Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Trong số các tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến, Salmonella spp. (thuộc họ Enterobacteriaceae) là trực khuẩn nguy hiểm gây ra các bệnh lý như sốt thương hàn, viêm dạ dày - ruột cấp tính, nhiễm trùng huyết và ngộ độc thực phẩm hàng loạt. Tại Việt Nam, nhiều vụ ngộ độc thực phẩm quy mô lớn do Salmonella spp. đã được ghi nhận trên thực tế, tiêu biểu như vụ ngộ độc bánh mì tại thành phố Đồng Hới vào ngày 14/10/2015 khiến gần 250 người nhập viện, hay sự cố ngộ độc tại Tiền Giang vào ngày 16/10/2015 khiến gần 800 công nhân phải cấp cứu.

Nhằm giảm thiểu nguy cơ ngộ độc và hạn chế việc lạm dụng hóa chất bảo quản nhân tạo trong thực phẩm, xu hướng nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật có lợi và các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên đang được quan tâm rộng rãi. Nhóm vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất chuyển hóa thứ cấp, đặc biệt là bacteriocin — các peptide hoặc protein kháng khuẩn có khả năng tạo kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, phân giải nucleic acid (DNA, RNA) và tác động lên lớp peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào vi khuẩn gây hại. Rau Húng lủi (Mentha aquatica) là một loại rau gia vị phổ biến, có sức sống khỏe và chứa nhiều hợp chất tự nhiên, là nguồn vật liệu tiềm năng để phân lập các chủng vi khuẩn lactic bản địa có hoạt tính sinh học cao.

Khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:

  1. Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic từ mẫu rau Húng lủi thu thập trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh.
  2. Xác định và khảo sát khả năng kháng Salmonella spp. của dịch bacteriocin thô thu nhận từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập.
  3. Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện tối thiểu một gen mã hóa bacteriocin (Nisin, Plantaricin, Pediocin, Enterocin) từ các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng Salmonella spp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ cây Húng lủi và dịch bacteriocin thô của chúng; chủng vi khuẩn chỉ thị kiểm định hoạt tính kháng khuẩn là Salmonella spp. ATCC 14028.
  • Phạm vi không gian: Mẫu rau Húng lủi được thu thập tại 13 chợ truyền thống thuộc các quận/huyện trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh (Quận 3, Quận 4, Quận 7, Quận 10, Quận 11, Tân Bình, Tân Phú, Hóc Môn). Toàn bộ quá trình nuôi cấy, phân lập, thử nghiệm hoạt tính sinh học và phân tích sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng Vi sinh, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh (CASE).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực nghiệm từ ngày 01/12/2016 đến ngày 30/06/2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh học thực phẩm, sinh hóa học và sinh học phân tử:

  • Khung lý thuyết về vi khuẩn lactic và bacteriocin: Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả năng lên men carbohydrate tạo thành axit lactic theo con đường đồng hình hoặc dị hình. Các chi điển hình gồm Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Bifidobacterium. Bacteriocin của vi khuẩn lactic được tổng hợp qua ribosome, các gen mã hóa thường phân bố trên plasmid, transposon hoặc nhiễm sắc thể theo dạng cụm operon (operon cluster). Các gen mã hóa bacteriocin mục tiêu được khảo sát trong nghiên cứu gồm Pediocin, Enterocin, Nisin và Plantaricin.
  • Đặc điểm vi khuẩn chỉ thị Salmonella spp.: Trực khuẩn Gram âm, kích thước 0,7–1,5 µm × 2–5 µm, di động bằng tiên mao, kỵ khí tùy nghi, phát triển tối ưu ở 35–37°C, pH 7,2; mang các phức hợp kháng nguyên O (vách tế bào), H (lông) và K/Vi (vỏ).
Mẫu rau Húng lủi (13 chợ tại TP.HCM)
Phân lập trên môi trường MRS Agar + 0,5% CaCO3 (ủ 37°C / 24–48h)
Tuyển chọn được 39 chủng vi khuẩn lactic (LAB1 – LAB39)
Phương pháp nhỏ giọt (Drop method)        Thu dịch nổi nuôi cấy, ly tâm 6.000 rpm,
Đánh giá hoạt tính đối kháng tổng hợp     chỉnh pH 6,0 bằng NaOH 1M (Bacteriocin thô)
                                          Phương pháp khuếch tán giếng thạch
                                          Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu
                                          Multiplex PCR (m-PCR1 & m-PCR2)
                                          Phát hiện gen Pediocin, Enterocin, Nisin, Plantaricin

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm đã áp dụng:

  • Phương pháp phân lập và tuyển chọn: Mẫu rau (10 g) được đồng nhất với 90 ml dung dịch pha loãng phục hồi tối đa (MRD) bằng máy dập mẫu trong 30 giây, ủ tăng sinh ở 37°C trong 24 giờ. Cấy trải dịch lên môi trường thạch MRS Agar có bổ sung 0,5% CaCO3, ủ 37°C từ 24 đến 48 giờ để phát hiện khuẩn lạc tạo vòng phân giải canxi cacbonat trong suốt.
  • Phương pháp kiểm tra đặc tính hình thái và sinh hóa:
    • Nhuộm Gram quan sát hình dạng tế bào và khả năng bắt màu dưới kính hiển vi quang học.
    • Thử nghiệm enzyme catalase bằng dung dịch H2O2 30% để xác định hiện tượng sủi bọt khí oxy.
    • Thử nghiệm enzyme cytochrome oxidase bằng thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% trên giấy lọc.
    • Khảo sát khả năng phân giải CaCO3 thông qua sự xuất hiện vòng tan trong suốt quanh khuẩn lạc do axit lactic trung hòa canxi cacbonat (giữ pH môi trường ở mức 5,5–6,0).
  • Phương pháp bảo quản chủng: Lưu trữ dài hạn trong ống Cryobank ở nhiệt độ -20°C và bảo quản ngắn hạn trên ống thạch nghiêng MRS Agar ở 2–8°C.
  • Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn:
    • Phương pháp nhỏ giọt (drop method): Nhỏ 5 µl dịch nuôi cấy LAB lên đĩa MRS Agar, ủ 37°C trong 24 giờ; sau đó phủ lên bề mặt 250 ml môi trường thạch NA đã bổ sung 0,5 ml dịch khuẩn Salmonella spp. ATCC 14028 (nồng độ làm việc 10^6 CFU/ml chuẩn hóa từ độ đục McFarland 0,5). Đo đường kính vòng vô khuẩn sau 24–48 giờ.
    • Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method): Thu nhận bacteriocin thô bằng cách nuôi LAB trong MRS Broth (lắc 200 vòng/phút, 37°C, 48 giờ), ly tâm 6.000 vòng/phút ở 8°C trong 15 phút, thu dịch nổi và điều chỉnh pH về 6,0 bằng NaOH 1M để loại bỏ tác động ức chế của axit hữu cơ. Bơm 50 µl dịch bacteriocin thô vào giếng thạch trên đĩa NA đã trải Salmonella spp., đối chứng bằng 50 µl nước cất vô trùng.
  • Phương pháp sinh học phân tử (Multiplex PCR):
    • Tách chiết DNA khuôn mẫu bằng phương pháp sốc nhiệt ở 100°C trong 15 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận dịch chứa DNA.
    • Thực hiện hai hệ thống phản ứng PCR đa mồi: m-PCR1 (khuếch đại đồng thời gen Pediocin và Enterocin) và m-PCR2 (khuếch đại đồng thời gen Nisin và Plantaricin). Thành phần phản ứng gồm AmpliTaq Gold (0,4 µl), dNTP 0,2 mM (0,5 µl), MgCl2 3 mM (3 µl), PCR Buffer 10X (2,5 µl), mỗi primer 0,5 µl, DNA khuôn 5 µl, tổng thể tích 25 µl. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, nhuộm màu và chụp ảnh dưới đèn UV.
Gen mục tiêu Cặp mồi (Primer) Trình tự Oligonucleotide (5' - 3') Kích thước sản phẩm (bp)
Pediocin Pediocin-F
Pediocin-R		 GGTAAGGCTACCACTTGCAT
CTACTAACGCTTGGCTGGCA		 332
Enterocin Enterocin-F
Enterocin-R		 GGGTACCACTCATAGTGGAA
CCAGCAGTTCTTCCAATTCA		 412
Nisin Nisin-F
Nisin-R		 CTATGAAGTTGCGACGCATCA
CATGCCACTGATACCCAAGT		 608
Plantaricin Plantaricin-F
Plantaricin-R		 GGCATAGTTAAAATTCCCCCC
CAGGTTGCCGCAAAAAAAG		 428

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp các tài liệu học thuật trong nước và quốc tế về ba đối tượng chính: vi khuẩn lactic, cây Húng lủi và vi khuẩn gây bệnh Salmonella spp., cùng nguyên lý kỹ thuật PCR:

  • Lịch sử và phân loại vi khuẩn lactic: Trình bày mốc lịch sử từ khi Carl Scheele phát hiện axit lactic năm 1780, Louis Pasteur chứng minh bản chất lên men năm 1857, đến khi Joseph Lister phân lập thành công Bacterium lactic năm 1878. Phân tích chi tiết hai nhóm lên men đồng hình (Lactobacterium casei, Streptococcus cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbrueckii, Lactobacterium cucumeris ferment) và lên men dị hình (Streptobacterium hassice fermentatae, Lactobacterium lycopersici).
  • Tổng quan về bacteriocin: Phân tích cơ chế tác động màng tế bào, tính bền nhiệt, ảnh hưởng của pH và nguồn nitơ lên sự sinh tổng hợp bacteriocin. Điểm qua các công trình nghiên cứu trên thế giới (Kekessy và Piguet 1970; Tagg et al. 1976; Callewaert và De Vuyst 1999; Khalid et al. 1999 với lactocin LC-09 chịu nhiệt 100°C; Todorov et al. 2004, 2007; Ji Yeun Kim et al. 2014 phân lập 488 dòng LAB từ kim chi và thịt gà) và các nghiên cứu tại Việt Nam (Nguyễn Thị Hoài Hà phân lập Lactobacillus plantarum L24; Lê Thanh Mai 2002; Tăng Thị Chính và Đặng Đình Kim 2004; Nguyễn Thị Thủy Tiên et al. 2016 khảo sát hoạt tính ức chế của L. delbrueckii subsp. bulgaricus B3 và Weissella cibaria T5).
  • Cây Húng lủi (Mentha aquatica): Cung cấp phân loại thực vật học, hình thái thân rễ bò chùm, lá nhỏ có răng cưa, chứa các hợp chất hoạt tính như limonene, dihydrocarvone, cineol và perillyl alcohol.
  • Vi khuẩn Salmonella spp. và kỹ thuật PCR: Hệ thống hóa đặc điểm sinh hóa, cấu trúc kháng nguyên O, H, K (Vi), cơ chế xâm nhập mảng Peyer gây hoại tử niêm mạc ruột non; cùng nguyên lý 3 bước (biến tính 94°C, bắt cặp mồi 55–65°C, kéo dài chuỗi 72°C) của phản ứng PCR do Kary Mullis phát minh năm 1985.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu, thiết bị và quy trình thực nghiệm tại Phòng Vi sinh (CASE):

  • Thu thập mẫu: Ghi nhận 3 đợt thu thập mẫu rau Húng lủi tại 13 khu chợ trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh (đợt 1 ngày 21/02/2017 phân lập được 16 chủng; đợt 2 ngày 02/03/2017 phân lập được 9 chủng; đợt 3 ngày 08/03/2017 phân lập được 8 chủng và bổ sung thêm các mẫu chợ khác, nâng tổng số lên 39 chủng).
  • Quy trình phân lập và thử nghiệm sinh hóa: Mô tả chuẩn hóa thao tác nhuộm Gram, thử nghiệm enzyme catalase với H2O2 30%, thử nghiệm oxidase với giấy tẩm thuốc thử p-phenylenediamine và kiểm tra vòng tan CaCO3 trên thạch MRS.
  • Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Trình bày chi tiết cách chuẩn bị dịch huyền phù Salmonella spp. ATCC 14028 đạt 10^6 CFU/ml, kỹ thuật nhỏ giọt dịch khuẩn và kỹ thuật đục giếng thạch nạp 50 µl dịch bacteriocin thô đã chỉnh pH về 6,0.
  • Quy trình Multiplex PCR: Chi tiết các thông số chu trình nhiệt:
    • Phản ứng m-PCR1 (Pediocin & Enterocin): 1 chu kỳ biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; 40 chu kỳ luân nhiệt gồm biến tính 94°C trong 45 giây, bắt cặp mồi ở 55°C trong 45 giây, kéo dài ở 72°C trong 45 giây; kết thúc bằng 1 chu kỳ kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút.
    • Phản ứng m-PCR2 (Nisin & Plantaricin): 1 chu kỳ biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; 40 chu kỳ luân nhiệt gồm biến tính 94°C trong 45 giây, bắt cặp mồi ở 57°C trong 45 giây, kéo dài ở 72°C trong 45 giây; kết thúc bằng 1 chu kỳ kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút.
Thông số phản ứng Hệ m-PCR1 (Pediocin & Enterocin) Hệ m-PCR2 (Nisin & Plantaricin)
Biến tính ban đầu 94°C / 5 phút 94°C / 5 phút
Số chu kỳ lặp lại 40 chu kỳ 40 chu kỳ
- Biến tính từng chu kỳ 94°C / 45 giây 94°C / 45 giây
- Bắt cặp mồi (Annealing) 55°C / 45 giây 57°C / 45 giây
- Kéo dài chuỗi (Extension) 72°C / 45 giây 72°C / 45 giây
Kéo dài chuỗi kết thúc 72°C / 5 phút 72°C / 5 phút

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình sàng lọc 39 chủng vi khuẩn lactic ký hiệu từ LAB1 đến LAB39:

  • Kết quả phân lập và định tính sinh hóa:
    • Trong 39 chủng phân lập được, có 30 chủng là vi khuẩn Gram dương (+), 9 chủng là vi khuẩn Gram âm (-).
    • 100% chủng (39/39) đều có khả năng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS Agar, tạo vòng tan trong suốt xung quanh khuẩn lạc.
    • Đa số các chủng đều âm tính với enzyme catalase (không sủi bọt khí O2 khi nhỏ H2O2), chỉ ghi nhận phản ứng dương tính ở 1 số chủng ngoại lệ (như LAB4, LAB25 trong bảng kiểm tra hình thái sinh hóa).
    • 100% chủng (39/39) đều âm tính với phản ứng oxydase (không làm đổi màu que thử sang xanh dương) và không sinh bào tử.
  • Kết quả khảo sát khả năng kháng Salmonella spp. bằng phương pháp nhỏ giọt:
    • Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, có 24/39 chủng (chiếm tỷ lệ 61,54%) xuất hiện vòng ức chế sáng xung quanh khuẩn lạc đối kháng với Salmonella spp. ATCC 14028.
    • Phân loại mức độ ức chế: 8 chủng thể hiện hoạt tính kháng mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 3,5 cm; 9 chủng có hoạt tính kháng trung bình với đường kính vòng từ 2,5 cm đến 3,2 cm; 7 chủng có hoạt tính kháng yếu với đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn 2,5 cm.
    • Tác giả thảo luận rằng hoạt tính ức chế ở phương pháp nhỏ giọt là kết quả tổng hợp của các hợp chất kháng khuẩn có sẵn trong tế bào và các chất sinh ra trong quá trình sinh trưởng như axit lactic, bacteriocin, H2O2, CO2 và diacetyl.
Nhóm đặc điểm thực nghiệm Kết quả ghi nhận trên 39 chủng phân lập (LAB1 – LAB39)
Nhuộm Gram 30 chủng Gram dương (+); 9 chủng Gram âm (-)
Phân giải CaCO3 39/39 chủng dương tính (+) (tạo vòng tan trong suốt)
Thử nghiệm Oxydase 39/39 chủng âm tính (-) (không đổi màu xanh dương)
Thử nghiệm Catalase Phần lớn âm tính (-) (không sủi bọt khí)
Kháng khuẩn (Nhỏ giọt) 24/39 chủng dương tính (61,54%):
- Kháng mạnh (> 3,5 cm): 8 chủng
- Kháng trung bình (2,5 – 3,2 cm): 9 chủng
- Kháng yếu (< 2,5 cm): 7 chủng
- Không kháng: 15 chủng
  • Kết quả phương pháp khuếch tán giếng thạch và phát hiện gen: Trình bày dữ liệu đo đường kính vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô (sau khi trung hòa pH 6,0 để loại trừ tác động của axit) và hình ảnh điện di sản phẩm Multiplex PCR nhằm xác định sự hiện diện của các đoạn gen mục tiêu mã hóa cho Pediocin (332 bp), Enterocin (412 bp), Nisin (608 bp) hoặc Plantaricin (428 bp).

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

  • Kết luận: Khái quát lại toàn bộ kết quả phân lập từ nguồn rau Húng lủi, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lactic mang hoạt tính đối kháng Salmonella spp. và khả năng phát hiện các gen mã hóa bacteriocin bằng phương pháp Multiplex PCR.
  • Kiến nghị: Đề xuất mở rộng nghiên cứu tinh sạch hoạt chất bacteriocin, giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chính xác loài và tiến hành thử nghiệm bảo quản trên các nền mẫu thực phẩm thực tế.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã công bố các kết quả thực nghiệm với các dữ liệu định lượng cụ thể:

  • Dữ liệu phân lập và đặc tính sinh hóa: Phân lập thành công 39 chủng vi khuẩn lactic từ mẫu rau Húng lủi thu thập tại TP. Hồ Chí Minh qua 3 đợt khảo sát. Xác định được 30 chủng vi khuẩn Gram dương, 100% chủng phân giải CaCO3 và 100% chủng âm tính với enzyme oxydase.
  • Dữ liệu hoạt tính kháng khuẩn: Bằng phương pháp nhỏ giọt, xác định được 24/39 chủng (61,54%) có khả năng ức chế trực khuẩn Salmonella spp. ATCC 14028; trong đó chọn lọc được 8 chủng có hoạt tính đối kháng mạnh với đường kính vòng ức chế vượt trên 3,5 cm.
  • Dữ liệu sinh học phân tử: Thiết lập và tối ưu hóa thành công quy trình Multiplex PCR với 2 hệ phản ứng (m-PCR1 và m-PCR2) sử dụng 4 cặp mồi đặc hiệu để xác định sự hiện diện của các gen mã hóa bacteriocin kích thước 332 bp (Pediocin), 412 bp (Enterocin), 608 bp (Nisin) và 428 bp (Plantaricin).

Đóng góp học thuật và thực tiễn do tác giả nêu:

  • Nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng khuẩn phân lập từ rau Húng lủi đạt 61,54% (24/39 chủng), cao hơn đáng kể so với kết quả sàng lọc của Ji Yeun Kim, Janay A. Gunther IV và Jung-Lim Lee (2014) trên kim chi và thịt gà tại Hoa Kỳ (chỉ thu nhận được 16 dòng từ kim chi và 14 dòng từ thịt gà có hoạt tính kháng Salmonella spp. trong tổng số 488 dòng vi khuẩn lactic phân lập).
  • Cung cấp dẫn liệu khoa học về hệ vi sinh vật lactic bản địa trên cây Húng lủi tại Việt Nam, mở ra hướng ứng dụng bacteriocin tự nhiên trong việc kiểm soát vi khuẩn gây ngộ độc Salmonella spp., hỗ trợ phát triển các chế phẩm sinh học bảo quản nông sản và thực phẩm an toàn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung được tác giả trình bày trong văn bản:

  • Hạn chế:
    • Nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc khảo sát dịch bacteriocin dạng thô (dịch nổi sau ly tâm đã trung hòa pH 6,0), chưa thực hiện các bước tách chiết, tinh sạch sâu và xác định trọng lượng phân tử cụ thể của peptide kháng khuẩn bằng sắc ký hoặc điện di SDS-PAGE.
    • Các chủng vi khuẩn lactic mới chỉ được định danh sơ bộ dựa trên đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa cơ bản (Gram, catalase, oxidase, phân giải CaCO3), chưa tiến hành giải trình tự gen 16S rRNA để định danh chính xác đến cấp độ loài và chi.
    • Phổ kháng khuẩn chỉ mới tập trung khảo sát trên một chủng chỉ thị duy nhất là Salmonella spp. ATCC 14028, chưa mở rộng đánh giá đối kháng trên các chủng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm khác (E. coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus...).
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiến hành giải trình tự vùng gen 16S rRNA cho các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất để xác định danh tính phân loại học chính xác.
    • Nghiên cứu quy trình tinh sạch bacteriocin và đánh giá độ bền sinh học của hoạt chất dưới tác động của nhiệt độ cao, enzym phân giải protein (protease) và các dải pH khác nhau.
    • Thử nghiệm ứng dụng dịch bacteriocin hoặc chế phẩm vi khuẩn lactic tuyển chọn vào mô hình bảo quản các sản phẩm thực phẩm thực tế (thịt tươi sống, rau củ, thủy hải sản) nhằm đánh giá khả năng ức chế Salmonella spp. trong điều kiện bảo quản thực tế.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng và mục đích học thuật:

  • Đối tượng hưởng lợi: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Đảm bảo chất lượng và An toàn vệ sinh thực phẩm.
  • Nội dung giá trị phục vụ tham khảo:
    • Quy trình phân lập và sàng lọc vi sinh vật: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ mô thực vật tươi sống bằng môi trường chọn lọc MRS Agar bổ sung 0,5% CaCO3; các phương pháp thử nghiệm sinh hóa định tính chuẩn mực (nhuộm Gram, catalase, oxidase).
    • Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn đối kháng: Quy trình thực nghiệm so sánh giữa phương pháp nhỏ giọt (đánh giá tác động tổng hợp gồm axit hữu cơ và chất kháng khuẩn) và phương pháp khuếch tán giếng thạch sử dụng dịch trung hòa pH 6,0 (đánh giá chuyên biệt hoạt tính của bacteriocin).
    • Bộ mồi và quy trình Multiplex PCR: Thông tin chi tiết về trình tự các cặp primer, kích thước sản phẩm và thông số chu trình luân nhiệt của hai hệ phản ứng m-PCR1 và m-PCR2 phục vụ khuếch đại 4 nhóm gen mã hóa bacteriocin phổ biến (Pediocin, Enterocin, Nisin, Plantaricin).

Câu hỏi thường gặp

1. Đề tài đã thu thập bao nhiêu mẫu và phân lập được tổng cộng bao nhiêu chủng vi khuẩn lactic từ cây Húng lủi?

Đề tài đã thực hiện 3 đợt thu thập mẫu rau Húng lủi tại 13 khu chợ thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh (gồm Chợ Nguyễn Tri Phương, Chợ Ông Hoàng, Chợ Thành Thái, Chợ Trần Văn Quang, Chợ Huỳnh Văn Chính, Chợ Xóm Chiếu, Chợ Lữ Gia, Chợ Bùi Văn Ba, Chợ Nguyễn Đình Chiểu, Chợ Võ Thành Trang, Chợ Nhật Tảo, Chợ Hóc Môn...). Tổng cộng đã phân lập và khảo sát đặc tính của 39 chủng vi khuẩn lactic, được ký hiệu từ LAB1 đến LAB39.

2. Vai trò của việc bổ sung 0,5% CaCO3 vào môi trường MRS Agar khi phân lập vi khuẩn lactic là gì?

Khi vi khuẩn lactic sinh trưởng, chúng lên men đường và tiết ra axit lactic. Axit lactic phản ứng với CaCO3 có trong môi trường thạch, chuyển hóa CaCO3 thành muối canxi lactat hòa tan, giải phóng CO2 và H2O. Quá trình này giúp duy trì pH môi trường ở mức 5,5–6,0, đồng thời tạo ra một vòng trong suốt quanh khuẩn lạc vi khuẩn lactic, giúp dễ dàng nhận biết và tuyển chọn chủng sinh axit trên đĩa thạch đục.

3. Tại sao trong phương pháp khuếch tán giếng thạch, dịch nổi nuôi cấy vi khuẩn lactic cần phải được điều chỉnh về pH 6,0 bằng NaOH 1M?

Vi khuẩn lactic khi sinh trưởng tạo ra nhiều axit hữu cơ (đặc biệt là axit lactic) làm giảm mạnh pH môi trường, bản thân môi trường axit cũng có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị. Việc điều chỉnh dịch nổi sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 1M nhằm trung hòa lượng axit hữu cơ này, đảm bảo vòng vô khuẩn hình thành quanh giếng thạch chỉ do tác động kháng khuẩn đặc hiệu của bacteriocin chứ không phải do tác động của axit.

4. Bốn gen mã hóa bacteriocin được khảo sát trong nghiên cứu bằng kỹ thuật Multiplex PCR là gì và kích thước sản phẩm dự kiến là bao nhiêu?

Nghiên cứu khảo sát 4 gen mã hóa bacteriocin thông qua hai hệ phản ứng Multiplex PCR:

  • Hệ m-PCR1: Gen mã hóa Pediocin (kích thước sản phẩm khuếch đại là 332 bp) và gen mã hóa Enterocin (kích thước sản phẩm 412 bp).
  • Hệ m-PCR2: Gen mã hóa Nisin (kích thước sản phẩm khuếch đại là 608 bp) và gen mã hóa Plantaricin (kích thước sản phẩm 428 bp).

5. Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt cho thấy tỷ lệ và mức độ kháng Salmonella spp. của các chủng phân lập như thế nào?

Trong số 39 chủng được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt đối kháng với Salmonella spp. ATCC 14028, có 24 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn (tỷ lệ 61,54%). Trong đó, có 8 chủng thể hiện hoạt tính kháng mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 3,5 cm; 9 chủng có hoạt tính kháng trung bình với đường kính vòng 2,5–3,2 cm; và 7 chủng có hoạt tính kháng yếu với đường kính vòng nhỏ hơn 2,5 cm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Trúc Linh đã phân lập thành công 39 chủng vi khuẩn lactic từ nguồn rau Húng lủi thu thập tại các chợ trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh và xác định được 24 chủng có hoạt tính ức chế trực khuẩn gây ngộ độc Salmonella spp. ATCC 14028. Bằng việc kết hợp phương pháp đối kháng vi sinh vật và kỹ thuật sinh học phân tử Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu (Pediocin, Enterocin, Nisin, Plantaricin), nghiên cứu đã xác định được tiềm năng sinh tổng hợp bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic bản địa. Đây là nguồn dữ liệu thực nghiệm có giá trị khoa học, tạo cơ sở cho việc phát triển các nghiên cứu ứng dụng chất kháng khuẩn sinh học trong bảo quản và nâng cao an toàn thực phẩm.