Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) là một trong những loại ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của WHO năm 2018, Việt Nam ghi nhận khoảng 15.000 ca mắc mới mỗi năm với tỷ lệ 13,4/100.000 dân và khoảng 7.000 ca tử vong do CRC. Trên toàn cầu, mỗi năm có khoảng 8 triệu ca mắc mới và 860.000 ca tử vong, trong đó châu Á chiếm 51,3% tổng số ca mắc. Tại Việt Nam, CRC đứng thứ năm về tỷ lệ mắc ung thư, sau ung thư gan, phổi, dạ dày và vú. Đáng chú ý, tỷ lệ mắc CRC ở nam giới cao hơn nữ giới, với nam chiếm 58,3% trong tổng số bệnh nhân.

Methyl hoá DNA, đặc biệt là methyl hoá vùng promoter của gene, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ung thư đại trực tràng. Gene SEPT9 được xem là chỉ thị sinh học hàng đầu trong phát hiện và chẩn đoán ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, các nghiên cứu về methyl hoá gene SEPT9 chủ yếu tập trung trên các nhóm dân tộc da trắng và da đen, trong khi đó, methyl hoá DNA có sự khác biệt phụ thuộc vào sắc tộc và môi trường sống. Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào khảo sát tình trạng methyl hoá gene SEPT9 ở bệnh nhân CRC.

Mục tiêu của luận văn là thiết lập kỹ thuật khảo sát mức độ methyl hoá gene SEPT9 trên mẫu khối u của bệnh nhân CRC Việt Nam, thu thập và phân tích dữ liệu lâm sàng từ 151 mẫu bệnh phẩm, tối ưu phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde, thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá và thực hiện kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hoá. Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc mở rộng hiểu biết về methyl hoá DNA trong ung thư đại trực tràng và ý nghĩa thực tiễn trong ứng dụng sàng lọc, chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Cơ chế hình thành ung thư đại trực tràng: Ung thư phát sinh do đột biến gene và biến đổi epigenetic, trong đó methyl hoá DNA là một cơ chế quan trọng gây bất hoạt gene ức chế khối u, dẫn đến tăng sinh tế bào mất kiểm soát.
  • Methyl hoá DNA và CpG islands: Methyl hoá xảy ra chủ yếu tại vị trí cytosine trong đảo CpG ở vùng promoter gene, làm ức chế phiên mã gene. Sự bất thường methyl hoá trong vùng promoter gene ức chế khối u là dấu hiệu đặc trưng của ung thư đại trực tràng.
  • Kỹ thuật xác định methyl hoá DNA dựa trên biến đổi bisulfite: Natri bisulfite chuyển đổi cytosine không methyl hoá thành uracil, trong khi cytosine methyl hoá không bị biến đổi, cho phép phân biệt các vị trí methyl hoá qua PCR đặc hiệu.
  • Mô hình thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá: Sử dụng công cụ in silico để thiết kế cặp mồi PCR nhắm vào vùng promoter gene SEPT9 có CpG, giúp khuếch đại DNA methyl hoá đặc hiệu.

Các khái niệm chính bao gồm: ung thư đại trực tràng, methyl hoá DNA, đảo CpG, gene SEPT9, biến đổi bisulfite, PCR đặc hiệu methyl hoá.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: 151 mẫu mô khối u và mô lành liền kề của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được cố định bằng formaldehyde, thu thập ngẫu nhiên tại Bệnh viện K Trung ương, Việt Nam.
  • Phương pháp tách chiết DNA: Thử nghiệm 4 phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde gồm: phương pháp A (dựa trên alkali), phương pháp B (dựa trên lysis buffer và proteinase K), phương pháp C (dựa trên NaOH 2N), và phương pháp sử dụng bộ KIT Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit. Phân tích chất lượng DNA bằng điện di gel agarose và đo quang phổ Nanodrop One.
  • Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá: Thu thập trình tự gene SEPT9 từ cơ sở dữ liệu Gene Cards và Ensembl, xác định vùng promoter từ Eukaryotic Promoter Database, thiết kế mồi bằng công cụ Meth Primer.
  • Phân tích methyl hoá DNA: Thực hiện chuyển đổi bisulfite trên DNA tách chiết bằng bộ KIT EZ DNA Methylation – Gold, sau đó tiến hành PCR đặc hiệu methyl hoá.
  • Phân tích dữ liệu lâm sàng: Thu thập thông tin về độ tuổi, giới tính, giai đoạn phát hiện bệnh từ 151 bệnh nhân, tổng hợp và phân tích bằng phần mềm Excel 2010.
  • Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 12/2019 đến tháng 7/2020 tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên.

Cỡ mẫu 151 bệnh nhân được chọn ngẫu nhiên, phương pháp chọn mẫu đảm bảo tính đại diện cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam. Phân tích dữ liệu kết hợp phương pháp mô tả thống kê và kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hoá.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân tích dữ liệu lâm sàng:

    • Độ tuổi mắc bệnh cao nhất ở nhóm 50-59 tuổi chiếm 32,45%, tiếp theo là 60-69 tuổi (27,81%) và trên 70 tuổi (20,54%). Không có bệnh nhân dưới 30 tuổi.
    • Tỷ lệ nam giới mắc bệnh chiếm 58,3%, cao hơn nữ giới 1,39 lần.
    • Giai đoạn phát hiện bệnh chủ yếu ở giai đoạn II (50,99%) và III (35,76%), chỉ 11,92% phát hiện sớm ở giai đoạn I.
    • Tỷ lệ bệnh nhân phát hiện khi đã di căn là 38%, thấp hơn so với 58% của Hoa Kỳ.

  2. Kết quả tách chiết DNA:

    • Phương pháp B (lysis buffer và proteinase K) và bộ KIT Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit cho sản phẩm DNA có chất lượng chấp nhận được với kích thước DNA tập trung ở 250-500 bp.
    • Nồng độ DNA tách chiết bằng phương pháp A và C cao hơn nhưng chất lượng DNA không ổn định, không thấy rõ băng trên gel điện di.
    • Tỷ số OD260/280 và OD260/230 của tất cả các phương pháp đều dưới mức chuẩn 1,8, cho thấy có tạp chất trong mẫu DNA.
    • Tỷ lệ nhiễm tạp chất và phenol thấp nhất ở phương pháp sử dụng bộ KIT (16,27%), tiếp theo là phương pháp B (40,47%).
    • Sau tối ưu hóa phương pháp B (tăng khối lượng mẫu từ 25 mg lên 125 mg), nồng độ DNA tăng đáng kể, đạt trên 1000 ng/µl ở 34,52% mẫu.

  3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá:

    • Gene SEPT9 nằm trên nhiễm sắc thể 17, dài 220.027 bp.
    • Xác định vùng promoter chứa các đảo CpG quan trọng để thiết kế 5 cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hoá.
    • Các cặp mồi được thiết kế bằng công cụ Meth Primer, nhắm vào vùng promoter có CpG để khuếch đại DNA methyl hoá.

  4. Kết quả chuyển hoá bisulfite và PCR:

    • Kiểm tra chất lượng DNA bằng PCR khuếch đại gene FAT1 trên mẫu DNA tách chiết cho thấy chưa có sản phẩm PCR rõ ràng ở các nồng độ DNA khác nhau, cho thấy cần tối ưu thêm quy trình chuyển hoá bisulfite và PCR.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân tích lâm sàng phù hợp với các báo cáo của WHO và các nghiên cứu quốc tế, cho thấy độ tuổi và giới tính là các yếu tố nguy cơ quan trọng của ung thư đại trực tràng tại Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn cao, phản ánh thực trạng thiếu sàng lọc và phát hiện sớm tại Việt Nam.

Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde gặp nhiều khó khăn do DNA bị đứt gãy và nhiễm tạp chất. Phương pháp sử dụng bộ KIT và phương pháp B sau tối ưu cho kết quả tốt hơn về nồng độ và chất lượng DNA, phù hợp cho các bước phân tích tiếp theo. Tuy nhiên, tỷ số OD260/280 và OD260/230 thấp cho thấy cần cải thiện quy trình làm sạch mẫu để giảm tạp chất, tránh ảnh hưởng đến phản ứng PCR.

Việc thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá dựa trên vùng promoter gene SEPT9 là bước quan trọng để phát hiện methyl hoá đặc hiệu, hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại trực tràng. Kết quả PCR ban đầu chưa thành công có thể do DNA bị phân mảnh hoặc tạp chất còn tồn đọng, cần tối ưu thêm kỹ thuật chuyển hoá bisulfite và điều kiện PCR.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố độ tuổi, tỷ lệ giới tính, giai đoạn bệnh và bảng so sánh chất lượng DNA giữa các phương pháp tách chiết, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả từng phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tăng cường sàng lọc và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng:

    • Thực hiện chương trình sàng lọc định kỳ cho nhóm tuổi trên 50, đặc biệt nam giới, nhằm giảm tỷ lệ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn.
    • Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế phối hợp với các bệnh viện tuyến trung ương và địa phương.
    • Thời gian: Triển khai trong 3 năm tới.

  2. Cải tiến quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde:

    • Áp dụng phương pháp tối ưu hóa dựa trên phương pháp B kết hợp bộ KIT để nâng cao chất lượng DNA, giảm tạp chất.
    • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm nghiên cứu và bệnh viện có khoa xét nghiệm phân tử.
    • Thời gian: Nghiên cứu và áp dụng trong 1-2 năm.

  3. Phát triển kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hoá và chuyển hoá bisulfite:

    • Tối ưu hóa điều kiện PCR và quy trình chuyển hoá bisulfite để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm methyl hoá gene SEPT9.
    • Chủ thể thực hiện: Các nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học và y học phân tử.
    • Thời gian: 1 năm nghiên cứu và thử nghiệm.

  4. Xây dựng cơ sở dữ liệu methyl hoá gene SEPT9 ở bệnh nhân Việt Nam:

    • Thu thập và phân tích dữ liệu methyl hoá để phục vụ nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi điều trị.
    • Chủ thể thực hiện: Viện nghiên cứu ung thư, các trường đại học y dược.
    • Thời gian: 3-5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ sinh học, Y học phân tử:

    • Học hỏi phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde và kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hoá.
    • Áp dụng trong nghiên cứu methyl hoá DNA và ung thư.

  2. Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và xét nghiệm:

    • Hiểu rõ về vai trò của methyl hoá gene SEPT9 trong chẩn đoán ung thư đại trực tràng.
    • Áp dụng kết quả nghiên cứu để cải thiện quy trình chẩn đoán và theo dõi bệnh nhân.

  3. Phòng thí nghiệm phân tử và công nghệ gen:

    • Nâng cao kỹ thuật tách chiết DNA và phân tích methyl hoá DNA từ mẫu mô cố định.
    • Tối ưu quy trình xét nghiệm phục vụ chẩn đoán lâm sàng.

  4. Cơ quan quản lý y tế và chính sách:

    • Tham khảo dữ liệu về tỷ lệ mắc bệnh và giai đoạn phát hiện để xây dựng chính sách sàng lọc ung thư đại trực tràng hiệu quả.
    • Lập kế hoạch phát triển chương trình y tế cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao methyl hoá DNA lại quan trọng trong ung thư đại trực tràng?
    Methyl hoá DNA, đặc biệt ở vùng promoter gene ức chế khối u, làm ức chế phiên mã gene, dẫn đến mất kiểm soát tăng sinh tế bào, góp phần phát sinh ung thư. Ví dụ, methyl hoá gene SEPT9 là dấu ấn sinh học giúp phát hiện sớm CRC.

  2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde có khó khăn gì?
    Mẫu mô cố định formaldehyde gây đứt gãy DNA và nhiễm tạp chất, làm giảm chất lượng DNA, ảnh hưởng đến các bước phân tích sau. Cần tối ưu quy trình để thu được DNA đủ chất lượng cho PCR.

  3. PCR đặc hiệu methyl hoá hoạt động như thế nào?
    PCR đặc hiệu methyl hoá sử dụng cặp mồi nhắm vào các vị trí CpG methyl hoá sau khi DNA được xử lý bisulfite, giúp khuếch đại chỉ các đoạn DNA methyl hoá, phân biệt với DNA không methyl hoá.

  4. Tại sao tỷ số OD260/280 và OD260/230 thấp lại là vấn đề?
    Tỷ số thấp cho thấy DNA bị nhiễm tạp chất như protein hoặc phenol, có thể ức chế enzyme PCR, làm giảm hiệu quả khuếch đại và độ chính xác của kết quả.

  5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng như thế nào trong thực tế?
    Kết quả giúp phát triển xét nghiệm sàng lọc không xâm lấn dựa trên methyl hoá gene SEPT9, hỗ trợ chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

Kết luận

  • Nghiên cứu đã thu thập và phân tích thành công dữ liệu lâm sàng của 151 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam, xác định đặc điểm độ tuổi, giới tính và giai đoạn bệnh.
  • Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde được tối ưu, trong đó phương pháp B và bộ KIT Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit cho kết quả tốt nhất về chất lượng DNA.
  • Thiết kế thành công bộ mồi PCR đặc hiệu methyl hoá nhắm vào vùng promoter gene SEPT9, tạo nền tảng cho phân tích methyl hoá DNA.
  • Kỹ thuật chuyển hoá bisulfite và PCR đặc hiệu methyl hoá cần được tối ưu thêm để đạt hiệu quả cao trong phát hiện methyl hoá gene SEPT9.
  • Nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho ứng dụng methyl hoá DNA trong sàng lọc, chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

Next steps: Tiếp tục tối ưu kỹ thuật PCR, mở rộng mẫu nghiên cứu và phát triển xét nghiệm lâm sàng.

Các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế nên phối hợp triển khai nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng kết quả vào thực tiễn nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống ung thư đại trực tràng.