chứng minh quá trình thủy phân bằng enzyme protease bảo toàn nguyên vẹn cả hai gốc sulfate ở vị trí carbon C-4 và C-6.
    • Xác định sản phẩm là hỗn hợp gồm 2 đồng phân hoạt tính sinh học: $\text{GlcA-GalNAc-4SO}_3^-$ và $\text{GlcA-GalNAc-6SO}_3^-$.
  3. Xác định các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình sấy phun tạo bột đạm:
    • Chất mang: Maltodextrin với tỷ lệ bổ sung 12% (w/v).
    • Nhiệt độ buồng sấy: 80°C.
    • Tốc độ dòng nhập liệu: 12 ml/phút.
    • Áp suất buồng sấy: 2,5 bar.
    • Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate đạt 87,81%.
    • Bột đạm thành phẩm có hàm lượng CS 203 mg/g, Nitơ tổng số 5,04 g/100g, tro tổng số 3,95 g/100g, độ ẩm 4,27%, đạt tiêu chuẩn vi sinh vật thực phẩm của Bộ Y tế.
  4. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình công nghệ ở quy mô phòng thí nghiệm:
    • Đề xuất quy trình công nghệ khép kín từ khâu xử lý sụn cá mập tươi, thủy phân có kiểm soát bằng tổ hợp enzyme Alcalase - Papain đến sấy phun tạo bột đạm hòa tan chứa CS đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm, định hướng ứng dụng trong thực phẩm chức năng hỗ trợ xương khớp.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề xuất ứng dụng quy trình công nghệ đã thiết lập để tận dụng nguồn phụ phẩm sụn cá mập tại các cơ sở chế biến thủy sản ven biển, thay thế phương pháp phơi khô thủ công bán thô.
  • Kiến nghị sử dụng sản phẩm bột đạm thủy phân chứa CS làm nguyên liệu trung gian để phối chế các dòng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe dưới dạng bột hòa tan hoặc viên nén, viên nang.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các kết quả thực nghiệm và quy trình công nghệ mới được khảo sát và tối ưu hóa ở quy mô phòng thí nghiệm với mẻ nguyên liệu 2 kg/lần.
  • Phạm vi thu thập mẫu sụn cá mập trắng tập trung tại một vùng địa lý (cảng cá Vĩnh Lương, tỉnh Khánh Hòa).
  • Luận án chưa khảo sát sự biến đổi chất lượng và thời hạn sử dụng của sản phẩm bột đạm trong điều kiện bảo quản dài hạn với các loại bao bì thương mại khác nhau.
  • Chưa tiến hành thử nghiệm lâm sàng hoặc thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm để đánh giá cụ thể mức độ sinh khả dụng và hiệu quả phục hồi sụn khớp của sản phẩm bột đạm hoàn chỉnh.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Triển khai thử nghiệm quy trình sản xuất ở quy mô bán công nghiệp (pilot) để hoàn thiện các thông số thiết bị và tính toán hiệu quả kinh tế - kỹ thuật.
  • Nghiên cứu độ ổn định, biến tính hóa lý và hạn sử dụng của bột đạm trong các điều kiện đóng gói, nhiệt độ và độ ẩm môi trường khác nhau.
  • Thực hiện các đánh giá tiền lâm sàng (in vitro và in vivo) về hoạt tính kháng viêm, khả năng kích thích tái tạo dịch khớp và phục hồi mô sụn của chế phẩm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị ứng dụng và học thuật đối với các đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản, Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học và Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Có thể tham khảo phương pháp tiếp cận quy hoạch thực nghiệm trực tâm xoay (RCCD), kỹ thuật kết hợp đa enzyme (Alcalase và Papain) để phân cắt chọn lọc phức hợp proteoglycan, và kỹ thuật tối ưu hóa sấy phun cho các dung dịch chứa polysaccharid nhạy cảm nhiệt.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Tham khảo bộ dữ liệu quang phổ hồng ngoại (FT-IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) trong việc định danh và xác định vị trí sulfate hóa của các phân đoạn glycosaminoglycan tự nhiên.
  • Doanh nghiệp và nhà sản xuất thực phẩm chức năng: Tham khảo sơ đồ công nghệ sản xuất bột đạm giàu chondroitin sulfate từ phụ phẩm sụn cá tươi, làm cơ sở chuyển giao công nghệ, đa dạng hóa sản phẩm chế biến giá trị gia tăng từ nguồn lợi thủy sản biển Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lại phối hợp hai enzyme Alcalase và Papain thay vì sử dụng enzyme đơn lẻ?

Trả lời: Alcalase là một serine endopeptidase có khả năng phân cắt mạnh các liên kết peptid nội mạch protein mô liên kết, trong khi Papain là một cysteine protease có phổ tác dụng rộng và hoạt tính bổ trợ cắt các liên kết đặc thù tại vị trí gần gốc liên kết proteoglycan. Việc phối hợp Alcalase và Papain theo tỷ lệ 60/40 (% w/w) tạo ra hiệu ứng cộng hưởng, giúp thủy phân triệt để hơn phức hợp proteoglycan trong sụn cá mập tươi, giải phóng tối đa chondroitin sulfate và đạm hòa tan với hàm lượng sinh amoniac ($N_{NH3}$) thấp.

2. Các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân sụn cá mập trắng là gì và hiệu suất đạt được bao nhiêu?

Trả lời: Các thông số tối ưu gồm: tổ hợp enzyme Alcalase : Papain tỷ lệ 60/40, nồng độ hỗn hợp 0,3% (w/w), tỷ lệ sụn/nước là 1/1 (w/v), pH tự nhiên 6,8, nhiệt độ thủy phân 50°C, thời gian thủy phân 20 giờ. Ở điều kiện này, hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate đạt 96,97%.

3. Cấu trúc chondroitin sulfate trong dịch thủy phân có bị biến đổi hay mất gốc sulfate không?

Trả lời: Kết quả phân tích phổ FT-IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (NMR: 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) khẳng định quá trình thủy phân bằng enzyme protease hoàn toàn bảo toàn cấu trúc mạch, giữ nguyên cả hai nhóm sulfate ở vị trí carbon C-4 và C-6. Sản phẩm tồn tại dưới dạng hỗn hợp hai đồng phân sinh học là GlcA-GalNAc-4SO3⁻ (Chondroitin-4-sulfate) và GlcA-GalNAc-6SO3⁻ (Chondroitin-6-sulfate).

4. Chế độ công nghệ tối ưu của quá trình sấy phun và chất lượng bột đạm thành phẩm như thế nào?

Trả lời: Quá trình sấy phun tối ưu sử dụng 12% chất mang maltodextrin, nhiệt độ buồng sấy 80°C, tốc độ nhập liệu 12 ml/phút, áp suất buồng sấy 2,5 bar, đạt hiệu suất thu hồi CS là 87,81%. Bột đạm thu được có hàm lượng Chondroitin sulfate đạt 203 mg/g, Nitơ tổng số đạt 5,04 g/100g, độ ẩm 4,27%, tro tổng số 3,95 g/100g và đạt các tiêu chuẩn vi sinh an toàn thực phẩm.

5. Dịch thủy phân sụn cá mập sau tối ưu hóa chứa các thành phần dinh dưỡng và khoáng chất nào?

Trả lời: Dịch thủy phân đạt năng lượng dinh dưỡng 20,42 Kcal/100 ml, hàm lượng CS 40,5 mg/ml, Nitơ tổng số 7,46 g/l, khoáng tổng số 3,02 g/l, cùng các vi chất kim loại gồm Kẽm (Zn: 7,63 mg/l), Magie (Mg: 205 mg/l), Sắt (Fe: 4,78 mg/l) và chứa 18 loại acid amin cần thiết.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đinh Hữu Đông đã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ phụ phẩm sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) tươi ở quy mô phòng thí nghiệm bằng phương pháp enzyme protease kết hợp kỹ thuật sấy phun. Nghiên cứu đã xác lập các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân bằng tổ hợp Alcalase - Papain (hiệu suất thu hồi CS đạt 96,97%) và quá trình sấy phun với chất mang maltodextrin 12% ở 80°C (hiệu suất thu hồi CS đạt 87,81%). Các kết quả phân tích quang phổ và cộng hưởng từ hạt nhân khẳng định sản phẩm bảo toàn nguyên vẹn hai đồng phân cấu trúc sulfate hóa tại vị trí C-4 và C-6, đồng thời bột đạm thành phẩm đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm, cung cấp cơ sở khoa học và công nghệ phục vụ định hướng phát triển thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị thoái hóa xương khớp.