Luận văn nghiên cứu về kit multiplex PCR cho chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao ở Việt Nam

Tài liệu nghiên cứu Luận văn nghiên cứu tạo kit multiplex pcr chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Nghiên Cứu Kit Multiplex PCR Chẩn Đoán Nhanh Vi Khuẩn Lao Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO
• 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới
• 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
• 1.2. VI KHUẨN LAO
• 1.2.1. Đặc điểm phân loại
• 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc
• 1.2.2.1. Cấu trúc hình thái
• 1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào
• 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.2.3.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc
• 1.2.3.2. Chu kì tế bào
• 1.2.4. Khả năng gây bệnh
• 1.2.5. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao
• 1.2.5.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacterium tuberculosis

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Bệnh lao, một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất, đang gia tăng trên toàn cầu, đặc biệt tại Việt Nam. Theo thống kê của WHO, tỷ lệ phát hiện bệnh lao chỉ đạt 37%, dẫn đến nhiều bệnh nhân không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử, đặc biệt là multiplex PCR, đã mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác vi khuẩn lao. Nghiên cứu này nhằm phát triển một kit chẩn đoán sử dụng multiplex PCR với ba gen đích: IS6110, IS1081 và 23SrDNA, phù hợp với điều kiện tại Việt Nam.

1.1. Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có tỷ lệ bệnh lao cao nhất thế giới. Tình trạng lao kháng thuốc đang gia tăng, với tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân mới là 2,7%. Việc phát hiện và điều trị bệnh lao gặp nhiều khó khăn do phương pháp chẩn đoán truyền thống không đáp ứng kịp thời. Do đó, việc phát triển kit multiplex PCR là cần thiết để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát bệnh lao.

II. Công nghệ multiplex PCR

Công nghệ multiplex PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen cùng một lúc, giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng vi khuẩn lao. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt các loài vi khuẩn gây bệnh. Việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho các gen IS6110, IS1081 và 23SrDNA sẽ giúp phát hiện M. tuberculosis complex một cách hiệu quả, giảm thiểu khả năng bỏ sót bệnh nhân. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng multiplex PCR có thể rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn hai ngày, từ đó nâng cao khả năng kiểm soát dịch bệnh.

2.1. Lợi ích của multiplex PCR trong chẩn đoán

Việc áp dụng multiplex PCR trong chẩn đoán bệnh lao mang lại nhiều lợi ích. Đầu tiên, phương pháp này giúp phát hiện nhanh chóng các chủng vi khuẩn lao, từ đó giảm thiểu thời gian chờ đợi kết quả. Thứ hai, với khả năng phát hiện đồng thời nhiều gen, multiplex PCR giúp xác định chính xác các chủng lao kháng thuốc, từ đó hỗ trợ trong việc điều trị hiệu quả hơn. Cuối cùng, việc sử dụng công nghệ này còn giúp giảm chi phí cho hệ thống y tế, khi mà thời gian và nguồn lực được sử dụng hiệu quả hơn.

III. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã phát triển thành công kit multiplex PCR với ba gen đích, cho kết quả khả quan trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của kit đạt yêu cầu, góp phần nâng cao khả năng phát hiện bệnh lao tại Việt Nam. Việc áp dụng kit này trong thực tiễn sẽ giúp các cơ sở y tế chẩn đoán nhanh chóng và chính xác hơn, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị và kiểm soát bệnh lao trong cộng đồng.

3.1. Đánh giá hiệu quả của kit multiplex PCR

Kết quả thử nghiệm cho thấy kit multiplex PCR có khả năng phát hiện vi khuẩn lao với độ chính xác cao. Các mẫu bệnh phẩm được kiểm tra cho thấy tỷ lệ phát hiện dương tính cao, đồng thời giảm thiểu số lượng kết quả âm tính giả. Điều này chứng tỏ rằng việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh lao là một bước tiến quan trọng, giúp nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do lao gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm vi khuẩn lao, với khoảng 9 triệu ca mắc mới và gần 3 triệu ca tử vong mỗi năm. Tỷ lệ phát hiện bệnh lao chỉ đạt khoảng 37%, dẫn đến hơn 60% bệnh nhân không được chẩn đoán và điều trị kịp thời, tạo thành nguồn lây nhiễm khó kiểm soát. Việt Nam là một trong 22 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới, đứng thứ 12 và thứ 3 trong khu vực Tây Thái Bình Dương. Lao kháng đa thuốc và lao đồng nhiễm HIV/AIDS làm tăng nguy cơ tử vong và khó khăn trong kiểm soát dịch bệnh. Việc chẩn đoán lao hiện nay chủ yếu dựa trên nhuộm Ziehl-Neelsen và nuôi cấy vi khuẩn, nhưng các phương pháp này còn nhiều hạn chế về độ nhạy và thời gian cho kết quả. Công nghệ sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR, đã rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn vài ngày với độ nhạy và đặc hiệu cao. Tuy nhiên, các kit chẩn đoán hiện tại chủ yếu dựa trên gen IS6110, trong khi một số chủng lao tại Việt Nam không chứa gen này, gây ra kết quả âm tính giả. Do đó, nghiên cứu phát triển kit multiplex PCR sử dụng đồng thời các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao là rất cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu là tạo ra kit multiplex PCR phù hợp với điều kiện Việt Nam, đánh giá hiệu quả trên panel mẫu và bệnh phẩm lâm sàng, góp phần cải thiện công tác chẩn đoán và kiểm soát bệnh lao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Sinh học phân tử và kỹ thuật PCR: PCR là phương pháp khuếch đại DNA đặc hiệu, cho phép phát hiện nhanh vi khuẩn lao trong mẫu lâm sàng. Multiplex PCR mở rộng khả năng khuếch đại đồng thời nhiều gen đích trong một phản ứng, tiết kiệm thời gian và hóa chất.

• Gen đích trong chẩn đoán lao:

  • IS6110: Trình tự chèn phổ biến trong hầu hết các chủng M. tuberculosis, nhưng có thể bị khuyết ở một số chủng tại Đông Nam Á.
  • IS1081: Trình tự chèn có số bản sao ổn định (5-6 bản), có mặt ở tất cả các chủng M. tuberculosis complex, giúp khắc phục hạn chế của IS6110.
  • 23S rDNA: Gen mã hóa tiểu phần ribosome 23S, có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh, giúp phát hiện chính xác và phân biệt các chủng.

• Đặc điểm vi khuẩn lao và hệ gen: M. tuberculosis có cấu trúc thành tế bào phức tạp, khả năng kháng thuốc cao, hệ gen chứa nhiều gen mã hóa protein PE/PPE liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên và khả năng sống sót trong môi trường khác nhau.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu:

  • Panel mẫu gồm 50 chủng M. tuberculosis complex và 50 chủng Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) được thu thập từ các bệnh viện lớn tại Việt Nam.
  • 100 mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ bệnh nhân lao và nghi lao tại Bệnh viện 103, bao gồm dịch màng phổi, đàm, dịch rửa phế quản, dịch não tủy, nước tiểu, v.v.

• Phương pháp phân tích:

  • Tách chiết DNA bằng phương pháp ly giải tế bào kết hợp lysozyme, proteinase K và chiết phenol-chloroform-isoamyl alcohol, tủa DNA bằng ethanol.
  • Thiết kế và tối ưu hóa bộ kit multiplex PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu cho gen IS6110 (416 bp), IS1081 (300 bp) và 23S rDNA (206 bp) sử dụng phần mềm Primer3, DNAclub, Oligo.
  • Tối ưu điều kiện phản ứng PCR, đặc biệt nhiệt độ gắn mồi (56°C được chọn là tối ưu).
  • Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện của kit trên panel mẫu chuẩn.
  • Áp dụng kit trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng, so sánh kết quả với phương pháp soi và nuôi cấy truyền thống.
  • Kiểm tra tính ổn định của kit qua thời gian bảo quản ở -20°C.

• Timeline nghiên cứu:

  • Thu thập mẫu và tách chiết DNA: 3 tháng.
  • Thiết kế và tối ưu hóa kit multiplex PCR: 4 tháng.
  • Đánh giá hiệu quả trên panel mẫu và bệnh phẩm lâm sàng: 3 tháng.
  • Phân tích dữ liệu và hoàn thiện báo cáo: 2 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách chiết DNA đạt độ tinh sạch cao:

   • Nồng độ DNA thu được từ các chủng vi khuẩn lao dao động từ 4,8 đến 159,5 ng/µl, tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,54 - 2,39, đảm bảo độ tinh sạch phù hợp cho phản ứng PCR.

2. Tối ưu hóa điều kiện multiplex PCR:

   • Nhiệt độ gắn mồi 56°C cho kết quả tốt nhất với các băng DNA đặc hiệu rõ nét cho cả 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA.
   • Ở nhiệt độ thấp hơn (52-54,4°C) xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu, còn ở 58°C chỉ khuếch đại được gen IS1081.

3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kit multiplex PCR:

   • Trên panel 50 mẫu MTBC, kit phát hiện đúng 100% mẫu dương tính (độ nhạy 100%).
   • Trên panel 50 mẫu MOTT, kit không phát hiện sai mẫu dương tính (độ đặc hiệu 100%).
   • Ngưỡng phát hiện DNA vi khuẩn lao đạt tới mức pha loãng 2^-17, tương đương với khả năng phát hiện số lượng vi khuẩn rất thấp trong mẫu.

4. Hiệu quả trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng:

   • Trong 100 mẫu bệnh phẩm, kit multiplex PCR phát hiện vi khuẩn lao với tỷ lệ cao hơn so với phương pháp soi và nuôi cấy truyền thống, đặc biệt ở các mẫu có tải lượng vi khuẩn thấp.
   • Kết quả PCR cho phép phát hiện nhanh trong vòng 1,5 - 2 ngày, rút ngắn đáng kể thời gian chẩn đoán so với nuôi cấy mất 4-8 tuần.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng đồng thời 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA trong phản ứng multiplex PCR giúp khắc phục hạn chế của các kit PCR truyền thống chỉ dựa vào IS6110, đặc biệt với các chủng lao không chứa gen này phổ biến tại Việt Nam và khu vực Đông Nam Á. Độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% trên panel mẫu chuẩn khẳng định tính chính xác của kit. Ngưỡng phát hiện thấp cho thấy khả năng phát hiện sớm vi khuẩn lao ngay cả khi tải lượng vi khuẩn trong mẫu thấp, điều này rất quan trọng trong kiểm soát dịch bệnh và điều trị kịp thời. So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả phù hợp với xu hướng ứng dụng multiplex PCR trong chẩn đoán lao trên thế giới. Việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi và thành phần phản ứng giúp giảm thiểu sản phẩm không đặc hiệu, nâng cao độ tin cậy của xét nghiệm. Ứng dụng kit trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng cho thấy tiềm năng lớn trong thực tiễn, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và tăng tỷ lệ phát hiện bệnh nhân. Các kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh tỷ lệ phát hiện giữa các phương pháp và bảng phân tích độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng kit multiplex PCR trong các cơ sở y tế trọng điểm

   • Mục tiêu: Nâng cao tỷ lệ phát hiện bệnh lao, đặc biệt lao kháng thuốc và lao thể ẩn.
   • Thời gian: Triển khai trong 12 tháng đầu sau nghiên cứu.
   • Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế phối hợp với các bệnh viện chuyên khoa lao.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ y tế về kỹ thuật multiplex PCR

   • Mục tiêu: Đảm bảo kỹ thuật chuẩn, giảm sai sót trong xét nghiệm.
   • Thời gian: Tổ chức các khóa đào tạo liên tục trong 6 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược, Học viện Quân Y.

3. Xây dựng quy trình chuẩn và hướng dẫn sử dụng kit multiplex PCR

   • Mục tiêu: Chuẩn hóa quy trình xét nghiệm, đảm bảo tính đồng nhất và hiệu quả.
   • Thời gian: Soạn thảo và ban hành trong 3 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, các viện nghiên cứu.

4. Mở rộng nghiên cứu đánh giá hiệu quả kit trên các nhóm bệnh nhân đặc biệt

   • Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả trên bệnh nhân lao đồng nhiễm HIV, lao ngoài phổi, lao kháng thuốc.
   • Thời gian: Nghiên cứu bổ sung trong 18 tháng tiếp theo.
   • Chủ thể thực hiện: Các bệnh viện chuyên khoa lao, viện nghiên cứu.

5. Phát triển sản phẩm kit multiplex PCR thành sản phẩm thương mại trong nước

   • Mục tiêu: Giảm chi phí, tăng khả năng tiếp cận xét nghiệm cho các cơ sở y tế tuyến dưới.
   • Thời gian: 24 tháng sau khi hoàn thiện nghiên cứu.
   • Chủ thể thực hiện: Các công ty công nghệ sinh học trong nước phối hợp với viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành y học, vi sinh vật học, công nghệ sinh học

   • Lợi ích: Hiểu rõ về kỹ thuật multiplex PCR, đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao và ứng dụng trong chẩn đoán.
   • Use case: Phát triển các nghiên cứu tiếp theo về chẩn đoán phân tử và dịch tễ học lao.

2. Bác sĩ chuyên khoa lao và cán bộ y tế làm công tác chẩn đoán, điều trị lao

   • Lợi ích: Nắm bắt công nghệ mới giúp nâng cao hiệu quả phát hiện và điều trị bệnh nhân.
   • Use case: Áp dụng kỹ thuật multiplex PCR trong thực hành lâm sàng.

3. Các nhà quản lý y tế và hoạch định chính sách y tế công cộng

   • Lợi ích: Đánh giá tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chương trình phòng chống lao quốc gia.
   • Use case: Lập kế hoạch triển khai xét nghiệm chẩn đoán nhanh, nâng cao tỷ lệ phát hiện bệnh.

4. Các công ty công nghệ sinh học và sản xuất kit xét nghiệm

   • Lợi ích: Tham khảo quy trình thiết kế, tối ưu và đánh giá kit multiplex PCR phù hợp với điều kiện Việt Nam.
   • Use case: Phát triển sản phẩm kit chẩn đoán lao thương mại trong nước.

Câu hỏi thường gặp

1. Multiplex PCR khác gì so với PCR truyền thống trong chẩn đoán lao?
   Multiplex PCR cho phép khuếch đại đồng thời nhiều gen đích trong một phản ứng, tiết kiệm thời gian và hóa chất, đồng thời tăng độ chính xác bằng cách phát hiện nhiều trình tự đặc hiệu cùng lúc. Ví dụ, trong nghiên cứu này, 3 gen IS6110, IS1081 và 23S rDNA được khuếch đại cùng lúc để tránh bỏ sót chủng lao không có IS6110.

2. Tại sao cần sử dụng nhiều gen đích trong chẩn đoán vi khuẩn lao?
   Một số chủng M. tuberculosis tại Việt Nam và Đông Nam Á không chứa gen IS6110, nếu chỉ dựa vào gen này sẽ gây âm tính giả. Việc bổ sung gen IS1081 và 23S rDNA giúp phát hiện đầy đủ hơn, nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm.

3. Ngưỡng phát hiện của kit multiplex PCR là bao nhiêu?
   Kit có thể phát hiện DNA vi khuẩn lao ở nồng độ rất thấp, tương đương pha loãng 2^-17, cho phép phát hiện sớm vi khuẩn ngay cả khi tải lượng trong mẫu bệnh phẩm thấp, giúp chẩn đoán kịp thời.

4. Thời gian cho kết quả của kỹ thuật multiplex PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống như thế nào?
   Multiplex PCR cho kết quả trong vòng 1,5 - 2 ngày, trong khi nuôi cấy trên môi trường Lowenstein mất từ 4 đến 8 tuần. Điều này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và điều trị bệnh nhân.

5. Kit multiplex PCR có thể áp dụng cho những loại mẫu bệnh phẩm nào?
   Kit đã được đánh giá trên nhiều loại mẫu như dịch màng phổi, đàm, dịch rửa phế quản, dịch não tủy, nước tiểu, dịch khớp, phù hợp với đa dạng các thể lao, kể cả lao ngoài phổi, giúp mở rộng khả năng chẩn đoán trong thực tế.

Kết luận

• Đã thiết kế và tối ưu thành công kit multiplex PCR đồng thời khuếch đại 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA phù hợp với đặc điểm chủng lao tại Việt Nam.
• Kit đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100% trên panel mẫu chuẩn, với ngưỡng phát hiện DNA rất thấp, đảm bảo phát hiện sớm vi khuẩn lao.
• Ứng dụng trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng cho kết quả nhanh, chính xác, vượt trội so với phương pháp truyền thống.
• Kit có tính ổn định cao khi bảo quản ở -20°C, phù hợp triển khai trong các phòng xét nghiệm.
• Đề xuất triển khai áp dụng rộng rãi, đào tạo kỹ thuật viên và phát triển sản phẩm thương mại nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát bệnh lao tại Việt Nam.

Next steps: Triển khai thử nghiệm thực địa, hoàn thiện quy trình chuẩn, đào tạo nhân lực và phối hợp với các cơ sở y tế để đưa kit vào sử dụng chính thức.

Call-to-action: Các cơ sở y tế và nhà nghiên cứu quan tâm có thể liên hệ Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y để hợp tác triển khai và phát triển thêm các ứng dụng của kỹ thuật multiplex PCR trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1. Tình hình bệnh lao trên thế gới Lao là một bệnh truyền nhiễm mãn tính đã xuất hiện từ rất lâu. Hàng nghìn năm trôi qua, nó đã lây lan và giết chết hàng triệu người, số người chết vì bệnh lao còn lớn hơn cả do AIDS và sốt rét cộng lại.

Ngày nay, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn do xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng và lao đồng nhiễm HIV/AIDS. Cùng với AIDS và sốt rét, lao đang được xếp vào một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất thế giới [2, 53]. Do tính chất có thể lây truyền qua tiếp xúc và qua không khí như các bệnh cúm nên tốc độ lan truyền rất nhanh và khả năng kiểm soát bệnh lao rất phức tạp. Các kết quả thống kê lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M.

tuberculosis và 10% trong số đó sẽ phát triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời. Mỗi năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện, hiện tại hàng năm trên thế giới có khoảng trên 49 triệu bệnh nhân lao lưu hành, con số này đang ngày càng gia tăng. Bệnh lao giết chết 8000 người mỗi ngày, gần 3 triệu người mỗi năm [73]. Đáng báo động là hiện nay bệnh lao đã trở thành nguyên nhân hàng đầu giết hại nhiều thanh thiếu niên và người lớn, chủ yếu là nhóm tuổi đang là nguồn lao động chính của xã hội (từ 20 tới 49 tuổi) [78].

Số bệnh nhân lao ở những nước đang phát triển chiếm 95% trong tổng số bệnh nhân lao trên toàn thế giới. Khoảng 80% số bệnh nhân lao trên toàn thế giới tập trung vào 22 quốc gia có gánh nặng bệnh tật cao. Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân gây tử vong ở các nước này. Tính riêng tại Ấn Độ, hàng 3 năm có khoảng trên 500.000 người chết vì căn bệnh này, tương đương tỷ lệ cứ 1 phút lại có một người ở quốc gia này chết vì lao [63, 73].

Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% trên toàn thế giới. Còn ở cận Sahara châu Phi thì tỷ lệ này cao gấp đôi so với Đông Nam Á, tỷ lệ nhiễm lao ở đây là 343 ca trên 100.000 người dân. Thông báo gần đây nhất năm 2007 của tổ chức y tế thế giới cho biết bệnh lao được xác định bước đầu đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á.

Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn không giảm nguy hại đối với loài người. Hiện nay tỷ lệ điều trị lao thành công trên toàn cầu đạt 82%, tuy nhiên còn rất nhiều bệnh nhân chưa được phát hiện và không được chữa trị, những bệnh nhân này tiếp tục lây cho cộng đồng. Theo ước tính của WHO thì tỷ lệ phát hiện bệnh nhân mới chỉ đạt 37% trong tổng số người mới nhiễm lao [63]. Sự gia tăng của bệnh lao trên quy mô toàn cầu cùng với mối liên quan với HIV và sự xuất hiện của chủng kháng thuốc đang là một vấn nạn về y tế cộng đồng.

Điều này càng khiến cho bệnh lao trở nên khó khăn trong việc kiểm soát và điều trị. Đến năm 1993 WHO phải tuyên bố tình trạng khẩn cấp về bệnh lao trên toàn cầu để kêu gọi các quốc gia trên thế giới chung tay phòng chống lao [64]. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo báo cáo vào năm 2006 trong chương trình chống lao quốc gia thì Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Tại khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ 3 chỉ sau Trung Quốc và Philipine về tổng số bệnh nhân lao đang lưu hành và số bệnh nhân lao mới phát hiện.

Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao kháng thuốc là một vấn đề cấp bách [2, 10, 53]. 4 Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 10, 53]. Theo WHO thì Việt Nam là nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu với khoảng 44% dân số nhiễm lao.

Tỷ lệ lao mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) mới là 77/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong do lao là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh nhân lao mới là 5% [2], trên thực tế số liệu về nhiễm lao có thể cao hơn những con số thống kê ở trên. Vấn đề đồng nhiễm HIV và lao không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn làm giảm hiệu quả điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong. Đó cũng chính là khó khăn, thách thức lớn đối với công tác phòng chống lao quốc gia. Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam đang ngày càng gia tăng, tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%.

Như vậy, mỗi ngày có gần 400 người mắc, trong đó có 178 người mắc lao phổi ho khạc ra vi khuẩn làm lây nhiễm cho cộng đồng và 55 người chết vì bệnh lao. Hiện nay, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% [2]. Thực tế hiện nay, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt khoảng 44% và tỷ lệ chữa khỏi là 81% [2]. Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR 5 vào chẩn đoán lao là một bước đột phá mang lại nhiều kết quả khả quan.

Tuy vậy kĩ thuật này vẫn còn những điểm chưa thực sự hoàn thiện và cần có những nghiên cứu bổ sung, cải tiến nhằm đem lại hiệu quả tối ưu. VI KHUẨN LAO 1. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [75]. Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm hai nhóm: + Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M.

bovis gây bệnh lao điển hình. + Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M. kansasii… Nhóm này không gây bệnh lao [33, [58, 61]. Đặc điểm cấu trúc 1.

Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0,3 µm. Nhuộm Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli-AFB). Dựa vào đặc điểm này có thể giúp phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm bằng cách soi AFB.

Một số giả thiết cho rằng mức 6 kháng với axit là do độ dài của các chuỗi axit mycolic. Trực khuẩn lao duy trì tính kháng axit trong dịch huyền phù trong một khoảng thời gian rất dài ngay cả khi có tác dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme co-factor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 12]. tuberculosis (http://www.

tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen (http://www. Cấu trúc thành tế bào Thành tế bào của Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc đặc biệt, chia thành 4 lớp: 1- Lipid ngoài 2- Axit mycolic 3- polysaccharides (arabinogalactan) 4- peptidoglycan 5- màng sinh chất 6- lipoarabinomannan (LAM) 7- phosphatidylinositol mannoside 8- Khung thành tế bào Hình 1. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao (http://commons.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram) Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao, phát triển trong tế bào có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống chịu các enzyme phân giải từ các lyzozyme của tế bào. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trong đại thực bào, M.

tuberculosis tích lũy một capsule giả không bám. Thành phần của capsule này chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu trúc của capsule có thể bung ra bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh hầu như giống với màng của các Mycobacterium trong cùng một giống, bao gồm cả các Mycobacterium không gây bệnh.

Lớp tiếp theo được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các chất lipit phức tạp. Đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn, chống lại sự hủy diệt của đại thực bào và các tế bào miễn dịch [1]. Gắn với peptidoglican là một poysaccaharide phân nhánh và arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được este hóa 8 với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic. Các axit mycolic được sắp xếp theo tính đặc hiệu loài nên có thể xác định loài Mycobacterium bằng sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí khí lỏng [57].

Các axit mycolic đặc hiệu của M. tuberculosis là alpha - keto và mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dilycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL). Xuyên qua toàn bộ lớp màng là những glycolipid như phosphatidyl- myoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM) được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào, trong đó LAM có tính đặc hiệu loài.

Thành tế bào Mycobacterium chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này tham gia vào cấu trúc thành tế bào, các protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp axit mycolic [58, 67]. Lớp thứ ba gồm các peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử axit mycolic tạo nên bộ khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất định. Thành tế bào của Mycobacterium có cấu trúc phức tạp với các thành phần hóa học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào của M.