Luận văn thạc sĩ: Biểu hiện và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU
• 1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.2. Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối
• 1.1.3. Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu
• 1.2. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN
• 1.2.1. Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin
• 1.2.2. Phân loại enzyme thủy phân fibrin
• 1.3. KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE
• 1.3.1. Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase ở Việt Nam
• 1.3.3. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới
• 1.4. HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS
• 1.4.1. Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris
• 1.4.2. Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
• 2.2. Các dung dịch và đệm
• 2.3. Môi trƣờng
• 2.4. Máy móc và thiết bị
• 2.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy
• 2.5.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện LK tái tổ hợp
• 2.5.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp
• 2.5.4. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin
• 2.5.5. Xác định hàm lƣợng protein
• 2.5.6. Xác định các yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính và độ bền của enzyme
• 2.5.7. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• 2.5.8. Phản ứng nối ghép gen ngoại lai
• 2.5.9. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.
• 2.5.10. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E.
• 2.5.11. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.5.12. Xử lí DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn
• 2.5.13. Tinh sạch DNA gel agarose
• 2.5.14. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện
• 2.5.15. Tách chiết DNA tổng số nấm men
• 2.5.16. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)
• 2.5.17. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI-TOF (MS/MS)
• 2.5.18. Giải trình tự nucleotide. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA LUMBROKINASE
• 3.1.1. Thiết kế vector tách dòng pJET1
• 3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/LK (pPLK)
• 3.2. BIỂU HIỆN LUMBROKINASE TRONG P. pastoris X33 mang gen lk
• 3.2.1. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
• 3.2.2. Tối ƣu môi trƣờng biểu hiện
• 3.2.3. Tối ƣu nồng độ methanol
• 3.2.4. Tối ƣu thời gian biểu hiện
• 3.3. TINH SẠCH rLK
• 3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK
• 3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK
• 3.4.2. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I. Tổng quan về nghiên cứu lumbrokinase ở Pichia pastoris

Nghiên cứu về lumbrokinase trong hệ thống Pichia pastoris đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Lumbrokinase là một enzyme có khả năng thủy phân fibrin, có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Việc biểu hiện và tinh sạch enzyme này trong Pichia pastoris không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp, từ đó tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào cho ngành dược phẩm.

1.1. Lumbrokinase và vai trò trong y học

Lumbrokinase được biết đến như một enzyme có khả năng làm tan cục máu đông, giúp cải thiện lưu thông máu. Enzyme này có thể được hấp thu qua đường tiêu hóa, mang lại lợi ích lớn cho bệnh nhân mắc các bệnh tim mạch. Nghiên cứu cho thấy lumbrokinase có thể hoạt động hiệu quả mà không gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng như một số thuốc khác.

1.2. Hệ thống Pichia pastoris trong biểu hiện protein

Hệ thống Pichia pastoris là một trong những phương pháp phổ biến để biểu hiện protein tái tổ hợp. Với khả năng sản xuất protein với số lượng lớn và tính chất tinh khiết cao, Pichia pastoris đã trở thành lựa chọn hàng đầu cho nhiều nghiên cứu sinh học phân tử. Việc sử dụng hệ thống này cho lumbrokinase hứa hẹn sẽ mang lại những kết quả khả quan.

II. Thách thức trong nghiên cứu lumbrokinase ở Pichia pastoris

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và sản xuất lumbrokinase trong Pichia pastoris cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để đạt được hiệu suất biểu hiện cao nhất. Ngoài ra, việc tinh sạch enzyme cũng là một bước quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng và hoạt tính của sản phẩm cuối cùng.

2.1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy như nồng độ methanol, thời gian nuôi cấy và nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất biểu hiện của lumbrokinase. Nghiên cứu cần xác định các thông số tối ưu để đảm bảo enzyme được sản xuất với hoạt tính cao nhất.

2.2. Vấn đề tinh sạch enzyme

Quá trình tinh sạch enzyme lumbrokinase là một thách thức lớn. Các phương pháp tinh sạch như sắc ký lỏng có thể giúp loại bỏ các tạp chất, nhưng cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo enzyme giữ được hoạt tính cao nhất sau khi tinh sạch.

III. Phương pháp nghiên cứu lumbrokinase ở Pichia pastoris

Nghiên cứu lumbrokinase trong Pichia pastoris sử dụng các phương pháp hiện đại để biểu hiện và đánh giá tính chất enzyme. Các bước chính bao gồm thiết kế vector biểu hiện, nuôi cấy tế bào, tinh sạch protein và đánh giá hoạt tính enzyme. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện

Vector biểu hiện được thiết kế để chứa gen mã hóa lumbrokinase, cho phép enzyme được sản xuất trong tế bào Pichia pastoris. Việc lựa chọn promoter và các yếu tố điều hòa là rất quan trọng để tối ưu hóa biểu hiện.

3.2. Nuôi cấy và thu nhận tế bào

Quá trình nuôi cấy tế bào Pichia pastoris được thực hiện trong môi trường thích hợp, với điều kiện tối ưu để đảm bảo enzyme được sản xuất với hiệu suất cao. Sau khi nuôi cấy, tế bào sẽ được thu nhận để tiến hành tinh sạch.

3.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính enzyme

Sau khi thu nhận tế bào, enzyme lumbrokinase sẽ được tinh sạch bằng các phương pháp như sắc ký. Hoạt tính enzyme sẽ được đánh giá thông qua các thử nghiệm thủy phân fibrin, từ đó xác định hiệu quả của enzyme trong việc làm tan cục máu đông.

IV. Kết quả nghiên cứu lumbrokinase ở Pichia pastoris

Kết quả nghiên cứu cho thấy lumbrokinase được biểu hiện thành công trong Pichia pastoris với hoạt tính thủy phân fibrin cao. Enzyme này không chỉ có khả năng làm tan cục máu đông mà còn có tính chất sinh học ổn định, hứa hẹn sẽ là một sản phẩm tiềm năng trong điều trị bệnh tim mạch.

4.1. Hoạt tính thủy phân fibrin của lumbrokinase

Kết quả thử nghiệm cho thấy enzyme lumbrokinase có khả năng thủy phân fibrin hiệu quả, với tốc độ cao hơn so với nhiều enzyme khác. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của enzyme trong y học.

4.2. Tính chất sinh học của lumbrokinase

Lumbrokinase biểu hiện trong Pichia pastoris cho thấy tính chất sinh học ổn định, không gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm an toàn và hiệu quả.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu lumbrokinase

Nghiên cứu về lumbrokinase ở Pichia pastoris đã đạt được những kết quả khả quan, mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất enzyme này. Việc phát triển quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của enzyme trong y học.

5.1. Triển vọng ứng dụng lumbrokinase trong y học

Với những ưu điểm vượt trội, lumbrokinase có thể trở thành một lựa chọn điều trị hiệu quả cho các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch. Nghiên cứu cần tiếp tục để xác định rõ hơn về hiệu quả và an toàn của enzyme này trong lâm sàng.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá tính chất của lumbrokinase trong các điều kiện khác nhau. Điều này sẽ giúp mở rộng khả năng ứng dụng của enzyme trong điều trị và phòng ngừa bệnh tắc nghẽn mạch máu.