Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

• Tác giả: Triệu Thị Nguyệt
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV-RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về HBV
• 1.2. Đặc điểm phân loại HBV
• 1.3. Đặc điểm hình thái HBV
• 1.4. Cấu trúc hệ gen HBV
• 1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe
• 1.6. Chu trình nhân lên của HBV
• 1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV
• 1.8. Tổng quan về viêm gan B mạn tính
• 1.9. HBV và viêm gan B
• 1.10. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
• 1.11. Tình hình nghiên cứu HBV
• 1.12. Trên thế giới
• 1.13. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu, hóa chất
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Thu thập, bảo quản mẫu
• 2.7. Tách chiết acid nucleic
• 2.8. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương
• 2.9. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 2.9.1. Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược
• 2.9.2. Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược
• 2.9.3. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
• 2.9.4. Tối ưu thời gian luân nhiệt
• 2.9.5. Tối ưu nồng độ mồi
• 2.9.6. Tối ưu nồng độ probe
• 2.10. Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR
• 2.11. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 2.12. Phân tích, xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.2. Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh
• 3.3. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định
• 3.4. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện
• 3.5. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.6. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA
• 3.7. Tối ưu quy trình realtime RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.7.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc độ thay đổi nhiệt độ của phản ứng RT-qPCR
• 3.7.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe
• 3.7.3. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm
• 3.8. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
• 3.9. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR
• 3.10. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm
• 3.11. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.12. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB
• 3.13. Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về quy trình định lượng HBV RNA huyết tương

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Viêm gan B mạn tính do virus HBV gây ra có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan. Việc xác định nồng độ HBV RNA trong huyết tương giúp theo dõi tình trạng bệnh và hiệu quả điều trị. Quy trình này không chỉ giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác mà còn hỗ trợ trong việc tiên lượng bệnh.

1.1. Định nghĩa và vai trò của HBV RNA trong viêm gan B

HBV RNA, hay RNA tiền gen, là một chỉ số quan trọng trong việc đánh giá tình trạng nhiễm virus HBV. Nồng độ HBV RNA trong huyết tương phản ánh mức độ hoạt động của virus và có thể giúp xác định hiệu quả của các phương pháp điều trị. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ HBV RNA cao có liên quan đến nguy cơ tiến triển bệnh và các biến chứng nghiêm trọng.

1.2. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Theo thống kê, khoảng 10% dân số Việt Nam bị nhiễm virus này. Điều này đặt ra thách thức lớn cho hệ thống y tế trong việc quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính. Việc nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương là cần thiết để cải thiện chất lượng điều trị và giảm thiểu biến chứng.

II. Thách thức trong việc định lượng HBV RNA huyết tương

Mặc dù quy trình định lượng HBV RNA huyết tương đã được phát triển, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc thực hiện. Các yếu tố như độ nhạy của phương pháp xét nghiệm, chất lượng mẫu và quy trình bảo quản đều ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Đặc biệt, việc tách chiết và bảo quản mẫu huyết tương là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét nghiệm

Độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp xét nghiệm định lượng HBV RNA là yếu tố quyết định đến khả năng phát hiện chính xác nồng độ virus trong huyết tương. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp RT-qPCR có độ nhạy cao, nhưng vẫn cần tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất trong điều kiện lâm sàng.

2.2. Ảnh hưởng của chất lượng mẫu đến kết quả xét nghiệm

Chất lượng mẫu huyết tương có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thời gian bảo quản, nhiệt độ và phương pháp tách chiết. Việc bảo quản mẫu không đúng cách có thể dẫn đến sự phân hủy của RNA, làm giảm độ chính xác của kết quả xét nghiệm. Do đó, quy trình thu thập và bảo quản mẫu cần được thực hiện nghiêm ngặt.

III. Phương pháp tối ưu hóa quy trình định lượng HBV RNA

Để đạt được kết quả chính xác trong việc định lượng HBV RNA, quy trình RT-qPCR cần được tối ưu hóa. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian và nồng độ mồi đều cần được điều chỉnh để đạt được hiệu suất tối ưu. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng có thể cải thiện độ nhạy và độ chính xác của phương pháp.

3.1. Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian phản ứng

Nhiệt độ và thời gian phản ứng là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng RT-qPCR. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và thời gian phiên mã ngược có thể làm tăng đáng kể độ nhạy của phương pháp. Các thử nghiệm đã được thực hiện để xác định điều kiện tối ưu cho từng bước trong quy trình.

3.2. Tối ưu hóa nồng độ mồi và probe

Nồng độ mồi và probe cũng đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng HBV RNA. Việc tối ưu hóa nồng độ này giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ mồi và probe tối ưu có thể cải thiện đáng kể kết quả xét nghiệm, từ đó hỗ trợ trong việc theo dõi điều trị.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình định lượng HBV RNA

Quy trình định lượng HBV RNA huyết tương không chỉ có giá trị trong việc theo dõi điều trị mà còn trong việc tiên lượng bệnh. Nồng độ HBV RNA có thể giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả của các phương pháp điều trị và điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc xác định nồng độ HBV RNA cũng có thể giúp phát hiện sớm các biến chứng của bệnh.

4.1. Theo dõi hiệu quả điều trị viêm gan B

Việc định lượng HBV RNA giúp theo dõi hiệu quả điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Nồng độ HBV RNA giảm sau điều trị cho thấy hiệu quả của phương pháp điều trị. Ngược lại, nếu nồng độ HBV RNA không giảm hoặc tăng trở lại, bác sĩ có thể cần điều chỉnh phác đồ điều trị.

4.2. Tiên lượng biến chứng của viêm gan B

Nồng độ HBV RNA cao có thể là dấu hiệu cảnh báo sớm về nguy cơ tiến triển bệnh và các biến chứng như xơ gan và ung thư gan. Việc theo dõi nồng độ HBV RNA định kỳ giúp phát hiện sớm các biến chứng, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính là một bước tiến quan trọng trong việc cải thiện chất lượng điều trị. Quy trình này không chỉ giúp theo dõi hiệu quả điều trị mà còn hỗ trợ trong việc phát hiện sớm các biến chứng. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của nó trong lâm sàng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong điều trị viêm gan B

Nghiên cứu quy trình định lượng HBV RNA có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện kết quả điều trị viêm gan B. Việc xác định nồng độ HBV RNA giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác và kịp thời, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp định lượng HBV RNA mới với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Ngoài ra, việc nghiên cứu các dấu ấn sinh học khác cũng có thể mở ra hướng đi mới trong việc theo dõi và điều trị viêm gan B mạn tính.