MỞ ĐẦU Bệnh tim mạch là một trong nh ng nguyên nh n g y tử vong cao nhất trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng trên 17 triệu ngƣời chết vì bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu ngƣời vào năm 2030. Trên 80% các ca tử vong xảy ra ở các nƣớc có thu nhập thấp và trung bình, điển hình là các nƣớc đang phát triển tại vùng Nam Á và Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch đang gia tăng cùng với tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa và nh ng thay đổi trong lối sống [64]. Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện tim mạch, tỷ lệ ngƣời d n mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ khoảng 16% d n số.
Có nhiều nguyên nh n dẫn tới rối loạn tim mạch và mạch máu não nhƣ: chứng tràn máu não, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch,…. Trong tổng số các bệnh nh n bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhƣng bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% số bệnh nh n sống và làm việc bình thƣờng. Nguyên nh n chủ yếu là do xuất hiện cục máu đông g y tắc mạch và cản trở lƣu thông máu. Do đó, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh này.
Vào khoảng nh ng năm 90, các nhà nghiên cứu tại Nhật Bản đã phát hiện đƣợc 1 enzyme có hoạt tính thủy ph n fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm 6 izozyme đƣợc đặt tên chung là lumbrokinase (LK) [47,50]. Về phƣơng diện l m sàng, LK đƣợc xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống vì có thể đƣợc hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [66]. Một ƣu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác - thƣờng đƣợc sử dụng làm thuốc tiêm (nhƣ tPA (tissue type plasminogen activator), urokinase và streptokinase) [40,42] là không có tác dụng phụ, không g y chảy máu hệ thống, giá thành rẻ. Hiện nay, hầu hết các thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mặt tại Việt nam phải nhập khẩu từ nƣớc ngoài và có giá thành cao.
Vì vậy, nh ng năm gần đ y, nghiên cứu sản xuất các yếu tố chống tắc nghẽn mạch máu dạng tự nhiên và tái tổ hợp bắt đầu đƣợc quan t m ở trong nƣớc. Trong Vũ Thị Bích Ngọc 1 Cao học K20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học số đó, LK nhận đƣợc rất nhiều quan t m của các nhà khoa học do nh ng ƣu điểm nổi bật của nó. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ tinh sạch, đánh giá tính chất l hóa của LK từ giun đất và tách dòng gen mã hóa LK, hiện chƣa có công bố nào về nghiên cứu sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp để làm thuốc. Nhằm góp phần vào việc hạ giá thành sản phẩm và chủ động nguồn nguyên liệu để sản xuất lumbrokinase, đề tài KC04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu’’ do PGS.
Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm đã đề xuất x y dựng quy trình công nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris”, nhằm tiến tới x y dựng đƣợc quy trình công nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp dùng làm nguyên liệu thuốc cũng nhƣ x y dựng quy trình công nghệ ổn định sản xuất LK tái tổ hợp. Với đề tài trên, luận văn tập trung giải quyết các vấn đề sau: 1. Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch đƣợc enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin.
Nghiên cứu một số tính chất của enzyme LK tái tổ hợp tinh sạch đƣợc. Vũ Thị Bích Ngọc 2 Cao học K20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU 1.
Sơ lƣợc về bệnh tắc nghẽn mạch máu Bệnh tắc nghẽn mạch máu g y ra rối loạn tim mạch và mạch máu não là một trong nh ng nguyên nh n g y tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Liên đoàn tim mạch thế giới đƣa ra thống kê cứ ba ngƣời tử vong trong đó có một ngƣời chết vì bệnh tim mạch. Ở Mỹ, cứ 29 gi y có thêm một ngƣời bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một ngƣời tử vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong, phí tổn do bệnh chiếm 128 tỉ USD/ năm.
Hiện nay trên thế giới số ngƣời chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biến mạch máu não ngày càng gia tăng nhất là ở các nƣớc đang phát triển. Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu nhƣ: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi. Nguyên nh n chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch g y ra, các nhà khoa học đã đi theo hƣớng xử l các huyết khối hình thành trong thành mạch.
Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch [7]. Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối Đông máu là hiện tƣợng sinh lý xảy ra khi mạch máu bị tổn thƣơng, máu đƣợc chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Quá trình bao gồm một chuỗi các phản ứng xảy ra theo kiểu bậc thang đƣợc chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua 2 con đƣờng nội sinh và ngoại sinh, giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và giai đoạn tạo mạng lƣới fibrin từ fibrinogen hình thành cục máu đông [1]. Cơ chế đông máu đƣợc bảo tồn khá chắc trong tiến hóa, riêng với lớp thú, hệ thống đông máu tồn tại 2 thành phần là tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu).
Rối loạn của 1 trong 2 thành phần gây rối loạn trong quá trình đông máu, tác động tới việc máu đông nhiều hoặc đông quá ít. Vũ Thị Bích Ngọc 3 Cao học K20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Khi chấn thƣơng làm tổn hại đến nội mạc mạch máu, tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu tại vết thƣơng, đ y đƣợc coi là quá trình cầm máu ban đầu. Quá trình cầm máu thứ phát diễn ra đồng thời, các yếu tố đông máu trong huyết tƣơng đáp ứng một loạt các chuỗi phản ứng để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu. Đ y thực chất là chuyển fibrinogen dạng hòa tan thành fibrin dạng không hòa tan, sau đó, các mạch máu sẽ tạo mạng lƣới chứa tiểu cầu sợi huyết hình thành cục máu, gắn vào thành mạch để ngăn chặn sự mất máu và tạo điều kiện để liền vết thƣơng (Hình 1.
Giai đoạn 1: Giai đoạn 2: Giai đoạn 3: Tiểu cầu gắn vào Tiểu cầu giải phóng Mạng lƣới fibrin bắt gi màng trong (thành fibrin và bắt đầu bịt hồng cầu, bịt kín hoàn mạch máu) kín thành mạch máu toàn thành mạch máu Khối fibrin Tiểu cầu Tế bào hồng cầu Màng trong Mô liên thành kết mạch máu Hình 1. Quá trình hình thành cục máu đông trong mạch máu Bình thƣờng trong cơ thể, quá trình đông máu đƣợc kiểm soát chặt chẽ bởi quá trình chống đông máu để khu trú việc đông máu chỉ ở chỗ bị thƣơng mà không lan rộng ra cả dòng máu. Tham gia quá trình chống đông máu là hàng loạt các chất chống đông khác nhau và hiện tƣợng tiêu fibrin dƣới tác dụng của plasmin- enzyme thủy phân fibrin của cơ thể [2]. Quá trình đông máu liên quan tới 1 hệ thống phản ứng protease bao gồm khoảng 30 loại protein khác nhau, trong khi đó chỉ có 1 enzyme plasmin có thể phá vỡ cục máu đông.
Vũ Thị Bích Ngọc 4 Cao học K20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tan huyết khối nhằm tái lƣu thông tuần hoàn máu, đ y là quá trình ngƣợc với quá trình đông máu. Có hai cơ chế làm tan huyết khối là: cơ chế ph n hủy fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen thành plasmin và cơ chế ph n hủy trực tiếp fibrin (Hình 1. Đối với cơ chế tan huyết khối thông qua hoạt hóa plasminogen có sự tham gia của các yếu tố gồm: plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa. Plasmin gồm 2 chuỗi polypeptide nối với nhau bằng một cầu nối disulfide, chuỗi nhẹ gắn serine- protease, chuỗi nặng có vị trí gắn fibrin.
Yếu tố này đƣợc tạo ra dƣới dạng không hoạt động là plasminogen ở gan. Đ y là một chuỗi polypeptide chứa 791 amino acid. Chất hoạt hóa plasminogen của mô (tPA) chuyển plasminogen thành plasmin, plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm tan đƣợc, đƣợc gọi là sản phẩm thoái giáng của fibrin (FDPs). Các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm chậm sự chuyển hóa fibrinogen thành fibrin (làm chậm sự tạo thành cục máu).
Trong máu ngƣời bình thƣờng, plasmin tồn tại song song với yếu tố ức chế là antiplasmin (Hình 1. Nó có nồng độ cao hơn 30 lần so với plasmin trong huyết tƣơng, chống lại tác động của plasmin tới việc ph n hủy protein trong huyết tƣơng [7]. Trong máu có 2 yếu tố hoạt hóa plasminogen tự nhiên là yếu tố hoạt hóa mô (tPA) và urokinase (uPA), các hoạt động tiêu sợi huyết tự nhiên đƣợc kiểm soát bởi các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (ví dụ PAI-1: plasminogen activator inhibitor – 1, một chất ức chế tác dụng nhanh của t-PA và u-PA) và các chất ức chế plasmin (ví dụ a1- antiplasmin, a2-macroglobulin) [22]. Vai trò của antiplasmin (chất ức chế plasmin) Vũ Thị Bích Ngọc 5 Cao học K20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Nhờ cơ chế trên mà cơ thể gi đƣợc sự ổn định và c n bằng gi a quá trình đông máu và tan huyết khối.
Yếu tố hoạt hóa plasminogen nội mô (tPA) Yếu tố XIa, Yếu tố ức chế hoạt hóa XIIa plasminogen 1&2 kallikrein Sản phẩm thoái giáng của fibrin Thrombin- yếu tố ức chế quá trình thuỷ ph n fibrin Hình 1.