Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây Codonopsis sp trong hệ thống bioreactor

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây codonopsis sp trong hệ thống bioreactor, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Đình Trọng
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU. MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu tổng quát
• 1.3. Mục tiêu cụ thể
• 1.4. Nội dung nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa khoa học
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây Sâm dây
• 1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý
• 1.1.2. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây
• 1.1.3. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Sâm dây
• 1.1.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ cộng đồng
• 1.1.4.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào
• 1.1.4.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật
• 1.1.4.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
• 1.1.4.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ
• 1.1.4.5. Ứng dụng hệ thống bioreactor trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ
• 1.1.4.6. Ảnh hưởng của elicitor đến khả năng tích luỹ các chất thứ cấp
• 1.1.4.7. Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính và định lượng saponin
• 1.1.4.7.1. Phương pháp tách chiết
• 1.1.4.7.2. Một số phương pháp định tính saponin
• 1.1.4.7.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng saponin tổng số
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị và hoá chất nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.3.2. Đánh giá các dòng chuyển gen bằng phương pháp PCR
• 2.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh của các dòng rễ tơ Sâm dây
• 2.3.4. Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy
• 2.3.5. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường thạch
• 2.3.6. Xác định loại môi trường lỏng thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ
• 2.3.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ chất khô trong rễ tơ Sâm dây
• 2.3.8. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp
• 2.3.9. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor
• 2.3.10. Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ
• 2.3.11. Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ
• 2.3.12. Phương pháp tính toán
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kiểm tra đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR
• 3.2. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây
• 3.3. Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi cấy
• 3.4. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường đặc
• 3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ trên các môi trường lỏng khác nhau
• 3.6. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ hợp chất thứ cấp trong rễ tơ Sâm dây
• 3.7. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất tại Viện Công nghệ sinh học
• 3.8. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các mô hình bioreactor
• 3.9. Kết quả bán định lượng hàm lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ tơ, so sánh với sâm tự nhiên
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1. Kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây Codonopsis sp

Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây Codonopsis sp trong bioreactor đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Cây sâm dây, với nhiều tác dụng dược lý, đang được khai thác để sản xuất các hợp chất có giá trị. Việc nuôi cấy sinh khối rễ tơ giúp tạo ra nguồn nguyên liệu dược phẩm bền vững, đồng thời bảo tồn đa dạng sinh học.

1.1. Giới thiệu về cây sâm dây Codonopsis sp

Cây sâm dây hay Đẳng sâm, có tên khoa học là Codonopsis sp., là một loài thực vật quý hiếm thuộc họ Hoa chuông. Chúng có nguồn gốc từ Đông Bắc châu Á và được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe.

1.2. Tầm quan trọng của việc nuôi cấy sinh khối

Việc nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây không chỉ giúp sản xuất dược phẩm mà còn góp phần bảo tồn loài cây này. Công nghệ nuôi cấy giúp giảm thiểu việc khai thác tự nhiên, bảo vệ nguồn gen quý hiếm.

II. Thách thức trong nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như sự không đồng nhất trong tăng trưởng tế bào và sản xuất chất chuyển hóa cần được giải quyết để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy.

2.1. Vấn đề về sự đồng nhất trong tăng trưởng

Sự không đồng nhất trong tăng trưởng của các dòng rễ tơ sâm dây có thể ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả sản xuất. Cần có các phương pháp đánh giá và điều chỉnh để cải thiện tình trạng này.

2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy có vai trò quan trọng trong sự phát triển của rễ tơ. Việc tối ưu hóa các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

III. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây trong bioreactor

Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây trong bioreactor đã được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi. Hệ thống bioreactor cho phép kiểm soát tốt các điều kiện nuôi cấy, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

3.1. Thiết kế hệ thống bioreactor

Hệ thống bioreactor cần được thiết kế phù hợp với đặc điểm sinh trưởng của rễ tơ. Các yếu tố như kiểu sục khí, tốc độ khuấy trộn và thể tích nuôi cấy cần được tối ưu hóa.

3.2. Quy trình nuôi cấy rễ tơ

Quy trình nuôi cấy rễ tơ bao gồm các bước từ chuẩn bị môi trường, cấy giống đến thu hoạch. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng sinh khối.

IV. Ứng dụng thực tiễn của sinh khối rễ tơ sâm dây Codonopsis sp

Sinh khối rễ tơ sâm dây Codonopsis sp có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp dược phẩm. Các hợp chất chiết xuất từ rễ tơ có thể được sử dụng để sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng.

4.1. Chiết xuất và định lượng hoạt chất

Quá trình chiết xuất các hoạt chất từ sinh khối rễ tơ cần được thực hiện theo các phương pháp khoa học để đảm bảo hiệu quả và độ tinh khiết của sản phẩm.

4.2. Tiềm năng thị trường của sản phẩm

Sản phẩm từ sinh khối rễ tơ sâm dây có tiềm năng lớn trên thị trường dược phẩm. Nhu cầu về các sản phẩm tự nhiên và an toàn đang ngày càng tăng cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây Codonopsis sp trong bioreactor mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và ứng dụng công nghệ hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện quy trình nuôi cấy và mở rộng ứng dụng của sinh khối rễ tơ trong các lĩnh vực khác nhau.

5.2. Tác động đến bảo tồn đa dạng sinh học

Nghiên cứu này không chỉ giúp sản xuất dược phẩm mà còn góp phần bảo tồn đa dạng sinh học của loài sâm dây, đảm bảo nguồn tài nguyên quý giá cho thế hệ tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sâm dây (Codonopsis sp.), còn được biết đến với tên gọi Đảng sâm, thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae), là cây thuốc quý chứa nhiều hợp chất sinh học giá trị cao như saponin triterpenoid, polysaccharide, hợp chất phenolic và sterol. Tại Việt Nam, nguồn dược liệu tự nhiên phân bố tập trung ở các vùng núi cao Tây Nguyên như Kon Tum và các tỉnh miền núi phía Bắc. Do giá trị dược lý vượt trội trong việc tăng cường hệ miễn dịch, bổ huyết, kháng viêm và chống oxy hóa, loài cây này đã bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng và được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam từ năm 1996, tái khẳng định bảo tồn nghiêm ngặt năm 2007. Phương pháp nuôi cấy mô truyền thống để tạo sinh khối tế bào thường phải bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, dễ để lại tồn dư hóa chất trong sản phẩm dược phẩm.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm của học viên Nguyễn Đình Trọng, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Chu Hoàng Hà tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật phối hợp cùng Phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), đã giải quyết bài toán cấp thiết trên. Nghiên cứu thực hiện từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015 nhằm xây dựng cơ sở khoa học và thực nghiệm nuôi cấy sinh khối rễ tơ Sâm dây sạch thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trong hệ thống bioreactor. Mục tiêu cụ thể gồm: sàng lọc dòng rễ tơ sinh trưởng ổn định từ 23 dòng ban đầu, tối ưu hóa kích thước mẫu cấy và môi trường dinh dưỡng, khảo sát ảnh hưởng của elicitor Salicylic Acid (SA), và bước đầu định lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ tơ so sánh với củ Sâm dây tự nhiên 1 đến 3 năm tuổi thu thập tại Kon Tum. Kết quả nghiên cứu mở ra giải pháp tạo nguồn nguyên liệu sạch với hàm lượng chất khô đạt trên 10%, phục vụ hiệu quả cho ngành sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết chuyển gen thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn đất Gram âm Agrobacterium rhizogenes mang Ri-plasmid (Root-inducing plasmid). Đoạn T-DNA từ plasmid này khi tích hợp vào hệ gen tế bào thực vật sẽ mang các gen tổng hợp auxin nội sinh (tms1, tms2) và cụm gen rol (rolA, rolB, rolC, rolD). Trong đó, gen rolB đóng vai trò chủ chốt kích hoạt sự nhạy cảm của tế bào đối với auxin nội sinh, thúc đẩy sự phân chia và biệt hóa mô sẹo thành kiểu hình rễ tơ phân nhánh mạnh mẽ mà không cần bổ sung bất kỳ chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh nào.

Song song đó, đề tài vận dụng lý thuyết kích kháng thực vật (elicitation) với việc sử dụng Salicylic Acid (SA) như một phân tử tín hiệu ngoại sinh. Khi tiếp nhận SA qua thụ thể màng, tế bào kích hoạt chuỗi truyền tín hiệu MAPK, sản sinh các gốc oxy hóa phản ứng (ROS) và khởi động quá trình biểu hiện các gen phòng vệ, kích thích mạnh mẽ con đường biến dưỡng thứ cấp để tích lũy saponin. Các khái niệm nền tảng trong nghiên cứu gồm: kiểu hình rễ tơ (hairy root phenotype), hệ thống phản ứng sinh học sủi bọt (airlift balloon-type bioreactor), chất kích kháng sinh học và phi sinh học (elicitor), và định lượng quang phổ UV-Vis dựa trên đương lượng acid oleanolic.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của luận văn bắt nguồn từ 23 dòng rễ tơ chuyển gen và các mẫu củ Sâm dây tự nhiên 1, 2, 3 năm tuổi thu thập trực tiếp tại tỉnh Kon Tum làm đối chứng. Thiết kế nghiên cứu áp dụng phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên có kiểm soát với cỡ mẫu 8 dòng rễ tơ sinh trưởng ổn định nhất (ký hiệu T1 đến T8), mỗi công thức thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần độc lập nhằm đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại cao.

Phương pháp nghiên cứu tích hợp đa dạng các kỹ thuật chuyên sâu:

• Kỹ thuật sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB và thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen rolA (kích thước 400 bp), rolB (800 bp), rolC (500 bp) trên hệ thống GeneAmp PCR System 9700.
• Kỹ thuật nuôi cấy in vitro: Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ; khảo sát 5 dải kích thước mẫu cấy (0,25 cm; 0,5 cm; 1,0 cm; 1,5 cm; 2,0 cm); thử nghiệm 4 môi trường dinh dưỡng cơ bản gồm MS, Gamborg B5, WPM, SH bổ sung 30 g/l sucrose; khảo sát 6 nồng độ elicitor SA (0 µM, 50 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM, 250 µM) trong điều kiện phòng tối ở 25 ± 2°C, độ ẩm 70%, lắc 90 vòng/phút.
• Kỹ thuật nuôi cấy bioreactor và hóa sinh: Nuôi cấy nhân sinh khối trong bioreactor sủi bọt 5 lít; chiết xuất saponin bằng dung môi methanol qua hệ thống cô quay chân không ở 50°C; đo quang phổ hấp thụ UV-Vis tại bước sóng 538 nm với thuốc thử vanillin 0,08% và acid sulfuric 75%. Toàn bộ dữ liệu được phân tích phương sai ANOVA trên phần mềm Excel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, kiểm tra PCR đã xác nhận 100% trong số 8 dòng rễ tơ sàng lọc (T1 đến T8) đều mang đầy đủ ba đoạn gen chuyển rolA (400 bp), rolB (800 bp) và rolC (500 bp), tương ứng hoàn toàn với các vạch băng điện di của đối chứng dương plasmid pRi.

Thứ hai, khảo sát tốc độ sinh trưởng sau 3 tuần nuôi cấy cho thấy sự phân hóa rõ rệt thành 3 nhóm kiểu hình rễ. Dòng rễ tơ T7 đạt chỉ số tăng trưởng cao nhất với khối lượng tươi trung bình 1,693 g và khối lượng khô 182,27 mg, tương ứng hàm lượng chất khô đạt 10,78%. So với dòng thấp nhất là T3 (chỉ đạt 0,367 g khối lượng tươi và 37,66 mg khối lượng khô), dòng T7 có sinh khối tươi cao gấp 4,61 lần (tăng trưởng hơn 361%).

Thứ ba, kích thước mẫu cấy 1,0 cm mang đỉnh sinh trưởng chứng minh khả năng phân nhánh tối ưu nhất với 2,7 ± 0,15 nhánh sau 2 tuần nuôi cấy, cao hơn 68,75% so với mẫu kích thước 0,25 cm (chỉ đạt 1,6 ± 0,13 nhánh). Môi trường MS lỏng không hormone thể hiện ưu thế vượt trội về tốc độ sinh trưởng và tích lũy sinh khối so với các môi trường B5, WPM và SH.

Thứ tư, xử lý elicitor Salicylic Acid ở nồng độ từ 100 µM đến 150 µM giúp rễ tơ tích lũy chất khô tối ưu. Khi chuyển giao sang hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu thể tích 5 lít sau 4 tuần nuôi cấy, rễ tơ phát triển đồng đều, không bị thâm hay đứt gãy, đồng thời hàm lượng saponin tổng số đạt mức xấp xỉ 3,12% khối lượng khô, tương đương và cao hơn củ sâm tự nhiên 1 đến 2 năm tuổi thu thập tại Kon Tum.

Thảo luận kết quả

Sự vượt trội của dòng T7 được giải thích là do vị trí gắn kết thuận lợi của đoạn T-DNA vào các vùng nhiễm sắc chất hoạt động phiên mã mạnh trong hệ gen tế bào thực vật, giúp gen rolB biểu hiện tối đa và kích hoạt liên tục sự phân chia tế bào mô phân sinh rễ. Dữ liệu này được thể hiện rõ nét qua bảng thống kê khối lượng tươi/khô và các biểu đồ cột so sánh tốc độ sinh trưởng giữa 8 dòng rễ tơ.

Việc ứng dụng bioreactor sủi bọt dạng cầu thể hiện ưu điểm vượt trội so với bioreactor cánh khuấy truyền thống nhờ loại bỏ hoàn toàn lực xé cơ học (shear stress) gây đứt gãy hệ thống lông hút mỏng manh của rễ tơ. Luồng khí sục từ đáy bình tạo ra sự đảo trộn tuần hoàn nhẹ nhàng và cung cấp oxy hòa tan dồi dào, giúp rễ tơ hấp thụ tối đa chất dinh dưỡng. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các nghiên cứu của Choi và cộng sự trên rễ nhân sâm (Panax ginseng) và Taxus cuspidata. Về phương diện tích lũy hoạt chất, tác động của SA đã kích hoạt các enzyme chuyển hóa thứ cấp, giúp sinh khối rễ tơ tích lũy hàm lượng saponin cao chỉ sau 28 ngày nuôi cấy in vitro, thay vì phải mất 2 đến 3 năm canh tác ngoài tự nhiên với nhiều rủi ro thời tiết và sâu bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và nâng cao hiệu quả ứng dụng thực tiễn của quy trình nhân sinh khối rễ tơ Sâm dây, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị then chốt:

1. Chuẩn hóa quy trình vi nhân giống dòng rễ tơ T7: Ban hành tài liệu quy trình thao tác chuẩn (SOP) đối với mẫu cấy rễ tơ kích thước 1,0 cm trên môi trường MS lỏng cơ bản (pH 5,8), đảm bảo hệ số nhân sinh khối đạt trên 8 lần sau mỗi chu kỳ 21 ngày, do Phòng Công nghệ tế bào thực vật chủ trì hoàn thiện trong vòng 6 tháng.
2. Mở rộng quy mô nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 đến 100 lít: Tiếp tục thử nghiệm các thông số kỹ thuật tối ưu về lưu lượng sục khí (0,1 - 0,3 vvm), nhiệt độ ổn định ở 25°C và nồng độ oxy hòa tan (DO), đặt mục tiêu thu nhận 2,0 - 2,5 kg sinh khối tươi/mẻ/tháng, do các Viện nghiên cứu phối hợp với doanh nghiệp công nghệ sinh học thực hiện trong thời gian 12 đến 18 tháng.
3. Ứng dụng phác đồ kích kháng đa tầng (Multi-elicitation): Kết hợp Salicylic Acid (100 µM) với Jasmonic Acid hoặc dịch chiết nấm men ở tuần nuôi cấy thứ 3 để nâng cao hàm lượng saponin tổng số vượt mức 4,0% khối lượng khô, do nhóm nghiên cứu hóa sinh dược liệu triển khai trong 9 tháng.
4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và phân tích chuyên sâu các saponin đơn lẻ: Áp dụng phương pháp HPLC-MS để định lượng chính xác các hợp chất saponin chủ chốt như Lancemaside A, kiểm nghiệm độc tính tế bào và lập hồ sơ công bố chất lượng nguyên liệu đạt chuẩn Dược điển, do các cơ quan quản lý dược phẩm và viện chuyên ngành thực hiện trong lộ trình 24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo học thuật và ứng dụng công nghệ giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học: Tiếp cận hệ thống dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về cơ chế biến nạp gen bằng Agrobacterium rhizogenes, kỹ thuật kiểm tra biểu hiện gen rol bằng PCR và phương pháp thiết kế mô hình nuôi cấy rễ tơ in vitro.
2. Kỹ sư công nghệ lên men và nuôi cấy tế bào thực vật: Nắm bắt các thông số vận hành kỹ thuật chi tiết của hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu, giải quyết triệt để vấn đề cung cấp oxy hòa tan và triệt tiêu lực xé cơ học trong nuôi cấy sinh khối lỏng.
3. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Tham khảo giải pháp công nghệ sản xuất nguyên liệu saponin sạch, đồng nhất, không tồn dư hóa chất kích thích sinh trưởng, rút ngắn chu kỳ thu hoạch từ 3 năm ngoài đồng ruộng xuống còn 4 tuần trong phòng thí nghiệm.
4. Cơ quan quản lý tài nguyên và bảo tồn nguồn gen dược liệu: Sử dụng nghiên cứu như một case study điển hình về công nghệ bảo tồn ex situ nguồn gen thực vật quý hiếm trong Sách Đỏ, giảm thiểu áp lực khai thác cạn kiệt tài nguyên rừng tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

Nuôi cấy rễ tơ Sâm dây có cần bổ sung hormone kích thích sinh trưởng không?
Không. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chuyển đoạn T-DNA mang các gen rol (đặc biệt là rolB) và gen sinh tổng hợp auxin vào hệ gen thực vật. Quá trình này giúp tế bào tăng độ nhạy tự nhiên với auxin nội sinh, kích thích rễ tơ phân nhánh mạnh mẽ trên môi trường dinh dưỡng thuần khiết mà hoàn toàn không cần bổ sung hormone ngoại sinh.

Dòng rễ tơ nào đạt tốc độ tăng sinh khối tốt nhất trong nghiên cứu?
Qua đánh giá 8 dòng rễ tơ chuyển gen, dòng T7 cho năng suất cao nhất sau 3 tuần nuôi cấy với khối lượng tươi đạt 1,693 g và khối lượng khô đạt 182,27 mg (tỷ lệ chất khô 10,78%), cao hơn gấp 4,61 lần so với dòng T3 (đạt 0,367 g khối lượng tươi).

Vì sao kích thước mẫu cấy 1,0 cm lại tối ưu nhất cho sự phát triển của rễ tơ?
Đoạn rễ cắt dài 1,0 cm mang đỉnh sinh trưởng tạo ra trung bình 2,7 ± 0,15 nhánh sau 2 tuần. Kích thước nhỏ hơn (0,25 cm) làm mô rễ tổn thương quá lớn khiến khả năng đâm nhánh giảm xuống 1,6 nhánh, trong khi kích thước dài hơn (1,5 - 2,0 cm) không làm tăng thêm mật độ nhánh mới.

Bioreactor sủi bọt dạng cầu có ưu điểm gì nổi bật so với bioreactor cánh khuấy?
Bioreactor sủi bọt dạng cầu cấp khí thông qua bọt mịn giúp đảo trộn môi trường nhẹ nhàng, triệt tiêu lực xé cơ học (shear stress) gây đứt gãy hệ rễ tơ, đồng thời tăng diện tích tiếp xúc oxy hòa tan, giúp sinh khối rễ tơ phát triển đồng đều và tăng sản lượng gấp 3 lần so với dạng cánh khuấy.

Hàm lượng saponin trong rễ tơ nuôi cấy bioreactor có tương đương với sâm tự nhiên ngoài thực địa không?
Kết quả định lượng quang phổ UV-Vis ở bước sóng 538 nm chứng minh sinh khối rễ tơ dòng T7 sau 4 tuần nuôi cấy xử lý Salicylic Acid đạt hàm lượng saponin tổng số xấp xỉ 3,12% khối lượng khô, tương đương và cao hơn hàm lượng hoạt chất của củ Sâm dây tự nhiên 1 đến 3 năm tuổi thu thập tại Kon Tum.

Kết luận

Luận văn thạc sĩ của học viên Nguyễn Đình Trọng đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ Sâm dây sạch với 5 kết quả nổi bật:

• Xác nhận sự hiện diện ổn định của các gen chuyển rolA (400 bp), rolB (800 bp) và rolC (500 bp) trên 8 dòng rễ tơ bằng kỹ thuật PCR.
• Tuyển chọn thành công dòng rễ tơ ưu tú T7 đạt sinh khối tươi 1,693 g và tỷ lệ chất khô 10,78% sau 21 ngày nuôi cấy.
• Xác định môi trường MS lỏng không hormone và kích thước mẫu cấy 1,0 cm là điều kiện sinh trưởng tối ưu nhất.
• Khẳng định vai trò của Salicylic Acid (100 - 150 µM) trong việc kích thích rễ tơ tích lũy hợp chất thứ cấp.
• Làm chủ kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ trong bioreactor sủi bọt dạng cầu 5 lít, thu nhận sinh khối giàu saponin (xấp xỉ 3,12%) tương đương dược liệu tự nhiên.

Hướng phát triển tiếp theo bao gồm việc thử nghiệm hệ thống bioreactor quy mô pilot 20 - 50 lít trong vòng 12 tháng tới và phân tích chi tiết cấu trúc từng saponin đơn lẻ trong vòng 24 tháng. Các đơn vị nghiên cứu, viện chuyên ngành và doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến quy trình chuyển giao công nghệ sinh khối rễ tơ sạch hãy liên hệ trực tiếp với Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để hợp tác phát triển vùng nguyên liệu đạt chuẩn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về cây Sâm dây 1. Giới thiệu về phân bố địa lý Cây Sâm dây hay Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis sp.

là loài cây dược liệu sử dụng củ. Cây thân leo, sống lâu năm, thường phân bố tại các vùng núi cao có khí hậu mát mẻ quanh năm. Cây sâm dây thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Đảng sâm phân bố nhiều ở vùng Đông Bắc Á.

Ở Việt Nam, trong thời gian 1961-1985 viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm ở 14 tỉnh vùng núi phía Bắc; còn ở phía Nam chỉ thấy xuất hiện ở vùng Tây Nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất ở các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng. Phân loại Giới : Plantae Phân giới : Tracheobionta Nhóm lớn : Spermatophyta Nhóm : Magnoliopsida Bộ : Campanulales Họ : Campanulaceae Loài : Codonopsis sp. Cây Sâm dây (Nguồn: http://www.

Hình thái Sâm dây là cây thảo sống lâu năm, có xu hướng leo bằng thân quấn, phân nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn (Hình 1. Toàn thân có mủ trắng. Lá mọc đối, ít khi mọc so le; gốc lá hình tim; đầu lá nhọn, phiến lá mỏng hình trứng rộng, dài 3 - 8 cm, rộng 2 – 4 cm; mép nguyên lượn sóng hoặc hơi 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng khía răng cưa; mặt trên màu lục nhạt; mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông rải rác. Hoa mọc riêng ở kẽ lá.

Có cuống dài 2 – 6 cm. Đài có 5 phiến hẹp; tràng hình chuông, màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở họng; chia 5 thuỳ, nhị 5, chỉ nhị hơi dẹt; bao phấn dính gốc; bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang hình cầu, có 5 cạnh mờ, đầu bẹt, phía trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 – 2 cm, có đài tồn tại; khi chín màu tím hoặc đỏ; hạt nhiều, màu vàng nhạt, bóng. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1 – 1,7 cm.

Đầu rễ phình to, trên có nhiều vết sẹo lồi của thân cũ, phía dưới thường phân nhánh; mặt ngoài màu vàng nhạt, khi khô màu vàng xám (Đỗ Tất Lợi, 2005). Tác dụng dược lý của cây Sâm dây Tác dụng dược lý của cây Sâm dây đã được công bố rộng rãi trên thế giới thông qua nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về điều trị bệnh tiểu đường, khả năng tăng cường sức khoẻ, tác dụng với hệ tiêu hoá, tác dụng với hệ tim mạch, tác dụng đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hoà huyết áp, chống mệt mỏi, chống oxy hoá, kháng ung thư, kháng khuẩn và tăng cường hệ thống miễn dịch (Ueda et al., 2002; Li et al., 2004; Chan et al., 2009; Wang et al., 1996; Luo et al., 2007; Liu et al., 1988; Yongxu et al., 2008; He et al., 2015; He et al. Các dược tính của Codonopsis sp. có thể là do các thành phần hợp chất có trong cây có khả năng cải thiện sức khoẻ con người, bao gồm: cacbohydrates, glycosides, steroids, alkaloids, terpenes… Theo C.

Fu và cs (2007) ở loài Codonopsis lanceolata có 6 flavonoids, 4 alkaloids, 12 triterpenes và sterol, 10 loại hợp chất dễ bay hơi, 12 nguyên tố vi lượng và 17 acid amin (Fu et al. Dịch chiết Codonopsis sp. có thể ngăn ngừa và bảo vệ tế bào gan chống lại tổn thương do rượu (Bai et al., 2008; Zhang et al., 2007), và có tác dụng chống đột biến, chống oxy hoá, chống lão hoá, cải thiện khả năng miễn dịch, chống mệt mỏi, buồn ngủ, giảm đau , hạ huyết áp… (Peng et al. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Thành phầ n saponin đã làm nên công du ̣ng chın ́ h của Đảng sâm cũng như các vi ̣thuố c sâm khác.

Theo Ichikawa và cs (2009) khi phân tı́ch HPLC pha đảo kế t hơ ̣p đầ u dò khố i phổ ion hóa tia điê ̣n phát hiê ̣n trong rễ Codonopsis lanceolata chứa 7 saponin gồ m: lancemaside A, lancemaside B, lancemaside C, lancemaside E, lancemaside G, Foetidissimoside A và aster saponin Hb. Hàm lươ ̣ng lancemaside A thay đổ i từ 2,65 đế n 3,64 mg/g rễ khô đố i với mẫu Codonopsis Hàn Quố c, nhưng chı̉ đa ̣t 0,101 mg/g đố i với mẫu có nguồ n gố c từ Nhâ ̣t Bản (Ichikawa et al. Cấ u trúc hóa học saponin trong sâm dây (Ichikawa et al. Cấ u trúc hóa học 7 saponin trong Codonopsis lanceolata (Ichikawa et al., 2009) Hơ ̣p chất Aglycone R1 R2 β–Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-α- Lancemaside A I β-GlcA Rha-(12)-α-Ara β-Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-α- Lancemaside B I β-GlcA Rha-(12)-α-Ara-(13)-Glc-β β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α- Lancemaside C I β-GlcA Ara-(13)-Glc-β β- β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-α- Lancemaside E I Glc(13)- Rha-(12)-α-Ara-(13) β-GlcA β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-α- Lancemaside G II β-GlcA Rha-(12)-α-Ara-(13) Foetidissimoside A I β-GlcA β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α-Ara aster saponin Hb I β-GlcA α-Rha-(12)-α-Ara 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Joh và cs (2010) cho thấy Lancemaside A có khả năng tăng tính kháng viêm gây ra bởi các lipopolysaccharide ở trên chuột thử nghiệm.

Lancemaside A làm giảm sự hoạt động của các tác nhân gây viêm, bên cạnh đó, nhóm tác giả cho thấy hoạt chất này có khả năng kháng viêm dựa trên cơ chế kết hợp với tác nhân gây viêm là lipopoly saccharide và TLR4 (một protein tham gia vào quá trình phát hiện tác nhân gây bệnh ở người và động vật) (Joh et al. Kim và cs (2014) cho thấy Lancemaside A tách chiết từ rễ cây Codocopsis lanceolata có khả năng điều khiển cơ chế đáp ứng viêm gián tiếp qua bạch cầu và đại thực bào (Kim et al. Ngoài khả năng, tăng khả năng kháng viêm ở động vật thử nghiệm, năm 2013 Hyam và cs cho thấy Lancemaside A có khả năng gây ức chế đối với TNBS- một tác nhân gây viêm ruột kết ở chuột thí nghiệm (Hyam et al. Bên cạnh các saponin, rễ Codonopsis sp.

còn chứa các polysaccharide có dược tính quý trong điều trị một số bệnh ở người, tính gây độc đối với các khối u, tăng cường khả năng miễn dịch ở người. Hoạt động chống khối u: Polysaccharide từ C. pilosula có thể ức chế sự hoạt động của các tế bào ung thư dạ dày người và các tế bào ung thư gan (Yang et al. Một pectic polysaccharide ở rễ Codonopsis sp.

có khả năng gây độc với tế bào ung thư phổi người (Yang et al. Một nghiên cứu in vitro sử dụng tế bào HO- 8910 (ung thư buồng trứng) cho thấy một polysaccharide có tính axit có nguồn gốc từ rễ C. pilosula có thể làm giảm sự xâm nhập và di căn của các tế bào khối u thông qua việc giảm biểu hiện CD44 (Xin et al. Khả năng gây ức chế sự phát triển khối u đã được ghi nhận ở những con chuột được tiêm tế bào khối u và uống 50 hoặc 100mg/kg một trong hai polysaccharides của C.

pilosula sẽ làm ức chế khoảng 22,86 - 56,73 % sự phát triển của khối u (Xu et al. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Bảng 1. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B (Xu et al., 2012) Trọng lượng Trọng lượng Trọng lượng Tỷ lệ ức chế tuyến ức TT lá lách tương khối u (g) (%) tương đối đối (mg/g) (mg/g) NC 2,45 ± 0,24 6,01 2,16 PC 0,89b 63,67 5,12 1,90 CL 1,64b 33,06 7,34b 2,45a CH 1,06b 56,73 8,46b 2,61b CBL 1,89a 22,86 6,14 2,24 CBH 1,56b 36,33 6,35 2,31 NC: Đối chứng âm; PC: đối chứng dương; CL: CPPW1 (50 mg/kg); CH: CPPW1 (100 mg/kg); CBL: CPPW1B (50 mg/kg); CBH: CPPW1B (100 mg/kg); aP<0,05 và bP<0,01. Tác dụng trên hệ miễn dịch, chống viêm: Zhang và Wang thấy rằng 6 ngày uống polysaccharide (800 mg/kg/ngày) từ C.

pilosula có tác dụng trên chuột suy giảm miễn dịch gây ra bởi cyclophosphamide, bao gồm tăng cường hoạt động các tuyến ức, lách và các hoạt động thực bào của các đại thực bào phúc mạc và phục hồi hoạt động của α - naphthyl - acetate esterase trong tế bào lympho ngoại vi. Trong một nghiên cứu miễn dịch in vitro, một polysaccharide tan trong nước ở liều 50, 100 và 200 mg/mL có thể tăng sinh tế bào lympho kích thích bởi concanavalin A- hoặc lipopolysaccharide (LPS) (Sun, 2009). Ngoài ra, chiết xuất methanol của C. pilosula gây ức chế cảm ứng nitric oxide synthase và oxy hóa protein trong quá trình kích thích LPS ở dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 (Yoo et al.

Một nghiên cứu in vitro khác cho thấy, một polysaccharide từ C. pilosula có thể kích thích sự biệt hóa của tế bào lách trong chống viêm kích thích bởi LPS (Yongxu et al. Vai trò chống viêm còn được chứng minh khi một polysaccharide từ C. pilosula biểu hiện tăng sản xuất kháng nguyên khi dùng chung với một loại vắc-xin, cho thấy polysaccharide này có thể được sử dụng như một chất bổ trợ (Sun, 2009).

Một nghiên cứu đánh giá 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng hoạt động của các đại thực bào thực bào cho thấy một polysaccharide có khả năng tăng hoạt động thực bào, sau khi uống 50 hoặc 100mg/kg dịch chiết C. pilosula mỗi ngày, có thể làm tăng khả năng thực bào tương ứng là 15,6% và 28,7% (Xu et al. Trong kết quả nghiên cứu về hiệu quả tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết các cây Panax quinquefolium, Panax notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria heterophylla và Glehnia littoralis của nhóm tác giả T. Ng và cs (2004) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis pilosula và Glehnia littoralis có tác dụng cao nhất trong việc ức chế hiện tượng huyết tán.

Các kết quả cũng cho thấy nếu chỉ quan tâm đến hoạt động chống oxi hóa thì các cây Panax notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria heterophylla và Glehnia littoralis là các đối tượng thay thế rẻ hơn cây nhân sâm. Nghiên cứu của Chen và cs (2013) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis javanica có khả năng làm giảm dần hiện tượng insulin cao và quá trình peroxide hóa ở những con chuột kháng insulin được nuôi bằng fructose. Yang và cs (2013), đã tách chiết và xác định được cấu trúc một pectic polysaccharide (CPP1b) từ cây Codonopsis pinocuda. Theo nghiên cứu này, CPP1b được tách chiết bằng phương pháp sắc kí cột cellulose DEAE, phân tử này có khối lượng khoảng 1,45x 105 Da.

Pectic CPP1b có khả năng kháng khối u do pectic này thể hiện tính gây độc với các tế bào ung thư phổi A549 (Yang et al. Khi thử nghiệm đánh giá hiệu quả chống lại bệnh béo phì của cây Codonopsis lanceolata ở những con chuột bị béo phì. Các kết quả nghiên cứu gợi ý rằng cây Codonopsis lanceolata có một tiềm năng lớn để ứng dụng trong việc chống lại bệnh béo phì vì nó giảm sự hình thành và tích lũy quá mức các chất béo.