mở đầu AUG khác nhau [92]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]. Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV 1. Các protein HBV Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và S- HBsAg.
Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình thành cấu trúc của virion. Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc đến chi tiết hơn ở phần dưới đây. Kháng nguyên E HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore. Là một trong những protein được mã hóa bởi sản phẩm phiên mã từ bộ gen của virus, 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus.
ORF HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum - ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra từ các tế bào nhiễm HBV [113]. Kháng nguyên bề mặt HBsAg là protein vỏ của virion HBV. Như sự tồn tại của HBsAg ở các virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại trong huyết thanh của họ. Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000 lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107].
Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30, 35]. HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các DNA tích hợp với bộ gen của người. Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107]. Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ của virus.
Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này. S- HBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25]. Protein lõi (protein core) Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò định hình cho virion. Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4.
Khoảng 95% các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nên khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16]. Khoảng 34 - 36 axit amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81]. Polymerase/Reverse transcriptase (RTase) Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA, cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99].
Trong khi quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo. Protein polymerase (reverse transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi. Ở vùng N-terminal là vùng TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình sao chép bộ gen virus. Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV.
Một vùng đệm thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà không làm thay đổi chức năng của P [86]. Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53]. RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA. Domain này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122].
Hiện nay domain RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loại thuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV. Thực tế 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phần đồng hợp của HIV RTase [116]. Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H. Domain này chịu trách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi âm của hệ gen DNA.
Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọng đối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103]. Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domain này trong việc đóng gói pgRNA [10]. Protein X HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV. Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất của HBV.
Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai trò cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV. Đặc biệt, có một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần cho quá trình phiên mã từ cccDNA [94]. Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ở động vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộ gen virus [128]. Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBx không thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108].
Quan trọng là, sự cần thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễm HBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64]. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết mồi/probe. HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đến nay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền và đột biến ngẫu nhiên. Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tự 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com pgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất.
Đa dạng di truyền của virus viêm gan B: Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV. Tuy nhiên, khác với những virus có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khác biệt với các virus đó. Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chức năng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chu trình nhân lên của chúng. Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai số ngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của hệ gen [19, 51, 52].
Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tính vào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với những virus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76]. Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếp chồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gen của HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77]. Đột biến ngẫu nhiên: Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áp lực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trình nhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửa chữa của pgRNA [29, 98, 112]. Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biến xảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP), thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên ‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt.
Những loại đột biến này giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị.