Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Acid oxalic ($C_2H_2O_4$, khối lượng mol $90{,}035\text{ g/mol}$) là một acid hữu cơ tương đối mạnh ($pK_{a1} = 1{,}27; pK_{a2} = 4{,}27$). Trong đời sống và sản xuất công nghiệp, hợp chất này thường được sử dụng vào mục đích tẩy trắng vải sợi, làm sạch bề mặt gỗ, tẩy gỉ sét kim loại hoặc dùng trong nghề nuôi ong để diệt trừ ký sinh trùng. Tuy nhiên, đối với sức khỏe con người, acid oxalic là hóa chất có độc tính được hệ thống GHS phân loại ở mức nguy hiểm. Khi tiếp xúc trực tiếp qua da và mắt, acid oxalic gây bỏng rát, sưng tấy và có thể dẫn đến viêm loét giác mạc hoặc mù lòa; khi xâm nhập qua đường hô hấp, hóa chất này gây ho khan, khó thở và phù nề thanh quản. Khi hấp thu vào cơ thể, acid oxalic kết hợp với ion calcium trong máu tạo thành muối calcium oxalate ($CaC_2O_4$) khó tan, lắng đọng tại thận và các cơ quan nội tạng, là tác nhân hàng đầu hình thành sỏi thận, sỏi tiết niệu, gan mật và tụy. Ở liều lượng cao ($4 - 5\text{ g}$), acid oxalic và các muối oxalate có thể gây ngộ độc cấp tính dẫn đến tử vong; liều độc trung bình ($LD_{50}$) qua đường tiêu hóa của acid oxalic nguyên chất được ước tính khoảng $378\text{ mg/kg}$ thể trọng (tương đương khoảng $22{,}68\text{ g}$ đối với người có thể trọng $60\text{ kg}$).
Bối cảnh thực tiễn được tác giả đề cập bắt nguồn từ sự kiện vào tháng 12/2013, khi Hội Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh công bố kết quả kiểm nghiệm cho thấy hơn 20% mẫu thực phẩm tươi sống và 100% mẫu mì ăn liền khảo sát trên thị trường có chứa acid oxalic với hàm lượng dao động từ $10$ đến $3000\text{ ppm}$, dấy lên lo ngại sâu sắc trong cộng đồng người tiêu dùng. Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu định lượng acid oxalic trên các đối tượng thực phẩm và nông sản, nhưng tại Việt Nam thời điểm năm 2015, các công trình khảo sát quy trình phân tích và đánh giá sự hiện diện của acid oxalic trong mì ăn liền còn rất hạn chế.
Từ yêu cầu thực tiễn trên, khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể như sau:
- Khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện đo sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) để định lượng acid oxalic (cột phân tích, thành phần pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện, thể tích vòng mẫu).
- Tối ưu hóa quy trình xử lý và tách chiết mẫu mì ăn liền (nồng độ dung dịch acid thủy phân, thể tích acid và thời gian lắc chiết).
- Xây dựng và thẩm định các thông số giá trị của phương pháp phân tích: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng nồng độ tuyến tính và độ lặp lại của hệ thống sắc ký ($RSD%$).
- Ứng dụng quy trình đã hoàn thiện để định lượng hàm lượng acid oxalic trong 5 mẫu mì ăn liền thương mại đang lưu hành phổ biến trên thị trường.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất acid oxalic và 5 mẫu mì ăn liền thương phẩm gồm: Mì Hảo Hảo tôm chua cay (Công ty CP Acecook Việt Nam, HSD: 20/8/2015), Mì Gấu Đỏ tôm chua cay (Công ty CP Thực phẩm Á Châu, HSD: 6/11/2015), Mì Gấu Đỏ chay rau nấm (Công ty CP Thực phẩm Á Châu, HSD: 7/10/2015), Mì Reeva 3 Miền tôm chua cay (Công ty CP UNIBEN, HSD: 6/11/2015), Mì chay Wai Wai (Thai Preserved Food Factory, Thái Lan, HSD: 24/3/2016).
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh trong năm 2015.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận xây dựng nội dung dựa trên nền tảng lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) và hóa phân tích acid-base:
- Cơ sở lý thuyết về sắc ký: Quá trình phân tách chất tan dựa trên sự phân bố liên tục giữa pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực, được mô tả qua các đại lượng: thời gian lưu ($t_R$), thời gian lưu thực ($t'_R$), thời gian chết ($t_0$), hệ số phân bố ($K_i$), hệ số dung lượng ($k'_i$), hệ số chọn lọc/hệ số tách ($\alpha$) và độ phân giải sắc ký ($R_s$).
- Vận dụng các nghiên cứu tiền nhiệm: Tác giả tổng hợp các công trình phân tích acid oxalic trước đó để định hướng phương pháp: quy trình phân tích acid oxalic trong cây đại hoàng của Bo Libert (1981) dùng cột pha đảo $C_8$, pha động $0{,}5%\text{ }KH_2PO_4$ và $0{,}005\text{M}$ tetrabutyl ammonium hydrogensulfate ở $pH=2$, detector UV-VIS $220\text{ nm}$; nghiên cứu của David H. Picha (1985) trên khoai tây dùng sắc ký trao đổi cation với pha động $H_2SO_4\text{ }0{,}0008\text{N}$ tại bước sóng $214\text{ nm}$; nghiên cứu của W. Jeffrey Hurst và cộng sự (1986) trên hạt cacao dùng cột $C_{18}$ và detector điện hóa $1{,}25\text{V}$; phương pháp điện di mao quản của Michael Trevakis (1996); hệ thống ghép 2 cột loại trừ ion của Maria Jesus Nozal (2002) phân tích mật ong với pha động $H_3PO_4\text{ }1%$; nghiên cứu của Miluscia Arnetoli (2008) trên loài Silene paradoxa dùng cột RP-18 và đệm $KH_2PO_4/H_3PO_4$ $pH=2{,}5$; nghiên cứu của Violeta Nour (2010) phân tích nước ép cam bằng cột RP-HPLC với hệ đệm phosphat $pH=2{,}8$ tại bước sóng $214\text{ nm}$.
Trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu:
- Thiết bị máy móc: Hệ thống HPLC Perkin Elmer Series 200 (gồm Bơm Series 200 Pump, Đầu dò UV/VIS Series 200 Detector, Bộ khử khí dung môi Series 200 Vacuum Degasser, phần mềm điều khiển và xử lý tín hiệu TotalChrom Workstation version 6.3); Cột sắc ký phân tích pha đảo Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 ($250 \times 4{,}6\text{ mm}$, kích thước hạt $5\text{ }\mu\text{m}$); Van tiêm mẫu Rheodyne injector $20\text{ }\mu\text{L}$ (USA); Syringe tiêm mẫu Hamilton $50\text{ }\mu\text{L}$; Máy quang phổ UV/VIS Lambda 25 Perkin Elmer; Máy lắc tròn IKA KS130 Basic (Đức); Bể rung siêu âm Elmasonic (Đức); Cân phân tích Precisa; Màng lọc nylon $0{,}45\text{ }\mu\text{m}$ Whatman (Nhật Bản).
- Hóa chất và dung môi: Chất chuẩn Acid oxalic $0{,}05\text{ mol/L}$ ($0{,}1\text{ N}$) đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck KGaA, Đức); Dung môi Acetonitrile (ACN) độ tinh khiết $\ge 99{,}80%$ dùng cho HPLC (Merck); Methanol ($\ge 99{,}80%$, Merck); Acid phosphoric $H_3PO_4\text{ }85{,}00%$ (Merck); Acid hydrochloric $HCl\text{ }37{,}00%$ (Merck); Nước cất siêu sạch điều chế qua hệ thống lọc chuyên dụng.
Phương pháp xử lý số liệu:
Dữ liệu đo đạc lặp lại được xử lý bằng các công thức toán thống kê:
- Giá trị trung bình mẫu: $\bar{X} = \frac{1}{n}\sum_{i=1}^n X_i$
- Độ lệch chuẩn: $SD = \sqrt{\frac{\sum_{i=1}^n (X_i - \bar{X})^2}{n - 1}}$
- Độ lệch chuẩn tương đối: $RSD(%) = \frac{SD}{\bar{X}} \times 100$
- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu diễn mối liên hệ giữa nồng độ ($C$, ppm) và tổng diện tích peak sắc ký ($S_{peak}$) qua phần mềm Microsoft Excel 2003.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các tài liệu lý thuyết và nghiên cứu liên quan đến acid oxalic và phương pháp sắc ký:
- Trình bày chi tiết tính chất vật lý và hóa học của acid oxalic ($C_2H_2O_4$), trạng thái tinh thể màu trắng, khối lượng mol $90{,}035\text{ g/mol}$, tỷ trọng $1{,}9\text{ g/cm}^3$, nhiệt độ phân hủy $189{,}5^\circ\text{C}$, độ tan trong nước đạt $14{,}2\text{ g/100 mL}$; cơ chế điện ly hai nấc trong dung dịch nước tạo thành các dạng tiểu phân ion $HC_2O_4^-$ và $C_2O_4^{2-}$.
- Cảnh báo độc tính học của acid oxalic theo tiêu chuẩn GHS, phân tích tác hại tạo phức kết tủa calcium oxalate gây tổn thương thận và đường tiết niệu, thống kê mức liều ngộ độc $LD_{50} = 378\text{ mg/kg}$.
- Phân loại hàm lượng oxalate tự nhiên trong thực phẩm thành 4 nhóm: nhóm rất cao (rau dền, khế, củ cải đường, rau bina, hạnh nhân, cám), nhóm cao (khoai lang, đậu phộng, măng, hạt điều), nhóm trung bình (cà rốt, hạt dẻ, sốt cà chua) và nhóm thấp (dưa chuột, bắp, bông cải xanh, cơm dừa).
- Giới thiệu các phương pháp phân tích cổ điển (chuẩn độ permanganate $KMnO_4$, tạo màu quang phổ với 2,7-dihydroxynaphthalene-3,6-disulfonic acid) và các công trình phân tích sắc ký hiện đại trên thế giới.
- Trình bày nguyên lý cấu tạo, cơ chế rửa giải và các thông số định tính, định lượng trên hệ thống máy HPLC.
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 2 trình bày chi tiết kế hoạch bố trí thí nghiệm, thông số hóa chất, danh mục thiết bị và các bước thực hành:
- Thiết lập quy trình khảo sát điều kiện vận hành HPLC: thử nghiệm các hệ pha động gồm 100% ACN, ACN : nước cất ($95:5$, $v/v$), ACN : dung dịch đệm phosphat $pH=2{,}7$ ($95:5$, $v/v$); khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid $HCl$ thêm vào dung dịch chuẩn ($0\text{M}, 0{,}1\text{M}, 0{,}5\text{M}, 1\text{M}$); khảo sát tốc độ dòng pha động từ $0{,}5$ đến $1{,}0\text{ mL/phút}$.
- Thiết lập quy trình thẩm định phương pháp: xác định LOD thông qua mẫu pha loãng nồng độ thấp có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền $S/N = 3$, tính toán LOQ theo công thức $LOQ = \frac{10}{3} LOD$; khảo sát khoảng tuyến tính qua dãy 11 dung dịch chuẩn từ $0{,}45$ đến $90\text{ ppm}$; đánh giá độ lặp lại qua 7 lần tiêm mẫu lặp cùng một dung dịch chuẩn acid oxalic $4{,}5\text{ ppm}$.
- Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu mì ăn liền: khảo sát nồng độ dung dịch $HCl$ chiết mẫu ($3\text{M}, 4\text{M}, 5\text{M}$), thể tích dung dịch $HCl\text{ }3\text{M}$ ($5\text{ mL}, 10\text{ mL}, 15\text{ mL}$) và thời gian lắc phá mẫu trên máy lắc ($10, 20, 30\text{ phút}$).
- Quy chuẩn hóa thao tác chuẩn bị mẫu mì thương phẩm: nghiền mịn mẫu bằng cối sứ, cân chính xác $0{,}500\text{ g}$, hòa tách với $10\text{ mL }HCl\text{ }3\text{M}$, lắc 20 phút ở tốc độ 240 vòng/phút, lọc dịch và rửa cặn với $10\text{ mL}$ nước siêu sạch, lọc màng $0{,}45\text{ }\mu\text{m}$, định mức dịch lọc thành $50\text{ mL}$, sau đó hút $5\text{ mL}$ pha loãng vào bình định mức $25\text{ mL}$ bằng nước siêu sạch trước khi tiêm vào máy HPLC.
Chương 3: Kết quả - Thảo luận
Chương 3 diễn giải chi tiết toàn bộ các số liệu và sắc ký đồ thu được từ thực nghiệm:
- Tối ưu hóa pha động: Trên sắc ký đồ của cả 3 hệ pha động khảo sát, acid oxalic đều xuất hiện dưới 2 peak sắc ký liền kề do tồn tại cân bằng điện ly giữa dạng phân tử $H_2C_2O_4$ và dạng ion $HC_2O_4^-$. Với pha động 100% ACN, sắc ký đồ cho hình dạng peak sắc nét, cân đối, độ rộng đáy peak nhỏ nhất so với các hệ có chứa nước hoặc dung dịch đệm. Vì vậy, 100% ACN được chọn làm pha động tối ưu và diện tích định lượng được tính bằng tổng diện tích của cả hai peak ($t_R$ từ $3{,}4$ đến $3{,}72\text{ phút}$).
- Khảo sát nồng độ $HCl$ trong mẫu chuẩn: Khi tăng nồng độ $HCl$ lên $1\text{M}$, hiện tượng tách peak giảm nhưng chân peak bị biến dạng, không nhọn. Trong khoảng $0\text{M}$ đến $0{,}5\text{M}$, hình dạng peak chính sắc nét, ổn định. Để bảo vệ cột sắc ký khỏi nguy cơ hư hại do môi trường acid quá cao, dung dịch chuẩn đo đường chuẩn được pha trong nền không chứa $HCl$.
- Khảo sát tốc độ dòng: Tốc độ dòng từ $0{,}5$ đến $0{,}9\text{ mL/phút}$ cho hình dạng peak cân đối; khi tăng lên $1{,}0\text{ mL/phút}$, peak có hiện tượng bất đối xứng. Tác giả lựa chọn tốc độ dòng tối ưu là $0{,}7\text{ mL/phút}$ nhằm cân đối giữa thời gian phân tích (dưới 5 phút), độ sắc nét của peak và mức tiêu hao dung môi.
- Thẩm định phương pháp định lượng:
- Giới hạn phát hiện $LOD = 0{,}108\text{ ppm}$ ($S/N = 3$).
- Giới hạn định lượng $LOQ = 0{,}36\text{ ppm}$.
- Khoảng tuyến tính được xác lập từ $0{,}45\text{ ppm}$ đến $90\text{ ppm}$ với phương trình hồi quy $y = 84544x + 951157$, hệ số tương quan $r = 0{,}999$ ($R^2 = 0{,}9981$).
- Độ lặp lại của thời gian lưu qua 7 lần tiêm mẫu chuẩn $4{,}5\text{ ppm}$: Peak 1 có $t_{R1} = 3{,}44 \pm 0{,}018\text{ phút}$ ($RSD = 0{,}58%$); Peak 2 có $t_{R2} = 3{,}69 \pm 0{,}029\text{ phút}$ ($RSD = 0{,}84%$).
- Độ lặp lại của tổng diện tích peak: $S_{peak} = 1389442{,}48 \pm 13359{,}75$ ($RSD = 0{,}96%$).
- Tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu mì ăn liền:
- Khảo sát nồng độ $HCl$: Với $HCl\text{ }4\text{M}$ và $5\text{M}$, dung dịch sau thủy phân bị nhớt do phản ứng phân cắt tinh bột, không thể lọc qua màng lọc $0{,}45\text{ }\mu\text{m}$. Với $HCl\text{ }3\text{M}$, dung dịch lọc tốt qua màng lọc, thu được diện tích peak trung bình $1243683{,}96$. Nồng độ $HCl\text{ }3\text{M}$ được chọn là tối ưu.
- Khảo sát thể tích $HCl\text{ }3\text{M}$: Thể tích $10\text{ mL}$ cho diện tích peak lớn nhất ($1243683{,}96$) và độ lặp lại cao nhất ($RSD = 1{,}68%$) so với mức $5\text{ mL}$ (diện tích peak $746216{,}14$, $RSD = 4{,}23%$) và mức $15\text{ mL}$ (diện tích peak $765940{,}06$, $RSD = 4{,}78%$).
- Khảo sát thời gian lắc: Lắc 20 phút cho diện tích peak tối ưu ($1243683{,}96$, $RSD = 1{,}68%$), cao hơn so với 10 phút (diện tích peak $1005842{,}74$, $RSD = 3{,}12%$) và 30 phút (diện tích peak $1117441{,}11$, $RSD = 3{,}45%$).
- Kết quả định lượng mẫu thực tế: Ứng dụng quy trình đã hoàn thiện phân tích lặp lại 3 lần cho 5 mẫu mì ăn liền thương phẩm, ghi nhận nồng độ acid oxalic trong dịch đo từ $3{,}46$ đến $7{,}21\text{ ppm}$, tương ứng hàm lượng quy đổi trong vắt mì từ $680$ đến $3560\text{ mg/kg}$.
Chương 4: Kết luận - Đề nghị
Chương 4 đúc kết 4 phát hiện then chốt về bộ thông số tối ưu của hệ thống sắc ký, quy trình chuẩn bị mẫu, các giá trị thẩm định phương pháp ($LOD, LOQ$, khoảng tuyến tính, $RSD%$) và bảng tổng hợp kết quả phân tích 5 mẫu mì; đồng thời nêu đề nghị mở rộng nghiên cứu sang các nền mẫu thực phẩm khác.
Kết quả và đóng góp
Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình phân tích acid oxalic bằng phương pháp RP-HPLC với các thông số vận hành và chỉ tiêu kỹ thuật hoàn chỉnh:
| Thông số phân tích |
Giá trị tối ưu / Kết quả thực nghiệm |
| Cột sắc ký |
Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 ($250 \times 4{,}6\text{ mm}, 5\text{ }\mu\text{m}$) |
| Pha động |
100% Acetonitrile (ACN) |
| Tốc độ dòng pha động |
$0{,}7\text{ mL/phút}$ |
| Đầu dò quang học (Detector) |
UV-VIS tại bước sóng $\lambda = 220\text{ nm}$ |
| Thể tích vòng tiêm mẫu |
$20\text{ }\mu\text{L}$ |
| Thời gian phân tích mỗi mẫu |
$0 - 5\text{ phút}$ |
| Giới hạn phát hiện (LOD) |
$0{,}108\text{ ppm}$ |
| Giới hạn định lượng (LOQ) |
$0{,}36\text{ ppm}$ |
| Khoảng tuyến tính |
$0{,}45 - 90\text{ ppm}$ |
| Phương trình hồi quy |
$y = 84544x + 951157$ ($r = 0{,}999; R^2 = 0{,}9981$) |
| Độ lặp lại thời gian lưu ($RSD%$) |
Peak 1: $0{,}58%$; Peak 2: $0{,}84%$ ($n=7$) |
| Độ lặp lại diện tích peak ($RSD%$) |
$0{,}96%$ ($n=7$) |
Kết quả định lượng hàm lượng acid oxalic trong 5 loại mì ăn liền khảo sát được tổng hợp chi tiết trong bảng dưới đây:
| Mã mẫu |
Tên sản phẩm thương mại |
Nhà sản xuất |
Diện tích peak trung bình ($S_{peak}$) |
Nồng độ trong dịch đo ($C$, ppm) |
Hàm lượng trong $0{,}5\text{ g}$ mẫu ($\text{mg}$) |
Hàm lượng trong mẫu mì ($\text{mg/kg}$) |
Hàm lượng trong 1 gói mì ($\text{mg}$) |
| HH |
Hảo Hảo tôm chua cay ($75\text{ g}$) |
Acecook Việt Nam |
$1474236{,}16$ |
$6{,}19$ |
$0{,}77 \pm 0{,}035$ |
$1540 \pm 70$ |
$115{,}5 \pm 5{,}25$ |
| GT |
Gấu Đỏ tôm chua cay ($63\text{ g}$) |
Thực phẩm Á Châu |
$1300018{,}91$ |
$4{,}13$ |
$0{,}52 \pm 0{,}047$ |
$1040 \pm 94$ |
$65{,}52 \pm 5{,}92$ |
| GC |
Gấu Đỏ chay rau nấm ($65\text{ g}$) |
Thực phẩm Á Châu |
$1312128{,}74$ |
$4{,}15$ |
$0{,}52 \pm 0{,}033$ |
$1040 \pm 66$ |
$67{,}6 \pm 4{,}29$ |
| BM |
Reeva 3 Miền tôm chua cay ($65\text{ g}$) |
UNIBEN |
$1560486{,}39$ |
$7{,}21$ |
$0{,}89 \pm 0{,}031$ |
$1780 \pm 62$ |
$115{,}7 \pm 4{,}03$ |
| WW |
Mì chay Wai Wai ($60\text{ g}$) |
Thai Preserved Food |
$1243683{,}96$ |
$3{,}46$ |
$0{,}34 \pm 0{,}028$ |
$680 \pm 56$ |
$40{,}8 \pm 3{,}36$ |
Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Cung cấp quy trình chiết xuất và phân tích định lượng acid oxalic đơn giản, sử dụng pha động đơn thành phần (100% ACN) giúp rút ngắn thời gian rửa giải xuống dưới 5 phút, không cần phối trộn hệ đệm phức tạp.
- Đưa ra dẫn liệu thực nghiệm về hàm lượng acid oxalic trong một số sản phẩm mì gói lưu hành tại Việt Nam (dao động từ $680$ đến $3560\text{ mg/kg}$, tương ứng từ $40{,}8$ đến $115{,}7\text{ mg}$ acid oxalic trên mỗi gói mì).
- Tác giả so sánh hàm lượng acid oxalic trong một gói mì với ngưỡng liều độc cấp tính $LD_{50}$ ($22{,}68\text{ g}$ cho người $60\text{ kg}$) và kết luận lượng acid oxalic trong một khẩu phần đơn lẻ vẫn nằm dưới ngưỡng gây độc cấp. Tuy nhiên, mức tích lũy này là đáng lưu ý nếu người tiêu dùng sử dụng mì ăn liền thường xuyên với số lượng lớn trong thời gian dài, đặc biệt là nhóm đối tượng có tiền sử sỏi thận hoặc trẻ nhỏ.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Dựa trên nội dung và phạm vi nghiên cứu được trình bày trong văn bản:
- Hạn chế về quy chuẩn so sánh: Thời điểm thực hiện đề tài, Việt Nam chưa ban hành văn bản quy phạm pháp luật hay tiêu chuẩn kỹ thuật quy định mức giới hạn tối đa cho phép của acid oxalic trong lương thực, thực phẩm do hợp chất này tồn tại tự nhiên trong thực vật. Vì vậy, nghiên cứu chưa thể đối chiếu hàm lượng phát hiện với ngưỡng giới hạn pháp lý chính thức.
- Hạn chế về phổ mẫu khảo sát: Đề tài chỉ mới tiến hành khảo sát trên 5 mẫu mì ăn liền thương mại lấy tại thời điểm năm 2015, chưa khảo sát trên diện rộng các lô sản xuất khác nhau hoặc các chủng loại mì gói khác.
- Hiện tượng tách peak của chất phân tích: Do acid oxalic có hai nấc phân ly nên trên sắc ký đồ luôn xuất hiện hai peak phân tách liền kề ($H_2C_2O_4$ và $HC_2O_4^-$), đòi hỏi phải tính tổng diện tích của cả hai peak trong khoảng thời gian lưu từ $3{,}4$ đến $3{,}72\text{ phút}$ để định lượng.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng áp dụng quy trình phân tích đã tối ưu để kiểm nghiệm hàm lượng acid oxalic trên các nền mẫu thực phẩm, nông sản và rau củ quả khác trên thị trường.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo cho các đối tượng và mục đích học thuật cụ thể:
- Sinh viên và học viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Hóa Dược và Kiểm nghiệm Thực phẩm: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thẩm định phương pháp phân tích sắc ký (xác định LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, đánh giá độ lặp lại $RSD%$) và kỹ thuật tối ưu hóa các thông số vận hành HPLC.
- Cán bộ nghiên cứu tại các phòng kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm: Tham khảo quy trình xử lý và phá mẫu nền giàu tinh bột bằng dung dịch $HCl\text{ }3\text{M}$, kỹ thuật loại bỏ cặn và chất béo gây tắc cột, cùng phương án định lượng acid oxalic nhanh trong vòng 5 phút với pha động 100% ACN.
- Các đề tài nghiên cứu về độc chất học và an toàn thực phẩm: Dẫn liệu định lượng thực nghiệm trên 5 thương hiệu mì ăn liền là nguồn dữ liệu đối sánh hữu ích cho các nghiên cứu đánh giá mức độ phơi nhiễm acid oxalic trong khẩu phần ăn uống của người tiêu dùng.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao trên sắc ký đồ của acid oxalic lại xuất hiện 2 peak sắc ký liền kề nhau?
Do acid oxalic là một dicarboxylic acid có hai nấc phân ly trong dung môi ($pK_{a1} = 1{,}27; pK_{a2} = 4{,}27$). Dưới các điều kiện pha động khảo sát, chất tan không chuyển hóa hoàn toàn về một dạng cấu tử duy nhất mà tồn tại cân bằng giữa dạng phân tử $H_2C_2O_4$ và dạng ion $HC_2O_4^-$. Do đó, khi định lượng, tác giả phải cộng tổng diện tích của cả hai peak xuất hiện trong khoảng thời gian lưu từ $3{,}4$ đến $3{,}72\text{ phút}$.
2. Vì sao nồng độ $HCl$ được chọn để xử lý mẫu mì ăn liền là $3\text{M}$ mà không phải $4\text{M}$ hay $5\text{M}$?
Thực nghiệm cho thấy khi sử dụng $HCl$ có nồng độ $4\text{M}$ hoặc $5\text{M}$, dung dịch mẫu sau khi lắc sinh ra các phản ứng phân cắt tinh bột tạo độ nhớt cao, dẫn đến hiện tượng dung dịch không thể chảy qua màng lọc nylon $0{,}45\text{ }\mu\text{m}$. Nồng độ $HCl\text{ }3\text{M}$ vừa đủ để hòa tan và chuyển hóa hoàn toàn các muối oxalate khó tan thành dạng acid oxalic tự do, vừa đảm bảo dung dịch dễ dàng lọc trong suốt qua màng lọc $0{,}45\text{ }\mu\text{m}$ với diện tích peak thu được cao nhất ($1243683{,}96$).
3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết bị đối với acid oxalic trong nghiên cứu là bao nhiêu?
Giới hạn phát hiện (LOD) xác định được là $0{,}108\text{ ppm}$ (tại nồng độ này chiều cao tín hiệu peak gấp 3 lần chiều cao đường nền nhiễu, $S/N = 3$). Giới hạn định lượng (LOQ) được tính toán theo công thức $LOQ = \frac{10}{3} LOD$, đạt giá trị $0{,}36\text{ ppm}$.
4. Trong 5 mẫu mì ăn liền khảo sát, mẫu nào có hàm lượng acid oxalic cao nhất và thấp nhất?
Mẫu có hàm lượng acid oxalic cao nhất là Mì Reeva 3 Miền tôm chua cay (mã BM) với $1780 \pm 62\text{ mg/kg}$ ($115{,}7 \pm 4{,}03\text{ mg}$ trong một gói mì $65\text{ g}$), tiếp đến là Mì Hảo Hảo tôm chua cay (mã HH) với $1540 \pm 70\text{ mg/kg}$ ($115{,}5 \pm 5{,}25\text{ mg}$ trong một gói mì $75\text{ g}$). Mẫu có hàm lượng acid oxalic thấp nhất là Mì chay Wai Wai (mã WW) với $680 \pm 56\text{ mg/kg}$ ($40{,}8 \pm 3{,}36\text{ mg}$ trong một gói mì $60\text{ g}$).
5. Hàm lượng acid oxalic phát hiện trong các mẫu mì có vượt qua ngưỡng ngộ độc cấp tính ($LD_{50}$) hay không?
Hàm lượng acid oxalic chứa trong một gói mì đơn lẻ (từ $40{,}8\text{ mg}$ đến $115{,}7\text{ mg}$) thấp hơn nhiều so với liều gây ngộ độc cấp tính $LD_{50}$ (ước tính khoảng $22{,}68\text{ g}$ đối với người có thể trọng $60\text{ kg}$). Tuy nhiên, tác giả khuyến nghị những người có tiền sử bệnh lý sỏi thận, đường tiết niệu hoặc trẻ nhỏ cần hạn chế tiêu thụ lượng lớn các thực phẩm có chứa hàm lượng acid oxalic cao.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Phạm Phương Nam đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình xác định hàm lượng acid oxalic trong mì ăn liền bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) sử dụng đầu dò UV-VIS tại bước sóng $220\text{ nm}$ và pha động 100% Acetonitrile. Phương pháp đạt độ tin cậy cao với khoảng tuyến tính rộng ($0{,}45 - 90\text{ ppm}$, $r = 0{,}999$), giới hạn phát hiện thấp ($LOD = 0{,}108\text{ ppm}$, $LOQ = 0{,}36\text{ ppm}$) và độ lặp lại diện tích peak tốt ($RSD = 0{,}96%$). Kết quả phân tích thực tế trên 5 loại mì ăn liền thương phẩm cho thấy hàm lượng acid oxalic dao động trong khoảng từ $680$ đến $3560\text{ mg/kg}$, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng phục vụ công tác kiểm nghiệm và cảnh báo an toàn thực phẩm.
