Nghiên Cứu Kháng Nguyên Bệnh Tiên Mao Trùng Ở Gia Súc Từ Trypanosoma evansi

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC

1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng

1.3. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng

1.4. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh

1.5. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

1.6. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

1.7. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa

1.8. VECTOR TÁCH DÒNG

1.9. Các loại vector tách dòng

1.10. VECTOR BIỂU HIỆN

1.11. Các hệ thống biểu hiện gen

2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.2. Chủng vi khuẩn và plasmid

2.3. Các bộ sinh phẩm, thang chuẩn

2.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị

2.5. Môi trường và đệm

2.6. Cặp mồi sử dụng

2.7. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.8. Phương pháp nghiên cứu

2.8.1. Các phương pháp nghiên cứu

2.8.2. Phương pháp biểu hiện

2.8.3. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+

2.8.4. Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)

2.8.5. Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)

2.8.6. Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)

2.8.7. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA

2.8.8. Xác định độ lặp lại của kết quả phản ứng ELISA

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET-RoTAT 1

3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1

3.2.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1

3.2.2. Nghiên cứu xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện

3.2.3. Nghiên cứu xác định nhiệt độ tăng sinh chủng biểu hiện

3.2.4. Nghiên cứu xác định mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1

3.2.5. Nghiên cứu xác định độ pH phù hợp để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT 1

3.2.6. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1

3.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1

3.3. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1

3.4. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 xây dựng quy trình phản ứng ELISA phát hiện bệnh tiên mao trùng

3.4.1. Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA

3.4.2. Khảo sát tác nhân block giếng

3.4.3. Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của T.evansi và anti-bovine IgG:HRPO

3.4.4. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA

3.4.5. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng

3.4.6. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu bò nghi nhiễm tiên mao trùng

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Bệnh Tiên Mao Trùng Ở Gia Súc

Bệnh tiên mao trùng là một bệnh ký sinh trùng đường máu phổ biến, gây ra bởi Trypanosoma evansi, gây tác hại lớn cho gia súc, đặc biệt là trâu, bò. Bệnh này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và năng suất của vật nuôi, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi. Theo Phan Địch Lân và cộng sự (2004), bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, từ 13-30% ở trâu và 7-14% ở bò, với tỷ lệ chết/mắc lên đến 6,3-20%. Do đó, việc nghiên cứu và kiểm soát bệnh tiên mao trùng là vô cùng quan trọng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Việc Nghiên Cứu Trypanosoma evansi

Nghiên cứu về Trypanosoma evansi giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh, dịch tễ học, và các yếu tố liên quan đến sự lây lan của bệnh. Điều này rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng bệnh tiên mao trùng và điều trị bệnh tiên mao trùng hiệu quả. Việc xác định các chủng Trypanosoma evansi phổ biến và độc lực cao cũng giúp định hướng các nghiên cứu về vắc-xin bệnh tiên mao trùng và các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chính xác hơn.

1.2. Ảnh Hưởng Kinh Tế Của Bệnh Tiên Mao Trùng Lên Ngành Chăn Nuôi

Bệnh tiên mao trùng gây ra những thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi do làm giảm sản lượng thịt, sữa, và sức kéo của gia súc. Chi phí điều trị bệnh tiên mao trùng và các biện pháp phòng bệnh tiên mao trùng cũng là một gánh nặng lớn cho người chăn nuôi. Ngoài ra, bệnh còn ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của gia súc, làm giảm số lượng con non và gây ra những tổn thất lâu dài cho đàn gia súc.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Bệnh Tiên Mao Trùng Ở Gia Súc

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, nhưng mỗi phương pháp đều có những hạn chế nhất định. Các phương pháp truyền thống thường tốn thời gian và độ nhạy không cao. Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học như phương pháp ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, nhưng vẫn còn phụ thuộc vào nguồn kháng nguyên nhập khẩu, làm tăng chi phí và hạn chế khả năng sử dụng rộng rãi. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng nhanh chóng, chính xác và chi phí thấp là một thách thức lớn.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Chẩn Đoán Truyền Thống

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi tươi máu hoặc nhuộm Giemsa thường có độ nhạy thấp, đặc biệt là trong giai đoạn mãn tính của bệnh khi số lượng ký sinh trùng trong máu thấp. Ngoài ra, các phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm và tốn nhiều thời gian để thực hiện. Do đó, chúng không phù hợp để sàng lọc kháng nguyên trên diện rộng hoặc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong điều kiện thực địa.

2.2. Sự Phụ Thuộc Vào Kháng Nguyên Nhập Khẩu Trong Phương Pháp ELISA

Phương pháp ELISA là một phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng hiệu quả, nhưng hiện tại Việt Nam vẫn phải sử dụng kít chẩn đoán nhập khẩu, làm tăng chi phí và hạn chế khả năng tiếp cận của người chăn nuôi. Việc sản xuất kháng nguyên trong nước sẽ giúp giảm chi phí và chủ động hơn trong việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Điều này đòi hỏi các nghiên cứu về biểu hiện gen và protein tái tổ hợp để tạo ra nguồn kháng nguyên chất lượng cao.

2.3. Vấn Đề Biến Đổi Kháng Nguyên Của Trypanosoma evansi

Trypanosoma evansi có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt, gây khó khăn cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng và vắc-xin bệnh tiên mao trùng hiệu quả. Việc xác định các kháng nguyên ổn định và bảo tồn trong các chủng Trypanosoma evansi khác nhau là rất quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng và vắc-xin bệnh tiên mao trùng có hiệu quả rộng rãi.

III. Nghiên Cứu Kháng Nguyên Tái Tổ Hợp RoTAT 1

Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi mở ra một hướng đi mới trong việc sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam. Kháng nguyên tái tổ hợp có độ tinh khiết cao, dễ sản xuất với số lượng lớn và có thể khắc phục được những hạn chế của kháng nguyên tự nhiên. Theo Urakawa và cộng sự (2001), kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 có độ nhạy tương đương với kháng nguyên tự nhiên, nhưng có độ đặc hiệu cao hơn, giúp giảm thiểu các phản ứng dương tính giả.

3.1. Ưu Điểm Của Kháng Nguyên Tái Tổ Hợp So Với Kháng Nguyên Tự Nhiên

Kháng nguyên tái tổ hợp có độ tinh khiết cao hơn so với kháng nguyên tự nhiên, giúp giảm thiểu các phản ứng dương tính giả trong phản ứng miễn dịch. Ngoài ra, kháng nguyên tái tổ hợp có thể được sản xuất với số lượng lớn trong các hệ thống biểu hiện gen, đảm bảo nguồn cung ổn định cho việc sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.

3.2. Ứng Dụng Kháng Nguyên RoTAT 1.2 Trong Phát Triển Bộ Kit Chẩn Đoán

Kháng nguyên RoTAT 1.2 có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng dựa trên phương pháp ELISA hoặc các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học khác. Việc sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit chẩn đoán, đồng thời giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng tiếp cận của người chăn nuôi.

3.3. Quy Trình Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp RoTAT 1.2

Quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 thường bao gồm các bước như phá vỡ tế bào, ly tâm, và sắc ký ái lực. Cột ái lực Ni2+ thường được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp có gắn thẻ His. Sau khi tinh sạch, protein tái tổ hợp cần được kiểm tra độ tinh khiết và hoạt tính bằng các phương pháp như điện di SDS-PAGE và phản ứng Western blot.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Sản Xuất Kit Chẩn Đoán Bệnh Tiên Mao Trùng

Nghiên cứu này hướng đến việc sản xuất kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện bệnh sớm và chính xác. Kit chẩn đoán này sẽ giúp người chăn nuôi và các cơ quan thú y có thể nhanh chóng xác định các trường hợp nhiễm bệnh, từ đó có biện pháp điều trị bệnh tiên mao trùng và phòng bệnh tiên mao trùng kịp thời và hiệu quả. Việc sản xuất kit chẩn đoán trong nước cũng giúp giảm chi phí và chủ động hơn trong việc kiểm soát bệnh.

4.1. Xây Dựng Quy Trình Phản Ứng ELISA Phát Hiện Bệnh Tiên Mao Trùng

Quy trình phản ứng ELISA cần được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể, thời gian ủ, và tác nhân block giếng. Việc sử dụng các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính đã được xác định rõ ràng là rất quan trọng để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA.

4.2. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Kit Chẩn Đoán

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng của kit chẩn đoán. Độ nhạy cho biết khả năng của kit chẩn đoán trong việc phát hiện các mẫu dương tính, trong khi độ đặc hiệu cho biết khả năng của kit chẩn đoán trong việc phân biệt các mẫu dương tính và âm tính. Các chỉ số này cần được đánh giá trên một số lượng lớn mẫu để đảm bảo tính tin cậy.

4.3. Thử Nghiệm Kit Chẩn Đoán Trên Mẫu Máu Gia Súc Nghi Nhiễm Bệnh

Kit chẩn đoán cần được thử nghiệm trên các mẫu máu gia súc nghi nhiễm bệnh tiên mao trùng để đánh giá khả năng phát hiện bệnh trong điều kiện thực tế. Kết quả của kit chẩn đoán cần được so sánh với các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng khác như kỹ thuật PCR để xác định tính chính xác.

V. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Bệnh Tiên Mao Trùng

Nghiên cứu về kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 và ứng dụng trong sản xuất kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng đã đạt được những kết quả ban đầu đầy hứa hẹn. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng nguyên, cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của kit chẩn đoán, và đánh giá hiệu quả của kit chẩn đoán trong điều kiện thực địa. Ngoài ra, cần nghiên cứu về biến đổi kháng nguyên của Trypanosoma evansi để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng và vắc-xin bệnh tiên mao trùng có hiệu quả lâu dài.

5.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Sản Xuất Kháng Nguyên Tái Tổ Hợp

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy, biểu hiện gen, và tinh sạch protein tái tổ hợp để tăng năng suất và giảm chi phí sản xuất kháng nguyên. Việc sử dụng các hệ thống biểu hiện gen khác nhau và các phương pháp tinh sạch protein tiên tiến có thể giúp cải thiện chất lượng và số lượng kháng nguyên tái tổ hợp.

5.2. Nghiên Cứu Về Biến Đổi Kháng Nguyên Của Trypanosoma evansi

Nghiên cứu về cơ chế biến đổi kháng nguyên của Trypanosoma evansi là rất quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng và vắc-xin bệnh tiên mao trùng có hiệu quả lâu dài. Việc xác định các kháng nguyên bảo tồn và các epitope có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ có thể giúp phát triển các vắc-xin bệnh tiên mao trùng có hiệu quả rộng rãi.

Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen Mã Hóa Kháng Nguyên Bệnh Tiên Mao Trùng Ở Gia Súc