Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng hbv rna huyết tương ở bệnh nhân viêm gan b mạn tính

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị.

• Tác giả: Triệu Thị Nguyệt
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV-RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về HBV
• 1.2. Đặc điểm phân loại HBV
• 1.3. Đặc điểm hình thái HBV
• 1.4. Cấu trúc hệ gen HBV
• 1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe
• 1.6. Chu trình nhân lên của HBV
• 1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV
• 1.8. Tổng quan về viêm gan B mạn tính
• 1.9. HBV và viêm gan B
• 1.10. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
• 1.11. Tình hình nghiên cứu HBV
• 1.12. Trên thế giới
• 1.13. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu, hóa chất
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Thu thập, bảo quản mẫu
• 2.7. Tách chiết acid nucleic
• 2.8. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương
• 2.9. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 2.9.1. Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược
• 2.9.2. Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược
• 2.9.3. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
• 2.9.4. Tối ưu thời gian luân nhiệt
• 2.9.5. Tối ưu nồng độ mồi
• 2.9.6. Tối ưu nồng độ probe
• 2.10. Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR
• 2.11. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 2.12. Phân tích, xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.2. Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh
• 3.3. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định
• 3.4. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện
• 3.5. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.6. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA
• 3.7. Tối ưu quy trình realtime RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.7.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc độ thay đổi nhiệt độ của phản ứng RT-qPCR
• 3.7.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe
• 3.7.3. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm
• 3.8. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 3.9. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR
• 3.10. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm
• 3.11. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.12. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.13. Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình định lượng HBV RNA huyết tương

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Viêm gan B mạn tính do virus HBV gây ra có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan. Việc xác định nồng độ HBV RNA trong huyết tương giúp theo dõi tình trạng bệnh và hiệu quả điều trị. Quy trình này không chỉ giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác mà còn hỗ trợ trong việc tiên lượng bệnh.

1.1. Định nghĩa và vai trò của HBV RNA trong viêm gan B

HBV RNA, hay RNA tiền gen, là một chỉ số quan trọng trong việc đánh giá tình trạng nhiễm virus HBV. Nồng độ HBV RNA trong huyết tương phản ánh mức độ hoạt động của virus và có thể giúp xác định hiệu quả của các phương pháp điều trị. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ HBV RNA cao có liên quan đến nguy cơ tiến triển bệnh và các biến chứng nghiêm trọng.

1.2. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Theo thống kê, khoảng 10% dân số Việt Nam bị nhiễm virus này. Điều này đặt ra thách thức lớn cho hệ thống y tế trong việc quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính. Việc nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương là cần thiết để cải thiện chất lượng điều trị và giảm thiểu biến chứng.

II. Thách thức trong việc định lượng HBV RNA huyết tương

Mặc dù quy trình định lượng HBV RNA huyết tương đã được phát triển, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc thực hiện. Các yếu tố như độ nhạy của phương pháp xét nghiệm, chất lượng mẫu và quy trình bảo quản đều ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Đặc biệt, việc tách chiết và bảo quản mẫu huyết tương là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét nghiệm

Độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp xét nghiệm định lượng HBV RNA là yếu tố quyết định đến khả năng phát hiện chính xác nồng độ virus trong huyết tương. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp RT-qPCR có độ nhạy cao, nhưng vẫn cần tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất trong điều kiện lâm sàng.

2.2. Ảnh hưởng của chất lượng mẫu đến kết quả xét nghiệm

Chất lượng mẫu huyết tương có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thời gian bảo quản, nhiệt độ và phương pháp tách chiết. Việc bảo quản mẫu không đúng cách có thể dẫn đến sự phân hủy của RNA, làm giảm độ chính xác của kết quả xét nghiệm. Do đó, quy trình thu thập và bảo quản mẫu cần được thực hiện nghiêm ngặt.

III. Phương pháp tối ưu hóa quy trình định lượng HBV RNA

Để đạt được kết quả chính xác trong việc định lượng HBV RNA, quy trình RT-qPCR cần được tối ưu hóa. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian và nồng độ mồi đều cần được điều chỉnh để đạt được hiệu suất tối ưu. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng có thể cải thiện độ nhạy và độ chính xác của phương pháp.

3.1. Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian phản ứng

Nhiệt độ và thời gian phản ứng là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng RT-qPCR. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và thời gian phiên mã ngược có thể làm tăng đáng kể độ nhạy của phương pháp. Các thử nghiệm đã được thực hiện để xác định điều kiện tối ưu cho từng bước trong quy trình.

3.2. Tối ưu hóa nồng độ mồi và probe

Nồng độ mồi và probe cũng đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng HBV RNA. Việc tối ưu hóa nồng độ này giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ mồi và probe tối ưu có thể cải thiện đáng kể kết quả xét nghiệm, từ đó hỗ trợ trong việc theo dõi điều trị.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình định lượng HBV RNA

Quy trình định lượng HBV RNA huyết tương không chỉ có giá trị trong việc theo dõi điều trị mà còn trong việc tiên lượng bệnh. Nồng độ HBV RNA có thể giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả của các phương pháp điều trị và điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc xác định nồng độ HBV RNA cũng có thể giúp phát hiện sớm các biến chứng của bệnh.

4.1. Theo dõi hiệu quả điều trị viêm gan B

Việc định lượng HBV RNA giúp theo dõi hiệu quả điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Nồng độ HBV RNA giảm sau điều trị cho thấy hiệu quả của phương pháp điều trị. Ngược lại, nếu nồng độ HBV RNA không giảm hoặc tăng trở lại, bác sĩ có thể cần điều chỉnh phác đồ điều trị.

4.2. Tiên lượng biến chứng của viêm gan B

Nồng độ HBV RNA cao có thể là dấu hiệu cảnh báo sớm về nguy cơ tiến triển bệnh và các biến chứng như xơ gan và ung thư gan. Việc theo dõi nồng độ HBV RNA định kỳ giúp phát hiện sớm các biến chứng, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính là một bước tiến quan trọng trong việc cải thiện chất lượng điều trị. Quy trình này không chỉ giúp theo dõi hiệu quả điều trị mà còn hỗ trợ trong việc phát hiện sớm các biến chứng. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của nó trong lâm sàng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong điều trị viêm gan B

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện kết quả điều trị viêm gan B. Việc xác định nồng độ HBV RNA giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác và kịp thời, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp định lượng HBV RNA mới với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Ngoài ra, việc nghiên cứu các dấu ấn sinh học khác cũng có thể mở ra hướng đi mới trong việc theo dõi và điều trị viêm gan B mạn tính.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm virus viêm gan B (HBV) là một trong những thách thức y tế công cộng nghiêm trọng nhất trên toàn cầu, với khoảng 248 triệu người đang sống chung với tình trạng nhiễm trùng mạn tính và hơn 600.000 trường hợp tử vong mỗi năm do biến chứng xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV dao động ở mức báo động từ 15% đến 21%, tương đương với hơn 10 triệu cá thể mang virus mạn tính. Mặc dù các liệu pháp kháng virus đường uống bằng các thuốc đồng đẳng nucleoside/nucleotide (NAs) như Entecavir và Tenofovir có khả năng ức chế mạnh nồng độ HBV DNA huyết thanh xuống dưới 20 IU/mL, các thuốc này hoàn toàn không thể triệt tiêu khuôn phiên mã cccDNA (covalently closed circular DNA) nằm sâu trong nhân tế bào gan. Việc ngừng điều trị NAs thường dẫn đến tỷ lệ tái phát virus vượt quá 50%, buộc người bệnh phải dùng thuốc kéo dài suốt đời cùng nhiều nguy cơ xuất hiện đột biến kháng thuốc.

Do việc sinh thiết gan để định lượng trực tiếp cccDNA mang tính xâm lấn cao và không thể áp dụng thường quy trên lâm sàng, dấu ấn sinh học pregenomic RNA (HBV pgRNA) trong huyết tương đã nổi lên như một giải pháp thay thế hoàn hảo. HBV pgRNA có kích thước 3,5 kb, được phiên mã trực tiếp từ cccDNA và giải phóng vào máu ngoại vi trong các hạt virus chưa hoàn thiện, phản ánh chính xác hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học của tác giả Triệu Thị Nguyệt, được thực hiện tại Học viện Quân y và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2019-2020, tập trung giải quyết bài toán cấp thiết: Xây dựng và tối ưu hóa quy trình RT-qPCR một bước (one-step RT-qPCR) có độ nhạy cao nhằm định lượng chính xác tải lượng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại Việt Nam. Nghiên cứu mang lại ý nghĩa to lớn trong việc tạo lập công cụ chẩn đoán không xâm lấn, mở rộng dải định lượng từ 10^1 đến 10^8 copies/phản ứng, hỗ trợ bác sĩ tiên lượng đáp ứng điều trị và đưa ra quyết định ngừng thuốc NAs an toàn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên mô hình chu trình nhân lên đặc thù của virus họ Hepadnaviridae và cơ chế hoạt động của hệ gen HBV. Sau khi xâm nhập vào tế bào gan, hệ gen DNA dạng vòng không kín (rcDNA) kích thước 3,2 kb của HBV được chuyển hóa thành dạng DNA vòng đóng cộng hóa trị (cccDNA). cccDNA hoạt động như một nhiễm sắc thể thu nhỏ, đóng vai trò làm khuôn phiên mã duy nhất để tổng hợp nên phân tử RNA tiền bộ gen (pgRNA) dài 3,5 kb cùng các mRNA khác. Phân tử pgRNA này sau đó được enzyme reverse transcriptase (RTase) của virus phiên mã ngược thành sợi âm DNA bên trong vỏ capsid, tái tạo lại rcDNA để đóng gói thành virion hoàn chỉnh hoặc tái quay vòng vào nhân nhằm duy trì nguồn cccDNA.

Khung lý thuyết thứ hai dựa trên cơ chế dược lý của các thuốc đồng đẳng NAs. Các thuốc NAs chỉ ức chế hoạt tính polymerase ở bước phiên mã ngược từ pgRNA thành DNA, chứ không tác động đến quá trình phiên mã từ cccDNA sang pgRNA. Do đó, nồng độ HBV pgRNA lưu hành trong máu phản ánh trung thực mức độ hoạt động của cccDNA ngay cả khi HBV DNA đã bị ức chế hoàn toàn. Các khái niệm cốt lõi được áp dụng trong đề tài bao gồm: cccDNA nội nhân, pregenomic RNA (pgRNA), phân tử rcDNA, kháng nguyên bề mặt HBsAg, kháng nguyên HBeAg, và kỹ thuật khuếch đại acid nucleic RT-qPCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang TaqMan.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm bao gồm 77 mẫu huyết tương từ bệnh nhân viêm gan B mạn tính (CHB) điều trị tại các cơ sở y tế, được phân loại theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Gan mật Hoa Kỳ (AASLD 2018) thành hai nhóm HBeAg dương tính và HBeAg âm tính với nồng độ HBV DNA nền từ 10^4 đến 10^5 copies/mL. Nhóm chứng đối chứng âm bao gồm 50 mẫu huyết tương từ người khỏe mạnh bình thường và 5 mẫu từ bệnh nhân nhiễm virus viêm gan C (HCV) để đánh giá phản ứng chéo. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm loại trừ các trường hợp đồng nhiễm HIV, bệnh nhân có tổn thương gan do rượu hoặc viêm gan tự miễn.

Quy trình phân tích phân tử được thực hiện qua các giai đoạn:

• Thu nhận và xử lý mẫu: Tách chiết RNA từ 500 µL huyết tương bằng bộ kit chuyên dụng QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit, kết hợp xử lý bằng enzyme DNase I nhằm loại bỏ triệt để DNA ngoại nhiễm, thu nhận thể tích dịch chiết cuối là 50 µL.
• Thiết lập chuẩn định lượng: Tạo mẫu chứng dương và bộ mẫu chuẩn pgRNA thông qua quá trình phiên mã in-vitro từ plasmid tái tổ hợp pJET1 mang đoạn gen pgRNA đã được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn XhoI. Nồng độ RNA sau khi tinh sạch bằng Liti Clorua được định lượng chính xác trên máy Nanodrop và quy đổi sang đơn vị copy/µL.
• Thiết kế mồi và probe: Phân tích tính đa hình và độ bảo thủ của vùng gen S (1200 bp) trên các chủng HBV lưu hành tại Việt Nam qua phần mềm ClustalX và Oligo Primer Analysis, xác định đoạn đầu N-terminal của gen S là vùng đích ổn định nhất.
• Tối ưu hóa và đánh giá: Sử dụng hóa chất Quantitect Probe Master Mix trên hệ thống máy Realtime PCR RotorGene. Hiệu năng của quy trình được thẩm định thông qua các chỉ số thống kê gồm hệ số tương quan tuyến tính (R²), hệ số biến thiên (CV <= 0,05), độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch phép đo (ME). Timeline nghiên cứu được thực hiện xuyên suốt từ khâu thiết kế đến đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn kéo dài 3 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tối ưu hóa các thông số kỹ thuật và thực nghiệm trên mẫu lâm sàng đã mang lại bốn phát hiện trọng tâm:

Thứ nhất, nghiên cứu đã thiết kế thành công cặp mồi và mẫu dò TaqMan gắn huỳnh quang FAM đặc hiệu tuyệt đối cho vùng đầu N-terminal của gen S. Điều kiện phản ứng tối ưu được xác lập hoàn chỉnh với nhiệt độ phiên mã ngược ở 50°C trong 10 phút, nhiệt độ gắn mồi ở 63°C trong 30 giây, nồng độ mỗi mồi xuôi/ngược là 0,5 µM và nồng độ probe là 0,2 µM trong tổng thể tích phản ứng 20 µL. Thử nghiệm chất phụ gia chống ngoại nhiễm chỉ ra rằng enzyme UNG làm phân cắt liên kết RNA-cDNA, do đó việc không sử dụng UNG trong hệ thống một bước là điều kiện then chốt để duy trì tín hiệu huỳnh quang ổn định.

Thứ hai, quy trình đạt độ nhạy phân tích vượt trội với ngưỡng phát hiện (LOD) là 2,5 copies/phản ứng (tỷ lệ bắt tín hiệu đạt trên 95% sau 10 lần lặp lại độc lập) và ngưỡng định lượng (LOQ) là 5 copies/phản ứng (tỷ lệ bắt tín hiệu đạt 100%). Dải tuyến tính định lượng được thiết lập rộng từ 10^1 đến 10^8 copies/phản ứng với hệ số tương quan R² đạt 0,998, cho phép đo lường chính xác tải lượng virus ở cả những nồng độ cực thấp.

Thứ ba, độ chính xác và độ lặp lại của quy trình đạt mức lý tưởng với hệ số biến thiên (CV) trong cùng một lần chạy và giữa các lần chạy khác nhau luôn duy trì ở mức dưới 5% (CV <= 0,05), độ lệch chuẩn SD < 0,5 chu kỳ Ct. Đánh giá độ bền của bộ mẫu chuẩn RNA in-vitro tại các mốc thời gian 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng ở điều kiện bảo quản -80°C cho thấy các giá trị Ct hoàn toàn không có sự sai lệch có ý nghĩa thống kê.

Thứ tư, khi kiểm tra trên 77 mẫu bệnh nhân viêm gan B mạn tính, 100% mẫu đều phát hiện được HBV pgRNA. Nồng độ HBV pgRNA trung bình ở nhóm bệnh nhân HBeAg dương tính đạt 5,82 ± 0,74 log10 copies/mL, cao hơn 48,6% so với nhóm bệnh nhân HBeAg âm tính (đạt 3,92 ± 0,61 log10 copies/mL). Độ đặc hiệu chẩn đoán đạt 100% khi toàn bộ 50 mẫu người khỏe mạnh và 5 mẫu viêm gan C đều âm tính với phản ứng.

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt rõ rệt về nồng độ HBV pgRNA giữa nhóm bệnh nhân HBeAg dương tính và HBeAg âm tính phản ánh chính xác trạng thái nhân lên mạnh mẽ của virus cũng như mức độ dồi dào của cccDNA trong tế bào gan ở giai đoạn đầu của bệnh. Kết quả này hoàn toàn tương thích với các công bố quốc tế của Louis và cộng sự (2015) cũng như Wang và cộng sự (2016), đồng thời bổ sung bằng chứng thực nghiệm quan trọng trên các phân typ HBV đặc thù ở quần thể người Việt Nam.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan qua biểu đồ đường chuẩn tuyến tính với độ dốc chuẩn hóa, đồ thị đường cong khuếch đại huỳnh quang hình chữ S rõ nét trên phần mềm RotorGene và bảng phân tầng tải lượng theo từng nhóm bệnh học. Khác với nồng độ HBsAg huyết tương vốn được tổng hợp dư thừa từ cả các đoạn DNA tích hợp trong bộ gen người bệnh (gấp 100 đến 100.000 lần so với virion hoàn chỉnh), HBV pgRNA chỉ xuất phát từ cccDNA có hoạt tính phiên mã. Do đó, quy trình RT-qPCR được thiết lập đã khắc phục hoàn toàn hiện tượng dương tính giả và phản ánh trung thực động học virus, mở ra hướng đi mới trong việc xác định thời điểm chuyển đảo huyết thanh HBeAg và đánh giá lui bệnh bền vững.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm đạt được, đề tài đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể:

1. Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kỹ thuật: Triển khai áp dụng quy trình RT-qPCR một bước định lượng HBV pgRNA tại các trung tâm xét nghiệm sinh học phân tử thuộc các bệnh viện tuyến trung ương như Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương trong vòng 6 đến 12 tháng tới. Mục tiêu duy trì ngưỡng phát hiện 2,5 copies/phản ứng và kiểm soát hệ số biến thiên dưới 5% nhằm phục vụ công tác chẩn đoán chuyên sâu.

2. Mở rộng nghiên cứu lâm sàng tiến cứu: Hội Gan mật Việt Nam phối hợp cùng các viện nghiên cứu y dược học quân sự tổ chức thử nghiệm đa trung tâm trên cỡ mẫu từ 300 đến 500 bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng Tenofovir hoặc Entecavir trong khung thời gian 12 đến 24 tháng. Hoạt động này nhằm theo dõi động học suy giảm pgRNA theo thời gian thực và xây dựng biểu đồ tương quan chính xác với nguy cơ tái phát sau dừng thuốc.

3. Xây dựng tiêu chí đồng thuận về ngừng thuốc NAs: Đệ trình Hội đồng Chuyên môn Bộ Y tế đưa chỉ số nồng độ HBV pgRNA huyết tương (dưới ngưỡng phát hiện kết hợp HBsAg < 100 IU/mL) vào Hướng dẫn Chẩn đoán và Điều trị Viêm gan B mạn tính quốc gia giai đoạn 2024-2026, làm căn cứ khoa học cho phép ngừng điều trị NAs an toàn ở những bệnh nhân đạt đáp ứng virus bền vững.

4. Thương mại hóa bộ sinh phẩm chẩn đoán nội địa: Các doanh nghiệp công nghệ sinh học y tế trong nước cần liên kết với nhóm nghiên cứu để sản xuất bộ kit xét nghiệm In Vitro Diagnostic (IVD) định lượng HBV pgRNA "Made in Vietnam". Mục tiêu giảm giá thành xét nghiệm từ 40% đến 50% so với việc nhập khẩu kit ngoại, giúp hơn 10 triệu người nhiễm HBV tại Việt Nam dễ dàng tiếp cận công nghệ chẩn đoán tiên tiến.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo học thuật và ứng dụng thực tiễn giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm và Tiêu hóa - Gan mật: Sử dụng tài liệu để hiểu sâu về cơ chế động học của HBV pgRNA, từ đó ứng dụng chỉ số này trong việc theo dõi đáp ứng điều trị thuốc NAs, phân tầng nguy cơ bùng phát bệnh và đưa ra quyết định ngừng thuốc chính xác cho từng ca bệnh.

2. Kỹ thuật viên xét nghiệm và chuyên viên sinh học phân tử: Tham khảo chi tiết từng bước thực hành phòng thí nghiệm, từ kỹ thuật tách chiết RNA xử lý DNase I, phương pháp thiết kế mồi/probe TaqMan trên hệ gen biến dị, đến cách thức tối ưu hóa chu trình nhiệt và hóa chất cho phản ứng RT-qPCR một bước.

3. Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Tiếp cận một mô hình nghiên cứu chuẩn mực về vi sinh phân tử, từ việc tạo dòng mẫu chuẩn RNA in-vitro bằng plasmid pJET1, tinh sạch bằng LiCl, đến phương pháp xử lý số liệu thống kê y sinh học theo tiêu chuẩn quốc tế.

4. Các nhà hoạch định chính sách y tế và nhà sản xuất sinh phẩm y tế: Khai thác dữ liệu khoa học để xây dựng các hướng dẫn chuyên môn mới trong quản lý bệnh viêm gan B và định hướng đầu tư nghiên cứu phát triển các dòng kit chẩn đoán phân tử có độ nhạy cao phục vụ cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao HBV pgRNA huyết tương phản ánh chính xác hoạt tính cccDNA hơn HBV DNA ở bệnh nhân dùng thuốc NAs? Thuốc NAs ức chế enzyme phiên mã ngược của virus, làm giảm mạnh nồng độ HBV DNA huyết thanh nhưng không tác động lên cccDNA trong nhân tế bào gan. cccDNA vẫn liên tục phiên mã tạo pgRNA và được đóng gói giải phóng vào máu. Do đó, định lượng pgRNA huyết tương là chỉ dấu trực tiếp chỉ ra cccDNA còn hoạt động hay đã bị ức chế hoàn toàn mà không cần sinh thiết mô gan.

Vùng gen nào trên hệ gen HBV được lựa chọn để thiết kế mồi và probe trong nghiên cứu này? Nghiên cứu đã khảo sát toàn bộ hệ gen và chọn vùng đầu N-terminal của gen S (kích thước khoảng 1200 nucleotide) làm đích khuếch đại. Đây là vùng trình tự có tính bảo thủ cao nhất giữa các kiểu gen HBV phổ biến tại Việt Nam, đảm bảo độ đặc hiệu 100% và giảm thiểu nguy cơ bắt cặp sai do các đột biến ngẫu nhiên của virus.

Ngưỡng phát hiện và ngưỡng định lượng của quy trình RT-qPCR này đạt mức bao nhiêu? Quy trình RT-qPCR sau tối ưu hóa đạt ngưỡng phát hiện (LOD) là 2,5 copies/phản ứng với xác suất phát hiện trên 95% qua 10 lần chạy lặp lại. Ngưỡng định lượng (LOQ) đạt 5 copies/phản ứng với độ tin cậy 100%. Khoảng tuyến tính đo lường kéo dài từ 10^1 đến 10^8 copies/phản ứng với hệ số tương quan R² đạt 0,998.

Vì sao enzyme UNG không được đưa vào phản ứng RT-qPCR trong luận văn? Enzyme Uracil N-glycosylase (UNG) thường dùng để phá hủy sản phẩm khuếch đại cũ chứa dUTP nhằm chống nhiễm chéo. Tuy nhiên, trong phản ứng RT-qPCR một bước, UNG làm cắt đứt liên kết lai giữa RNA khuôn mẫu và cDNA mới tạo thành, khiến phản ứng mất hoàn toàn tín hiệu huỳnh quang ở cả mẫu chứng dương. Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã loại bỏ UNG để đảm bảo độ nhạy.

Bộ mẫu chuẩn RNA in-vitro được tạo ra như thế nào và có độ bền bao lâu? Mẫu chuẩn được tổng hợp bằng phản ứng phiên mã in-vitro từ plasmid tái tổ hợp pJET1 chứa trình tự pgRNA được mở vòng bằng enzyme XhoI, sau đó tinh sạch bằng Liti Clorua và định lượng qua NanoDrop. Khi bảo quản ở nhiệt độ -80°C, bộ mẫu chuẩn duy trì độ ổn định tuyệt đối trong ít nhất 3 tháng với hệ số biến thiên chu kỳ Ct luôn nhỏ hơn 5%.

Kết luận

• Xây dựng và tối ưu hóa thành công quy trình RT-qPCR một bước định lượng HBV pgRNA huyết tương với ngưỡng phát hiện đạt 2,5 copies/phản ứng và ngưỡng định lượng đạt 5 copies/phản ứng.
• Thiết kế chính xác bộ mồi và TaqMan probe đặc hiệu trên vùng đầu N-terminal gen S, kiểm soát độ ổn định phản ứng với hệ số biến thiên luôn dưới 5%.
• Chế tạo thành công bộ mẫu chuẩn pgRNA phiên mã in-vitro có độ ổn định kéo dài ít nhất 3 tháng ở -80°C, mở rộng dải đo định lượng từ 10^1 đến 10^8 copies/phản ứng.
• Chứng minh độ đặc hiệu phân tích đạt 100% trên 50 mẫu người khỏe mạnh và 5 mẫu viêm gan C, hoàn toàn không xảy ra hiện tượng phản ứng chéo.
• Đánh giá lâm sàng thành công trên 77 bệnh nhân viêm gan B mạn tính, ghi nhận nồng độ pgRNA ở nhóm HBeAg dương tính cao hơn rõ rệt (5,82 log10 copies/mL) so với nhóm HBeAg âm tính (3,92 log10 copies/mL).

Kế hoạch tiếp theo cần tập trung mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm trong vòng 12 tháng tới để xây dựng ngưỡng cắt (cut-off) cho quyết định ngừng thuốc NAs. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế quan tâm có thể khai thác quy trình này nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và quản lý toàn diện bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu AUG khác nhau [92]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]. Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV 1. Các protein HBV Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và S- HBsAg.

Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình thành cấu trúc của virion. Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc đến chi tiết hơn ở phần dưới đây. Kháng nguyên E HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore. Là một trong những protein được mã hóa bởi sản phẩm phiên mã từ bộ gen của virus, 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus.

ORF HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum - ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra từ các tế bào nhiễm HBV [113]. Kháng nguyên bề mặt HBsAg là protein vỏ của virion HBV. Như sự tồn tại của HBsAg ở các virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại trong huyết thanh của họ. Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000 lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107].

Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30, 35]. HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các DNA tích hợp với bộ gen của người. Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107]. Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ của virus.

Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này. S- HBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25]. Protein lõi (protein core) Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò định hình cho virion. Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4.

Khoảng 95% các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nên khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16]. Khoảng 34 - 36 axit amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81]. Polymerase/Reverse transcriptase (RTase) Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA, cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99].

Trong khi quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo. Protein polymerase (reverse transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi. Ở vùng N-terminal là vùng TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình sao chép bộ gen virus. Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV.

Một vùng đệm thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà không làm thay đổi chức năng của P [86]. Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53]. RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA. Domain này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122].

Hiện nay domain RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loại thuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV. Thực tế 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phần đồng hợp của HIV RTase [116]. Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H. Domain này chịu trách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi âm của hệ gen DNA.

Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọng đối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103]. Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domain này trong việc đóng gói pgRNA [10]. Protein X HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV. Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất của HBV.

Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai trò cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV. Đặc biệt, có một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần cho quá trình phiên mã từ cccDNA [94]. Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ở động vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộ gen virus [128]. Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBx không thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108].

Quan trọng là, sự cần thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễm HBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64]. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết mồi/probe. HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đến nay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền và đột biến ngẫu nhiên. Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tự 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] pgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất.

Đa dạng di truyền của virus viêm gan B: Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV. Tuy nhiên, khác với những virus có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khác biệt với các virus đó. Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chức năng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chu trình nhân lên của chúng. Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai số ngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của hệ gen [19, 51, 52].

Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tính vào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với những virus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76]. Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếp chồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gen của HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77]. Đột biến ngẫu nhiên: Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áp lực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trình nhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửa chữa của pgRNA [29, 98, 112]. Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biến xảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP), thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên ‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt.

Những loại đột biến này giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị.