MỞ ĐẦU Theo nhận định chung, hiện nay Việt Nam đang phải nhập khẩu tới 90% hoạt chất làm thuốc, 100% các thuốc có gốc steroid và nền công nghiệp hóa dược gần như chưa có. Ngày 10/01/2014 Thủ tướng Chính phủ có Quyết định số 68/QĐ-TTg phê duyệt chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, đến năm 2020, thuốc sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, sản xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước. Ngay từ Đại hội Hội Hoá dược tháng 10/2007 diễn ra ở Hà Nội, phầ n lớn ý kiế n của các nhà khoa ho ̣c đề u đã nhâ ̣n đinh, ̣ ngành hóa dược Việt Nam muố n thành công vẫn phải ưu tiên đi vào các nguồn hợp chất thiên nhiên như sterol đậu tương, flavonoid…[121], coi đây là mô ̣t trong những thế ma ̣nh của ngành.
Trước đây, trong liñ h vực tổ ng hơ ̣p các loa ̣i thuố c có nguồ n gố c steroid, diosgenin và solasodine chiế t xuấ t từ Dioscorea và Solanum tương ứng, đươ ̣c coi là các nguyên liệu số một. Tuy nhiên các cây này phải trồng trên đất nông nghiệp nhiều năm mới có thu hoạch, do vậy giá thành cao. Từ lâu người ta đã ra sức tìm kiếm các nguồn nguyên liệu rẻ tiền hơn. Các sterol thực vật (phytosterol) được chú ý đến nhiều nhất vì chúng có trữ lượng rất lớn và có thể thu hồi từ phế phụ thải công nghiệp giấy, công nghiệp mía đường và công nghiệp dầu đậu tương.
Điều này đã trở thành hiện thực sau khi phát minh ra một số chủng vi sinh phân cắt chọn lọc mạch bên các sterol đến các 17-ketosteroid: androstenedione (AD), androstadienedione (ADD) và 9- hydroxyandrostenedione (9-OH AD) [122]. Một số công ty dược lớn trên thế giới “Upjoin Co.’’ [8,49,56] của Mỹ, “Schering” [81] của Đức, “Mitsubishi” [9,23] của Nhật đã đưa ra thị trường một số dược phẩm steroid được bán tổng hợp từ sterol thông qua 17-ketosteroid trung gian. Ở nước ta một số nhà máy giấy cỡ lớn đang hoạt động và đậu tương là một nông sản quan trọng thứ ba với sản lượng hàng trăm ngàn tấn/ năm. Do vậy thu hồi sterol từ phế phụ thải của hai ngành sản xuất trên là một vấn đề thời sự có ý nghĩa khoa học, kinh tế, xã hội và môi trường to lớn.
2 Ở Việt Nam từ 1990 đến nay nhóm nghiên cứu của Lưu Đức Huy và cộng sự đã nghiên cứu nhằm hoàn thiện một số phương pháp mới chuyển hoá sterol đến corticoid thông qua 17-ketosteroid trung gian. Mục đích cuối cùng là đưa ra một sơ đồ mới hiệu quả tổng hợp corticoid từ sterol thay thế cho các sơ đồ trước đây tổng hợp chúng dựa trên nguyên liệu cũ không còn tương lai diosgenin và solasodine. Năm 2006, lần đầu tiên Lưu Đức Huy và các đồng tác giả [123] đã công bố kết quả chuyển hoá vi sinh rất hiệu quả phytosterol, nguyên liệu Việt Nam, đến AD và ADD. Năm 2007, Bộ Khoa học Công nghệ đã phê duyệt nhiệm vụ Nghị định thư hợp tác với Liên bang Nga “Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hoá phytosterol đến androstenedione (AD) và 9-hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hoá - dược” do Lưu Đức Huy làm chủ nhiệm.
Từ kết quả nhận được Lưu Đức Huy và cộng sự Nga đã có công bố công nghệ chuyển hóa vi sinh phytosterol đến AD và 9α-OH AD [124] với hiệu suất trung bình đạt 70% và 75-80%, tương ứng. Công nghệ còn được nghiên cứu cải tiến, nâng cấp nhờ áp dụng phương pháp xúc tác Immobil [125]. Về nguyên tắc khi nguyên liệu đầu là diosgenin hay solasodine, sau khi phân cắt chọn lọc mạch nhánh ta đã có được mạch bên pregnane; khi chuyển sang sterol ta nhận được 17-ketosteroid (AD, ADD, 9α-OH AD…), tức là chưa có mạch bên pregnane. Như vây, một trong số các nhiệm vụ quan trọng nhất là xây dựng mạch bên pregnane.
Trong đó phương pháp cyanohydrin và phương pháp acetylene có triển vọng ứng dụng nhất. Trong phạm vi của luận án này, chúng tôi đă ̣t ra nhiê ̣m vu ̣ nghiên cứu và hoàn thiện mô ̣t số phương pháp tổ ng hơ ̣p pregnane và một số dẫn xuất của chúng từ 9α-OH AD như sau: 1. Dehydrat hóa 9α-OH AD tổng hợp androsta-4,9(11)-diene-3,17-dione (Δ9-AD) 2. Nghiên cứu so sánh hai phương pháp có giá trị thực tiễn nhất tổng hợp mạch bên pregnane từ 17-ketosteroid là phương pháp acetylene và phương pháp cyanohydrin 3.
Phương pháp tạo lập nhóm chức 16β-methyl-17α-hydroxypregnane 4. Phương pháp tạo lập nối đôi ∆1(2) 5. Phương pháp tạo lập mạch bên corticoid 3 6. Một số phương pháp phụ trợ khác như: tạo lập 9β,11β-epoxy; 16α,17α-epoxy; đưa nhóm OH vào vị trí 11β-; tạo lập nhóm chức 9α-bromo-11β-hydroxy; bảo vệ các nhóm 3- và 20-keto… Các phương pháp này là một phần của chương trình lớn hơn và bao quát hơn của nhóm nghiên cứu do Lưu Đức Huy phụ trách, nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc có gốc steroid đặc biệt là các corticoid.
Dựa trên các phương pháp này chúng tôi cũng đề xuất hai sơ đồ lựa chọn hoàn chỉnh tổng hợp một số thuốc gốc steroid như: hydrocortisone acetate, prednisolone, betamethasone, beclomethasone từ 9α-OH AD. Phương pháp tổng hợp mạch bên pregnane Pregnane là một lớp chất steroid với mạch nhánh gồm hai nguyên tử C (20CH221CH3) gắn ở vị trí C-17. Tấ t cả các steroid đề u có hê ̣ thố ng khung cyclopentanoperhydrophenanthrene bao gồ m ba vòng cyclohexane (A, B, C) và một vòng cyclopentane (D). Khung steroid Khung pregnane Tổng hợp corticosteroid nói chung, 20-ketopregnane nói riêng, từ 17- ketoandrostene có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp sau đây [1-5].
(1) Phương pháp cyanohydrin: 17-ketosteroid được ngưng tụ chọn lọc lập thể với HCN; 17-cyano-17-hydroxyandrostene tạo thành được alkyl hoá bằng tác nhân Grignard hay CH3Li. (3) Ứng dụng phản ứng ngưng tụ Knoevenagel: ngưng tụ xúc tác base 17- ketosteroid với hợp chất có nguyên tử hydro linh động như methoxy-, ester cyanoacetic, isocyanoacetate, nitromethane v. tiếp theo, oxy hoá liên kết đôi Δ17(20). (5) Phương pháp acetylene, tức là 17-ketosteroid được ngưng tụ với acetylene; 17-ethynyl-17-hydroxyandrostene tạo ra sẽ được chuyển hoá đến pregnane bằng những phương pháp khác nhau.
Con đường acetylene bắt đầu phát triển chỉ vào những năm gần đây khi có được khả năng rõ ràng 17-ethynyl hoá định hướng lập thể 17- 5 ketosteroid hay là epimer hoá hiệu quả trung tâm C-17 của 17-ethynyl-17- hydroxyandrostene nhận được ban đầu trong phản ứng ngưng tụ acetylene. Điều đó đã kích thích mối quan tâm ứng dụng phương pháp này vào thực tiễn và cần thiết tổng kết lại các tư liệu tham khảo mà cho đến nay trong các tổng quan mới chỉ được đề cập rời rạc ở phạm vi tổng hợp mạch bên pregnane [1-3,5]. Trong tổng quan này chúng tôi sắp xếp bố cục theo thời gian phát triển của phương pháp chuyển hoá 17-ketoandrostene đến 20-ketopregnane, đặc biệt lưu ý tới các công trình gần đây nhất. Phương pháp cyanohydrin tổng hợp mạch bên pregnane Phương pháp rất có ý nghĩa thực tiễn tổng hợp mạch bên pregnane là phương pháp cyanohydrin, bao gồm tương tác của các hợp chất 17-ketosteroid với acetone cyanohydrin (hay HCN) và alkyl hoá tiếp theo hợp chất 17α-hydroxy-17β-cyano vừa nhận được.
Phương pháp cyanohydrin xây dựng mạch bên pregnane từ AD và 9-OH AD có hàng loạt ưu điểm: tính chọn lọc cao của phản ứng hydrocyan hoá vào nhóm 17-keto, tác nhân acetone cyanohydrin dồi dào, giá thành thấp. Trong tổng hợp các pregnane từ AD các tác giả đã chỉ ra tính hiệu quả cao của phản ứng này [6]. Phương pháp cyanohydrin xây dựng mạch bên pregnane từ chất đầu AD cũng đã được đề xuất bởi các tác giả Nhật [7]. Trong sáng chế của hãng Upjohn [8], phương pháp cyanohydrin được áp dụng để mô hình hoá các dẫn xuất khác nhau của AD.
Tuy nhiên việc sử dụng 9α-OH AD là chất đầu đã được tuyên bố nhưng chưa được mô tả trong các ví dụ. Để tránh chuyển vị không mong muốn với sự tham gia của nhóm 9-hydroxy bậc ba và vòng A, một cách tiện lợi sẽ chuyển hoá nó đến dẫn xuất ∆9(11), chức này bền vững hơn trong điều kiện các phản ứng tiếp theo. Hãng Mitsubishi của Nhật đã đề xuất điều chế dẫn xuất 17β- cyano-17α-hydroxy bằng cách hydrocyano hóa AD hay là ∆9(11)-AD. Tuy nhiên phản ứng của ∆9(11)-AD với acetone cyanohydin trong các điều kiện được tác giả mô tả xảy ra với sự tạo thành chỉ dẫn xuất không mong muốn 17α-cyano-17β-hydroxy, trong khi phản ứng với sự có mặt nhóm 9α-hydroxy ở chính các điều kiện này chỉ cho đồng phân epimer mong muốn 17β-cyano-17α-hydroxy.
Đồng phân 17β-cyano-17- hydroxy-∆9(11) có thể nhận được bằng cách epimer hóa 17α-cyano-17-hydroxy-∆9(11) tạo thành ban đầu, bằng tác dụng với NaCN hoặc triethyl amine hydrocyanua 6 (Et3N.HCN) trong dung môi alcohol bậc thấp [9]. Tác giả sáng chế [10] đã điều chế thành công đồng phân 17β-cyano-17α-hydroxy xuất phát từ ∆9-AD với hiệu suất 93% trong môi trường alcohol/nước khi sử dụng phương pháp epimer hoá mà bản chất của phương pháp này là kết tủa dần dần đồng phân 17β-cyano-17α-hydroxy bằng cách thay đổi nồng độ nước. Chuyển hoá xa hơn hợp chất 17β-cyano-17α-hydroxy- đến 20-ketopregnane đã được thực hiện bằng phản ứng với CH3Li hay CH3MgBr, trong đó các nhóm 3-keto và 17α-hydroxy đã được bảo vệ [7,11-13]. Để tạo ra hợp chất ∆16(17)- có thể sử dụng đồng phân 17α-cyano-17β-hydroxy hoặc 17β-cyano-17α-hydroxy, hoặc hỗn hợp của chúng.
Ban đầu người ta ester hoá nhóm 17-hydroxy bằng phản ứng với methanesulfonyl chloride (CH3SO2Cl), sau đó 17-cyano-17-methanesulfonyloxysteroid tạo thành được xử lí bằng tác nhân dehydrat hoá. Alkyl hoá tiếp theo ∆16(17)-17-nitrile bằng tác nhân Grignard cho phép chuyển hoá các dẫn xuất androstane đến 20-ketopregnane với hiệu suất cao [14]. Phương pháp đã được hoàn thiện và áp dụng đối với các trường hợp 3-acetoxy-∆5-17-ketoandrostane và AD [15]. Để điều chế 17-acetylsteroid từ 17-oxosteroid có thể sử dụng các tác nhân đặc biệt gọi là “tác nhân acetyl che chắn” làm thay đổi hoạt tính của nhóm carbonyl.
Các nguyên tắc và ứng dụng của khái niệm này đã được xem xét lại bởi Seebach [16], Grobel & Seebach [17]. Trong sự có mặt của các base mạnh “tác nhân acetyl che chắn” tạo thành dạng anion bền vững dễ dàng phản ứng với nguyên tử C nhóm carbonyl của 17-oxosteroid và tạo ra hợp chất trung gian dễ bị thủy phân thành nhóm acetyl, dẫn tới 17-acetylsteroid. Các “tác nhân acetyl che chắn” có thể được sử dụng để tạo ra mạch bên pregnane [18,19]. Rất ưa dùng loại này là alkyl hoặc các aryl vinyl ether, alkyl hoặc aryl vinyl thioether hoặc 1,1-trimethylene dithioethane…Việc sử dụng các alkyl vinyl ether được minh họa bởi Baldwin và cộng sự [20,21].
7 Phương pháp này có thể được áp dụng để chuyển hoá các 9α-hydroxy-17- ketoandrostane đến 9α,17α-dihydroxy-20-ketopregnane. Áp dụng phương pháp “tác nhân acetyl che chắn” có kết quả tốt đối với trường hợp 9-hydroxysteroid có vòng D chứa “X” là O hoặc S, “R” là nhóm alkyl (1-6C) hoặc aryl; sau khi xử lý với acid nhận được 17-acetyl-17β-hydroxysteroid tương ứng.