Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Theo số liệu thống kê được luận án trích dẫn, Việt Nam phải nhập khẩu tới 90% hoạt chất làm thuốc, trong đó 100% các thuốc có gốc steroid phụ thuộc vào nguồn nhập ngoại trong khi nền công nghiệp hóa dược trong nước chưa phát triển tương xứng. Ngày 10/01/2014, Thủ tướng Chính phủ ban hành Quyết định số 68/QĐ-TTg phê duyệt Chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030, đặt mục tiêu thuốc sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị tiêu thụ và sản xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu làm thuốc.

Trước đây, quá trình tổng hợp các thuốc có nguồn gốc steroid trên thế giới và tại Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nguyên liệu diosgenin (chiết xuất từ chi Dioscorea) và solasodine (chiết xuất từ chi Solanum). Các loại cây này đòi hỏi diện tích đất nông nghiệp và chu kỳ canh tác nhiều năm mới cho thu hoạch, khiến giá thành nguyên liệu đầu vào tăng cao. Để giải quyết bài toán này, hướng tiếp cận sử dụng sterol thực vật (phytosterol) thu hồi từ phế phụ phẩm của công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp mía đường và chế biến dầu đậu tương đã mở ra tiềm năng lớn.

Việt Nam có sản lượng đậu tương hàng trăm ngàn tấn/năm cùng hệ thống nhà máy giấy đang vận hành, cung cấp nguồn phytosterol dồi dào. Nhờ các kỹ thuật vi sinh, phytosterol được phân cắt chọn lọc mạch bên để tạo ra các 17-ketosteroid trung gian quan trọng gồm: androstenedione (AD), androstadienedione (ADD) và 9α-hydroxyandrostenedione (9α-OH AD). Khác với diosgenin hay solasodine (vốn đã có sẵn khung mạch bên pregnane 2 carbon tại vị trí C-17), các hợp chất 17-ketosteroid thu được từ phytosterol chưa có mạch bên này. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp hóa học nhằm tạo lập mạch bên pregnane và chuyển hóa tiếp thành mạch bên corticoid từ tiền chất 9α-OH AD là một nhiệm vụ khoa học và thực tiễn cấp thiết của ngành hóa dược Việt Nam.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Luận án xác định các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể được đánh số như sau:

  1. Dehydrat hóa 9α-OH AD để tổng hợp androsta-4,9(11)-diene-3,17-dione ($\Delta^9$-AD).
  2. Nghiên cứu so sánh hai phương pháp tổng hợp mạch bên pregnane từ 17-ketosteroid: phương pháp acetylene và phương pháp cyanohydrin.
  3. Nghiên cứu phương pháp tạo lập nhóm chức 16β-methyl-17α-hydroxypregnane.
  4. Nghiên cứu phương pháp tạo lập nối đôi $\Delta^{1(2)}$.
  5. Nghiên cứu phương pháp tạo lập mạch bên corticoid (mạch dioxyacetone: 20-keto-21-hydroxy).
  6. Nghiên cứu một số phương pháp phụ trợ khác như: tạo lập 9β,11β-epoxy; 16α,17α-epoxy; đưa nhóm OH vào vị trí 11β-; tạo lập nhóm chức 9α-bromo-11β-hydroxy; bảo vệ các nhóm 3-keto và 20-keto.
  7. Đề xuất 02 sơ đồ lựa chọn hoàn chỉnh tổng hợp một số thuốc gốc steroid: hydrocortisone acetate, prednisolone, betamethasone và beclomethasone từ nguyên liệu đầu 9α-OH AD.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất 9α-hydroxyandrostenedione (9α-OH AD), các dẫn xuất trung gian androstane, pregnane và các dược phẩm steroid nhóm corticoid.
  • Phạm vi không gian: Phòng Hóa học Steroid và Alkaloid, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; phối hợp cùng Học viện Khoa học và Công nghệ.
  • Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2017. Đề tài nằm trong khuôn khổ nghiên cứu được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED - Đề tài số 20) và Chương trình KHCN trọng điểm quốc gia phát triển Công nghiệp Hóa Dược giai đoạn 2007–2020 (Đề tài số 059/15-17).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã tổng quan và phân tích có hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến hóa học steroid:

  • Công trình chuyển hóa vi sinh và bán tổng hợp của các tập đoàn quốc tế: Các công ty dược phẩm lớn như Upjohn Co. (Mỹ), Schering (Đức), Mitsubishi (Nhật Bản) đã ứng dụng chuyển hóa vi sinh sterol qua các trung gian 17-ketosteroid để sản xuất thuốc steroid thương mại.
  • Nghiên cứu của nhóm tác giả Lưu Đức Huy và cộng sự (Việt Nam - Liên bang Nga): Từ năm 1990 đến nay, nhóm nghiên cứu đã triển khai các hướng chuyển hóa phytosterol nguồn gốc Việt Nam. Năm 2006, công bố kết quả chuyển hóa vi sinh phytosterol thành AD và ADD. Năm 2007, thực hiện nhiệm vụ Nghị định thư hợp tác với Liên bang Nga về công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol thành AD và 9α-OH AD với hiệu suất lần lượt đạt 70% và 75–80%, sau đó nâng cấp bằng xúc tác cố định tế bào (Immobil).
  • Phương pháp cyanohydrin: Các nghiên cứu của Ercoli (1953), nhóm tác giả Nga (1990s), sáng chế của Upjohn và Mitsubishi về việc hydrocyan hóa nhóm 17-keto bằng HCN hoặc acetone cyanohydrin tạo 17α-hydroxy-17β-cyanoandrostene, sau đó epimer hóa hoặc alkyl hóa bằng hợp chất cơ kim (CH3Li, CH3MgBr) để tạo mạch 20-ketopregnane.
  • Phương pháp acetylene: Phản ứng Favorskii kinh điển cộng hợp acetylene vào 17-ketosteroid; các cải tiến của Kanojia và cộng sự (1979), Upjohn (1986), Gist-Brocades trong dung môi amine để tăng tính chọn lọc lập thể; phản ứng epimer hóa gián tiếp qua ester 17β-nitrooxy hoặc trực tiếp qua phức chất cơ kim theo phản ứng Nicholas do Lưu Đức Huy và cộng sự nghiên cứu.
  • Phương pháp bảo vệ nhóm carbonyl: Các công trình của Antonucci, Kashmiri, Geurts và Vivat về việc ketal hóa 3-keto và 20-keto bằng ethylene glycol, neopentyl glycol hoặc tạo enol ether.
  • Phương pháp tạo nối đôi $\Delta^{1(2)}$ và $\Delta^{9(11)}$: Sử dụng các tác nhân hóa học như DDQ (Burn và Petrow, Kubota), SeO2, POCl3/Py, SOCl2/Py, methanesulfonyl chloride, hoặc chuyển hóa vi sinh bằng Arthrobacter simplex.
  • Phương pháp xây dựng mạch bên corticoid: Phương pháp halogen hóa/acetoxy hóa trực tiếp vị trí C-21 của Hogg và cộng sự (1955); ứng dụng các tác nhân iod siêu hóa trị như phenyliodine diacetate (PhI(OAc)2), phenyliodine bis(trifluoroacetate) (PIFA) theo nghiên cứu của Mercusev, Moriarty và Lưu Đức Huy.
  • Phương pháp đưa nhóm 16β-methyl-17α-hydroxy: Phương pháp epoxy hóa nối đôi $\Delta^{16(17)}$ rồi mở vòng bằng thuốc thử Grignard (CH3MgBr), hoặc phương pháp oxy hóa theo Barton.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết

Mặc dù các phản ứng đơn lẻ đã được công bố rải rác, việc kết nối thành một hệ thống phương pháp luận hoàn chỉnh đi từ 9α-OH AD (thu được từ nguồn phytosterol phế phụ phẩm trong nước) nhằm tổng hợp có chọn lọc các corticoid giá trị cao (như hydrocortisone acetate, prednisolone, betamethasone, beclomethasone) vẫn chưa được hoàn thiện. Luận án tập trung so sánh ưu - nhược điểm giữa hai con đường chủ đạo (cyanohydrin và acetylene), tối ưu hóa các điều kiện phản ứng bảo vệ nhóm chức, đưa halogen chọn lọc, khử halogen và kiểm soát lập thể tại các vị trí trung tâm C-16, C-17, C-9, C-11 trên khung steroid.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và các phản ứng hữu cơ sử dụng

Luận án xây dựng trên nền tảng lý thuyết hóa học hữu cơ hiện đại về hợp chất thiên nhiên và steroid, vận dụng các quy luật hóa học lập thể (stereochemistry) của khung cyclopentanoperhydrophenanthrene:

  • Phản ứng dehydrat hóa chuyển vị: Loại nước chọn lọc từ nhóm 9α-OH bậc ba tạo liên kết đôi $\Delta^{9(11)}$ bền vững, hạn chế sự hình thành đồng phân vị trí $\Delta^{8(9)}$.
  • Phản ứng cộng nucleophile vào nhóm carbonyl C-17: Phản ứng cyanohydrin (tác nhân KCN hoặc acetone cyanohydrin) và phản ứng acetylene hóa (tác nhân acetylene/base mạnh) để phát triển mạch C-17.
  • Phản ứng bảo vệ nhóm chức: Tạo vòng 1,3-dioxane (vòng 6 cạnh bền nhiệt động với neopentyl glycol) hoặc 1,3-dioxolane (vòng 5 cạnh với ethylene glycol) nhằm bảo vệ chọn lọc nhóm 3-keto và 20-keto trước các tác nhân khử hoặc cơ kim.
  • Phản ứng oxy hóa - khử và đưa halogen chọn lọc:
    • Đưa liên kết đôi $\Delta^{1(2)}$ bằng tác nhân DDQ (2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone) thông qua trung gian $\Delta^{2,4}$-enol.
    • Phản ứng halohydrin hóa (tạo 9α-bromo-11β-hydroxy) bằng NBS hoặc NBA.
    • Phản ứng tạo vòng oxirane (epoxy hóa) và phản ứng cộng mở vòng epoxy bằng acid halogenhydric hoặc tác nhân Grignard.
    • Phản ứng oxy hóa đưa nhóm 21-acetoxy vào vị trí C-21 thông qua dẫn xuất monoiodide/diiodide hoặc muối iod siêu hóa trị PhI(OAc)2.

Phương pháp thực nghiệm và thiết bị phân tích

  • Nguồn nguyên liệu đầu:
    • 9α-OH AD được điều chế từ AD qua chuyển hóa vi sinh (hiệu suất 82,9%, độ tinh khiết 98,0%).
    • AD được chuyển hóa vi sinh từ phytosterol thu hồi từ phế thải chế biến dầu đậu tương (hiệu suất 72,6%, độ tinh khiết 97,8%).
  • Hóa chất và dung môi: Cung cấp bởi Sigma Aldrich (Mỹ), Merck (Đức) và các nhà sản xuất chuẩn của Trung Quốc; toàn bộ dung môi được làm khan và tinh chế lại ở điểm sôi trước khi phản ứng.
  • Kỹ thuật sắc ký:
    • Sắc ký bản mỏng (TLC) kiểm tra định tính trên bản nhôm tráng sẵn Silufol Merck 60 F254.
    • Sắc ký bản mỏng điều chế (PTLC) sử dụng Silica gel G.Merck 60 F254.
    • Sắc ký cột sử dụng Silica gel Merck kích thước hạt 63–200 µm.
  • Kỹ thuật phân tích cấu trúc:
    • Đo điểm nóng chảy: Thiết bị Boetius (CHDC Đức).
    • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Máy FT-IR-IMPACT-410 (Nicolet, Mỹ), ép viên nén KBr.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Máy Bruker Advance 500 MHz và 400 MHz; ghi phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT và NOESY; dung môi $\text{CDCl}_3$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{DMSO-d}_6$; chất nội chuẩn tetramethylsilane (TMS).
    • Phổ khối lượng (MS): Máy Agilent 6310 Ion Trap (chế độ ESI-MS) và máy MS-5989B (chế độ EI-MS), dung môi đo $\text{CHCl}_3$.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh thực tiễn của ngành dược phẩm Việt Nam, sự phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu steroid nhập khẩu, phân tích ưu thế kinh tế - công nghệ khi chuyển dịch từ nguồn nguyên liệu truyền thống (diosgenin, solasodine) sang nguồn sterol thực vật (phytosterol). Xác định mục tiêu chế tạo các dẫn xuất corticoid qua trung gian 9α-OH AD và vạch ra 6 nhóm nhiệm vụ kỹ thuật cụ thể.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết hệ thống các tài liệu chuyên ngành về hóa học steroid, tập trung vào các vấn đề:

  1. Tổng quan các phương pháp tổng hợp mạch bên pregnane: Phân tích bản chất hóa học, cơ chế phản ứng và hiệu quả của các con đường cyanohydrin, ngưng tụ acetylene, ngưng tụ Knoevenagel, phản ứng Wittig/Horner–Wadsworth–Emmons, Reformatskii và phương pháp "tác nhân acetyl che chắn" (alkyl/aryl vinyl ether, dithioacetal).
  2. Phương pháp bảo vệ nhóm 3- và 20-ketosteroid: So sánh hiệu quả giữa ketal hóa vòng 5 cạnh (ethylene glycol) và vòng 6 cạnh (neopentyl glycol), phương pháp dimethylketal và enol ether. Luận án chỉ ra vòng 6 cạnh tạo bởi neopentyl glycol có độ bền nhiệt động vượt trội, nâng hiệu suất phản ứng lên đến 98%.
  3. Tạo lập liên kết đôi $\Delta^{9(11)}$, $\Delta^{16(17)}$ và $\Delta^{1(2)}$: Đánh giá tác nhân dehydrat hóa ($\text{POCl}_3/\text{Py}$, $\text{SOCl}_2/\text{Py}$, $\text{CH}_3\text{SO}_2\text{Cl}/\text{SO}_2$, acid vô cơ $\text{H}_3\text{PO}_4$) và phương pháp dehydro hóa đưa nối đôi $\Delta^{1(2)}$ bằng vi sinh (Arthrobacter simplex) so với phương pháp hóa học dùng DDQ hoặc $\text{SeO}_2$.
  4. Tổng hợp mạch bên corticoid và gắn nhóm chức 16β-methyl-17α-hydroxy: Khảo sát các phản ứng chuyển hóa nhóm 17-ethynyl, phản ứng 21-iodo hóa/acetoxy hóa trực tiếp từ 20-ketopregnane, phản ứng oxy hóa bằng tác nhân iod siêu hóa trị $\text{PhI(OAc)}_2/\text{KOH}/\text{MeOH}$, và phương pháp epoxy hóa nối đôi $\Delta^{16(17)}$ kết hợp mở vòng bằng tác nhân cơ kim Grignard.

Chương 2: Thực nghiệm

Mô tả chi tiết các bước quy trình, nồng độ, tỷ lệ mol, dung môi và các điều kiện phân lập cho từng phản ứng tổng hợp:

  • Tổng hợp androsta-4,9(11)-diene-3,17-dione ($\Delta^9$-AD) (2): Dehydrat hóa 9α-OH AD (1) (90,6 mg; 0,30 mmol) trong $1,68\text{ ml }\text{CHCl}_3$ với $0,33\text{ ml }\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 85%}$, hồi lưu trong 2,0 giờ. Rửa dịch chiết bằng nước đến $\text{pH} = 7$, cất thu hồi dung môi và kết tinh lại trong ethyl acetate (EtOAc).
  • Cộng hợp nitrile theo phương pháp cyanohydrin (hợp chất 3):
    • Sử dụng KCN: 17-ketosteroid phản ứng với KCN (tỷ lệ 0,35 mmol cơ chất / 1,36 mmol KCN) trong MeOH có mặt AcOH ở nhiệt độ phòng.
    • Sử dụng acetone cyanohydrin: 17-ketosteroid (0,35 mmol) phản ứng với acetone cyanohydrin (0,70 mmol) trong MeOH có mặt dung dịch NaOH 3,3M ở 36–40°C trong 1,5–4,0 giờ; kết tinh sản phẩm (3) bằng EtOAc.
  • Bảo vệ nhóm carbonyl bằng neopentyl glycol: Cho 3-keto (hoặc 20-keto) steroid (0,30 mmol) phản ứng với neopentyl glycol (1,41 mmol) trong $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ và triethyl orthoformate ($0,92\text{ ml}$), xúc tác p-TSA (92,0 mg) ở 0–5°C trong 8 giờ dưới dòng khí $\text{N}_2$ khan. Phân lập và tinh chế thu được 17α-hydroxy-3,3-(2,2-dimethyl propylenedioxy)-17β-cyanoandrosta-5,9(11)-diene (4a) và 3,20-bis-(2,2-dimethyl propylenedioxy)-16α,17α-epoxypregna-5,9(11)-diene (10a).
  • Quy trình tổng hợp các dẫn xuất tiếp theo: Luận án trình bày quy trình chi tiết cho việc bảo vệ bằng ethylene glycol (hợp chất 10b, 10c), methyl hóa bằng hợp chất cơ magnesi/cơ lithi, hydrat hóa ethynyl, epoxy hóa bằng $\text{H}_2\text{O}_2/\text{kiềm}$, tạo nối đôi $\Delta^{1(2)}$ bằng DDQ (hợp chất 13a, 13b), acetoxy hóa vị trí C-21 qua dẫn xuất iod (hợp chất 16a, 16b, 17), halohydrin hóa bằng NBS/NBA (hợp chất 18a, 18b, 18c), mở vòng epoxy bằng acid halogenhydric (hợp chất 21'', 24a, 24b) và dehalogen hóa điều chế prednisolone acetate (20).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này đi sâu biện luận cơ chế hóa học, phân tích cấu trúc phổ và đánh giá hiệu suất của từng giai đoạn:

  1. Phản ứng dehydrat hóa 9α-OH AD: Đánh giá hiệu quả của xúc tác $\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 85%}$ trong dung môi $\text{CHCl}_3$, chứng minh tính chọn lọc tạo liên kết đôi $\Delta^{9(11)}$, triệt tiêu hoàn toàn sự tạo thành đồng phân phụ $\Delta^{8(9)}$ vốn không thể tách bằng kết tinh thông thường.
  2. So sánh hai con đường xây dựng mạch bên pregnane:
    • Phương pháp cyanohydrin: Ưu điểm là nguồn tác nhân rẻ tiền, phản ứng cộng hợp có tính chọn lọc cao; tuy nhiên nhược điểm là đòi hỏi phải bảo vệ nhóm 3-keto (bằng ketal neopentyl glycol hoặc ethylene glycol) trước khi cho phản ứng với tác nhân cơ kim (MeLi, MeMgBr).
    • Phương pháp acetylene: Ưu điểm vượt trội là không cần bảo vệ nhóm 3-keto (do 3-keto- $\Delta^4$ tự bảo vệ dưới dạng muối enolate bền vững trong môi trường base mạnh t-BuOK), hiệu suất cộng hợp đạt trên 90%. Quá trình epimer hóa C-17 được thực hiện qua trung gian 17-nitrooxy hoặc phản ứng trực tiếp.
  3. Phương pháp gắn cấu trúc 16β-methyl-17α-hydroxypregnane: Khẳng định tính chọn lọc lập thể cao khi đi qua trung gian 16α,17α-epoxy rồi mở vòng bằng methyl Grignard, được minh chứng rõ nét qua phổ tương tác không gian NOESY giữa nhóm proton $\text{CH}_3\text{-18}$, $\text{CH}_3\text{-21}$ và proton nhóm methyl tại C-16.
  4. Phương pháp tạo lập liên kết đôi $\Delta^{1(2)}$: Tối ưu hóa phản ứng dehydro hóa bằng DDQ trong benzene hoặc dioxane khan (1,2–1,5 đương lượng), hồi lưu nhiệt, hiệu suất đạt 70–80%, khắc phục nhược điểm nồng độ cơ chất thấp của phương pháp vi sinh.
  5. Tổng hợp mạch bên corticoid: So sánh quy trình oxy hóa một giai đoạn sử dụng tác nhân iod siêu hóa trị $\text{PhI(OAc)}_2$ với quy trình đi qua trung gian 21-monoiodide/21,21-diiodide bằng $\text{I}_2/\text{kiềm}$ rồi acetoxy hóa bằng KOAc. Phương pháp qua trung gian iod cho hiệu suất chuyển hóa ổn định và khả thi ở quy mô điều chế.
  6. Đề xuất hai sơ đồ tổng hợp hoàn chỉnh:
    • Sơ đồ 1: Tổng hợp hydrocortisone acetate và prednisolone từ 9α-OH AD.
    • Sơ đồ 2: Tổng hợp betamethasone và beclomethasone từ 9α-OH AD.
Hợp chất mã số Tên gọi hóa học đầy đủ Phương pháp / Tác nhân chính Đặc trưng phổ xác nhận
(2) Androsta-4,9(11)-diene-3,17-dione ($\Delta^9$-AD) Dehydrat hóa 9α-OH AD bằng $\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 85%}$ / $\text{CHCl}_3$ $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.1)
(3) 17α-hydroxy-17β-cyanoandrosta-4,9(11)-diene-3-one Cyanohydrin hóa ($\text{KCN}/\text{AcOH}$ hoặc acetone cyanohydrin) ESI-MS (Hình 3.2)
(4a) 17α-hydroxy-3,3-(2,2-dimethyl propylenedioxy)-17β-cyanoandrosta-5,9(11)-diene Ketal hóa bằng neopentyl glycol, xúc tác p-TSA $^1\text{H}$-NMR, IR
(4b) 3,3-(1,2-ethyleneketal)-17β-cyanoandrosta-5,9(11)-diene-17α-ol Ketal hóa bằng ethylene glycol $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.3)
(5) 3,3-(2,2-dimethyl propylenedioxy)-17-cyanoandrosta-5,9(11),16(17)-triene Dehydrat hóa nhóm 17α-OH bằng $\text{POCl}_3/\text{Py}$ IR, $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.4, 3.5)
(6b) Pregna-4,9(11)-diene-17α-ol-3,20-dione Methyl hóa cơ kim (cyanohydrin) hoặc hydrat hóa nhóm 17-ethynyl IR, $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.7, 3.10)
(7) 17α-ethynyl-17β-hydroxyandrosta-4,9(11)-diene-3-one Cộng hợp acetylene có mặt t-BuOK $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.8)
(8) 17β-ethynyl-17α-hydroxyandrosta-4,9(11)-diene-3-one Epimer hóa qua trung gian ester 17-ONO2 (7') IR (Hình 3.9)
(10a) 3,20-bis-(2,2-dimethyl propylenedioxy)-16α,17α-epoxypregna-5,9(11)-diene Ketal hóa bảo vệ nhóm 3- và 20-keto bằng neopentyl glycol $^1\text{H}$-NMR
(10b) 3,20-bis-(1,2-ethyleneketal)-16α,17α-epoxypregna-5,9(11)-diene Ketal hóa bảo vệ bằng ethylene glycol $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.12)
(11a) 3,20-bis-(2,2-dimethyl propylenedioxy)-16β-methylpregna-5,9(11)-diene-17α-ol Mở vòng 16α,17α-epoxy bằng $\text{CH}_3\text{MgBr}$ $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.14)
(12) 16β-methyl-17α-hydroxypregna-4,9(11)-diene-3,20-dione Thủy phân giải phóng nhóm bảo vệ ketal $^1\text{H}$-NMR, NOESY (Hình 3.15, 3.16)
(13a) 16β-methyl-17α-hydroxypregna-1,4,9(11)-triene-3,20-dione Dehydro hóa $\Delta^{1(2)}$ bằng tác nhân DDQ $^1\text{H}$-NMR
(13b) Pregna-1,4,9(11)-triene-17α,21-diol-3,20-dione-21-acetate Dehydro hóa $\Delta^{1(2)}$ bằng DDQ $^1\text{H}$-NMR, DEPT (Hình 3.18, 3.19)
(15) 16α,17α-epoxypregna-4,9(11)-diene-21-ol-3,20-dione Oxy hóa C-21 bằng $\text{PhI(OAc)}_2$ $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.20)
(16b) 21-acetoxy-16β-methylpregna-1,4,9(11)-triene-17α,21-diol-3,20-dione Iodo hóa C-21 rồi thế bằng KOAc $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.21)
(17) 21-acetoxypregna-4,9(11)-diene-17α,21-diol-3,20-dione 21-Iodo hóa trực tiếp qua dẫn xuất monoiodide ESI-MS (Hình 3.22)
(18b) 9α-bromo-16β-methyl-11β,17α,21-trihydroxypregna-1,4-diene-3,20-dione-21-acetate Halohydrin hóa nối đôi $\Delta^{9(11)}$ bằng NBS $^{13}\text{C}$-NMR (Hình 3.23)
(19a) 9β,11β-epoxy-16β-methyl-17α,21-dihydroxypregna-4-en-3,20-dione Dehalohydrin hóa đóng vòng epoxy $^1\text{H}$-NMR (Hình 3.25)
(20) Prednisolone acetate Khử halogen (dehalogen hóa) bằng $\text{HSnBu}_3$ ESI-MS (Hình 3.26)

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và phương pháp

  1. Hoàn thiện phương pháp chuyển hóa chọn lọc 9α-OH AD: Tối ưu hóa điều kiện phản ứng dehydrat hóa 9α-OH AD thành androsta-4,9(11)-diene-3,17-dione ($\Delta^9$-AD) bằng acid phosphoric ($\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 85%}$) trong $\text{CHCl}_3$, đạt độ chọn lọc cao và ngăn ngừa sự hình thành đồng phân $\Delta^{8(9)}$-AD.
  2. So sánh định lượng hai con đường tổng hợp mạch bên pregnane: Đưa ra hệ thống thực nghiệm so sánh phương pháp cyanohydrin và phương pháp acetylene từ 17-ketosteroid. Luận án khẳng định phương pháp acetylene có ưu thế vượt trội khi nhóm 3-keto được tự bảo vệ dưới dạng enolate trong môi trường kiềm mạnh (t-BuOK), rút ngắn số giai đoạn bảo vệ/giải phóng nhóm chức so với phương pháp cyanohydrin.
  3. Ứng dụng bảo vệ nhóm carbonyl bằng neopentyl glycol: Chứng minh ketal vòng 6 cạnh tạo bởi neopentyl glycol có độ bền vượt trội so với vòng 5 cạnh (ethylene glycol), giúp quá trình alkyl hóa và mở vòng epoxy diễn ra với hiệu suất cao (đạt tới 98%).
  4. Kiểm soát lập thể tâm C-16 và C-17: Thiết lập điều kiện phản ứng gắn đồng thời nhóm 16β-methyl và 17α-hydroxy thông qua trung gian 16α,17α-epoxy kết hợp mở vòng bằng $\text{CH}_3\text{MgBr}$, được khẳng định chính xác bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều NOESY.
  5. Đề xuất hai sơ đồ tổng hợp toàn phần các corticoid quan trọng:
    • Sơ đồ điều chế hydrocortisone acetate và prednisolone từ 9α-OH AD.
    • Sơ đồ điều chế betamethasone và beclomethasone từ 9α-OH AD.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Các quy trình tổng hợp trong luận án được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm (milligram đến vài gram). Một số phản ứng sử dụng các dung môi và tác nhân cần kiểm soát nghiêm ngặt về an toàn môi trường và cháy nổ (như DDQ, KCN, $\text{HSnBu}_3$, hệ dung môi chứa clo).
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Nâng cấp quy mô phản ứng (scale-up) từ quy mô phòng thí nghiệm lên quy mô pilot (bán công nghiệp).
    • Nghiên cứu thay thế các dung môi hữu cơ độc hại bằng các hệ dung môi thân thiện hơn với môi trường (hóa học xanh).
    • Nghiên cứu kết hợp các tác nhân xúc tác bất đối xứng hoặc xúc tác sinh học ở các bước chuyển hóa phức tạp nhằm giảm thiểu phụ phẩm và nâng cao hiệu suất tổng của sơ đồ.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Hóa Hữu cơ, Hóa Dược: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về kỹ thuật tổng hợp hữu cơ phức tạp trên khung steroid, cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn và bộ dữ liệu phổ đầy đủ ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, NOESY, FT-IR, ESI-MS, EI-MS) của 25 hợp chất steroid trung gian và sản phẩm cuối.
  • Đối với các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học và công nghệ khả thi để phát triển dây chuyền bán tổng hợp hoạt chất corticoid trong nước từ nguồn nguyên liệu phytosterol đậu tương sẵn có, góp phần hiện thực hóa mục tiêu tự chủ nguyên liệu hóa dược quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguyên liệu đầu 9α-OH AD được tạo ra từ nguồn nào và có ưu điểm gì so với diosgenin truyền thống?

9α-OH AD được sản xuất bằng phương pháp chuyển hóa vi sinh từ androstenedione (AD), vốn được tạo ra từ sterol thực vật (phytosterol) thu hồi từ phế thải chế biến dầu đậu tương hoặc công nghiệp giấy với hiệu suất đạt 82,9% và độ tinh khiết 98,0%. Ưu điểm của phytosterol là nguồn cung dồi dào, tái tạo liên tục từ phế phụ phẩm công nghiệp, không tốn đất nông nghiệp và chu kỳ canh tác dài năm như cây chứa diosgenin (Dioscorea) hoặc solasodine (Solanum).

2. Vì sao phản ứng dehydrat hóa 9α-OH AD cần sử dụng xúc tác acid phosphoric ($H_3PO_4$) thay vì các acid khác?

Quá trình dehydrat hóa 9α-OH AD thông thường rất dễ tạo ra đồng phân phụ không mong muốn là androsta-4,8(9)-diene-3,17-dione ($\Delta^{8(9)}$-AD). Đồng phân này có hệ số dịch chuyển $R_f$ trên bản mỏng TLC tương tự sản phẩm chính $\Delta^{9(11)}$-AD và không thể loại bỏ bằng phương pháp kết tinh thông thường. Việc sử dụng $\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 85%}$ trong dung môi $\text{CHCl}_3$ ở điều kiện hồi lưu giúp phản ứng diễn ra chọn lọc cao, tạo thành $\Delta^{9(11)}$-AD mà không sinh ra đồng phân $\Delta^{8(9)}$.

3. Phương pháp acetylene có điểm gì vượt trội hơn phương pháp cyanohydrin khi tạo mạch bên pregnane từ 17-ketosteroid?

Trong phương pháp cyanohydrin, nhóm 3-keto- $\Delta^4$ bắt buộc phải qua giai đoạn bảo vệ (bằng neopentyl glycol hoặc ethylene glycol) để tránh bị tác nhân cơ kim (MeLi, MeMgBr) tấn công ở bước alkyl hóa tiếp theo. Ngược lại, ở phương pháp acetylene, nhóm 3-keto- $\Delta^4$ tự bảo vệ dưới dạng muối enolate bền vững trong môi trường base mạnh (t-BuOK), cho phép phản ứng cộng hợp acetylene diễn ra trực tiếp vào C-17 với hiệu suất trên 90% mà không cần thêm các bước bảo vệ và giải phóng nhóm 3-keto.

4. Bằng cách nào tác giả chứng minh được cấu hình không gian 16β-methyl của hợp chất (12)?

Cấu hình không gian của nhóm 16β-methyl trên hợp chất 16β-methyl-17α-hydroxypregna-4,9(11)-diene-3,20-dione (12) được xác nhận bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy). Kết quả phổ chỉ ra có sự tương tác hiệu ứng NOE rõ rệt qua không gian giữa các proton của nhóm $\text{CH}_3\text{-18}$ và $\text{CH}_3\text{-21}$ với các proton của nhóm methyl tại vị trí C-16, khẳng định nhóm methyl định hướng ở vị trí liên kết β.

5. Tác nhân nào được sử dụng để đưa nối đôi $\Delta^{1(2)}$ vào khung steroid và ưu điểm so với phương pháp vi sinh là gì?

Tác nhân hóa học được sử dụng là DDQ (2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone) với tỷ lệ 1,2–1,5 đương lượng trong môi trường benzene hoặc dioxane khan hồi lưu nhiệt. Phương pháp này cho hiệu suất sản phẩm 3-keto-$\Delta^{1,4}$ đạt 70–80%, khắc phục được hạn chế cố hữu của phương pháp vi sinh dùng chủng Arthrobacter simplex (vốn đòi hỏi nồng độ cơ chất rất thấp từ 0,18–0,22 g/l, thời gian nuôi cấy dài và tiêu tốn năng lượng đông khô tế bào).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Thị Diệp đã nghiên cứu thành công hệ thống các phương pháp hóa học nhằm chuyển hóa 9α-hydroxyandrostenedione (9α-OH AD) thành các dẫn xuất pregnane và mạch bên corticoid. Tác giả đã giải quyết các mắt xích then chốt trong hóa học steroid bao gồm dehydrat hóa chọn lọc vị trí 9(11), so sánh tối ưu hai con đường tạo mạch pregnane (cyanohydrin và acetylene), kiểm soát cấu hình lập thể nhóm 16β-methyl-17α-hydroxy, tạo nối đôi $\Delta^{1(2)}$ bằng DDQ và đưa nhóm chức 21-acetoxy. Trên cơ sở đó, luận án đã đề xuất hai sơ đồ hoàn chỉnh để tổng hợp các dược phẩm corticoid thiết yếu gồm hydrocortisone acetate, prednisolone, betamethasone và beclomethasone từ nguồn phytosterol phế phụ phẩm của Việt Nam.