Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Salmonella SPP Của Vi Khuẩn Lactic Phân Lập Từ Cây Húng Lủi

• Tác giả: Trần Trúc Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Trương Huỳnh Anh Vũ
• Trường học: Đại học Nguyễn Tất Thành
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Salmonella SPP Của Vi Khuẩn Lactic Từ Cây Húng Lủi
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Mục tiêu đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
• 1.2. Lịch sử phát triển
• 1.3. Đặc điểm chung
• 1.4. Phân loại vi khuẩn lactic
• 1.5. Đặc điểm sinh trưởng
• 1.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
• 1.7. Gen mã hóa bacteriocin của vi khuẩn lactic
• 1.8. Tổng quan về cây Húng lủi
• 1.8.1. Giới thiệu cây Húng lủi
• 1.8.2. Đặc điểm hình thái
• 1.9. Tổng quan về Salmonella spp.
• 1.9.1. Lịch sử phát hiện
• 1.9.2. Đặc điểm chung
• 1.9.3. Đặc điểm sinh hóa
• 1.9.4. Đặc điểm kháng nguyên
• 1.9.5. Nguồn gốc gây nhiễm
• 1.9.6. Cơ chế gây bệnh
• 1.10. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 1.10.1. Lịch sử ra đời
• 1.10.2. Phân tích kết quả PCR
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
• 2.1.1. Thời gian thực hiện
• 2.1.2. Địa điểm thực hiện
• 2.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị
• 2.3. Phương pháp thực hiện
• 2.3.1. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn lactic từ cây Húng lủi
• 2.3.2. Phương pháp tuyển chủng vi khuẩn lactic từ cây Húng lủi
• 2.3.3. Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn lactic
• 2.3.4. Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật
• 2.3.5. Phương pháp chuẩn bị dịch khuẩn Salmonella spp.
• 2.3.6. Xác định hoạt tính kháng Salmonella spp. của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp nhỏ giọt
• 2.3.7. Xác định hoạt tính kháng Salmonella spp. của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
• 2.3.8. Phương pháp phát hiện các gen mã hóa bacteriocin bằng kỹ thuật PCR
• 2.3.9. Ly trích DNA vi khuẩn lactic
• 2.3.10. Xác định gen mã hóa Pediocin và Enterocin của vi khuẩn lactic bằng m-PCR1
• 2.3.11. Xác định gen mã hóa Nisin và Plantaricin của vi khuẩn lactic bằng m-PCR2
• 2.3.12. Thành phần và quy trình nhiệt m-PCR1
• 2.3.13. Thành phần và quy trình nhiệt m-PCR2
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic (LAB) từ rau Húng lủi
• 3.2. Kết quả khả năng ức chế Salmonella spp. bằng phương pháp nhỏ giọt
• 3.3. Kết quả khả năng ức chế Salmonella spp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
• 3.4. Kết quả phát hiện các gen mã hóa Bacteriocin
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Các thành phần trong phản ứng PCR
• Phụ lục 2: Khảo sát các điều kiện phản ứng PCR để khuếch đại gen mục tiêu
• Phụ lục 3: Thành phần và cách pha chế thuốc nhuộm

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Kháng Salmonella spp

Ngộ độc thực phẩm, đặc biệt do Salmonella spp., là mối quan tâm lớn của xã hội. Salmonella spp. là vi sinh vật phổ biến gây ngộ độc nguy hiểm, thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác. Việc sử dụng vi khuẩn lactic để ức chế Salmonella spp. đang được chú trọng. Vi khuẩn lactic tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Quá trình lên men còn tạo ra các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế vi khuẩn có hại, làm tăng hàm lượng một số vitamin, có thể phân hủy các độc tố có trong thực phẩm. Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp nên bacteriocin, có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác. Vì vậy, việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic và bacteriocin là một vấn đề hết sức thiết thực và có ý nghĩa to lớn trong cuộc sống con người. Đề tài "Nghiên cứu khả năng kháng Salmonella spp. của vi khuẩn lactic phân lập từ cây Húng lủi" nhằm phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn cao, trong đó có Salmonella spp., để ứng dụng vào việc bảo quản thực phẩm.

1.1. Tầm Quan Trọng Của An Toàn Thực Phẩm Hiện Nay

An toàn thực phẩm đang là vấn đề cấp thiết. Các vụ ngộ độc hàng loạt do Salmonella spp. đã xảy ra tại Việt Nam, gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng. Nhu cầu về thực phẩm sạch, an toàn ngày càng tăng cao. Việc tìm kiếm các giải pháp tự nhiên để kiểm soát vi khuẩn gây bệnh như Salmonella spp. là vô cùng quan trọng. Nghiên cứu này hướng đến việc cung cấp một giải pháp tiềm năng từ nguồn dược liệu tự nhiên là cây húng lủi.

1.2. Giới Thiệu Về Vi Khuẩn Lactic Và Khả Năng Kháng Khuẩn

Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi sinh vật có lợi, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm lên men. Chúng có khả năng tạo ra các chất kháng sinh tự nhiên, bao gồm bacteriocin, có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Việc sử dụng vi khuẩn lactic như một biện pháp bảo vệ sinh học đang ngày càng được quan tâm, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh gia tăng.

II. Thách Thức Từ Salmonella spp

Salmonella spp. là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm trùng đường ruột trên toàn thế giới. Việc điều trị nhiễm Salmonella thường gặp khó khăn do tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh là vô cùng cần thiết. Nghiên cứu khoa học về khả năng ức chế Salmonella spp. bằng các phương pháp tự nhiên, như sử dụng vi khuẩn lactic và các hợp chất từ cây húng lủi, đang được đẩy mạnh.

2.1. Mối Nguy Hiểm Từ Nhiễm Khuẩn Salmonella spp. Đối Với Sức Khỏe

Nhiễm Salmonella spp. có thể gây ra các triệu chứng như tiêu chảy, sốt, đau bụng và nôn mửa. Trong một số trường hợp nghiêm trọng, nhiễm Salmonella có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết và tử vong. Đặc biệt, trẻ em, người già và những người có hệ miễn dịch suy yếu là những đối tượng dễ bị tổn thương nhất. Việc phòng ngừa nhiễm khuẩn Salmonella spp. là vô cùng quan trọng.

2.2. Tình Trạng Kháng Kháng Sinh Của Salmonella spp. Hiện Nay

Tình trạng kháng kháng sinh của Salmonella spp. đang trở thành một vấn đề toàn cầu. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong chăn nuôi và y tế đã góp phần làm gia tăng các chủng Salmonella kháng thuốc. Điều này gây khó khăn cho việc điều trị và làm tăng nguy cơ lây lan của bệnh. Cần có các giải pháp thay thế kháng sinh hiệu quả để kiểm soát Salmonella spp..

2.3. Hướng Nghiên Cứu Các Giải Pháp Thay Thế Kháng Sinh Tự Nhiên

Trước tình hình kháng kháng sinh gia tăng, các nhà khoa học đang tập trung vào việc nghiên cứu các giải pháp thay thế kháng sinh tự nhiên. Trong đó, việc sử dụng vi khuẩn lactic và các hợp chất từ thực vật, như tinh dầu húng lủi, được xem là một hướng đi đầy tiềm năng. Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế Salmonella mạnh mẽ và an toàn.

III. Phương Pháp Phân Lập Vi Khuẩn Lactic Từ Cây Húng Lủi

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ cây húng lủi. Cây húng lủi được biết đến với nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe, bao gồm khả năng kháng khuẩn tự nhiên. Quá trình phân lập bao gồm việc thu thập mẫu, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, và xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được. Mục tiêu là tìm ra các chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế Salmonella spp. mạnh nhất.

3.1. Quy Trình Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Lactic Hiệu Quả

Quy trình phân lập bắt đầu bằng việc thu thập mẫu cây húng lủi tươi. Mẫu được xử lý và nuôi cấy trên môi trường MRS (de Man, Rogosa and Sharpe), một môi trường chọn lọc cho vi khuẩn lactic. Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường MRS được kiểm tra hình thái và thực hiện các xét nghiệm sinh hóa để xác định chúng là vi khuẩn lactic. Các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn dựa trên khả năng sinh axit lactic và khả năng kháng khuẩn.

3.2. Xác Định Đặc Tính Sinh Hóa Của Các Chủng Vi Khuẩn Lactic

Các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic được xác định thông qua các xét nghiệm như khả năng lên men đường, khả năng sinh catalase, và khả năng chịu muối. Các xét nghiệm này giúp phân loại và xác định các chủng vi khuẩn lactic khác nhau. Thông tin này rất quan trọng để lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng ứng dụng cao.

3.3. Phương Pháp Đánh Giá Khả Năng Kháng Khuẩn In Vitro

Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic được đánh giá in vitro bằng các phương pháp như phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp pha loãng. Các phương pháp này cho phép xác định khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella spp. của các chủng vi khuẩn lactic. Các chủng vi khuẩn lactic có vòng ức chế lớn nhất được chọn để nghiên cứu tiếp.

IV. Đánh Giá Khả Năng Kháng Salmonella spp

Nghiên cứu tập trung vào đánh giá khả năng kháng Salmonella spp. của bacteriocin được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ cây húng lủi. Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi vi khuẩn lactic, có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Việc xác định và khai thác bacteriocin từ vi khuẩn lactic có thể mở ra các ứng dụng mới trong an toàn thực phẩm và điều trị nhiễm khuẩn.

4.1. Chiết Xuất Bacteriocin Thô Từ Các Chủng Vi Khuẩn Lactic

Để đánh giá khả năng kháng Salmonella spp., bacteriocin thô được chiết xuất từ các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập. Quá trình chiết xuất bao gồm nuôi cấy vi khuẩn lactic trong môi trường thích hợp, sau đó thu nhận dịch nuôi cấy và loại bỏ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. Dịch thu được chứa bacteriocin thô và được sử dụng cho các thử nghiệm kháng khuẩn.

4.2. Thử Nghiệm Khả Năng Ức Chế Salmonella spp. Bằng Bacteriocin

Khả năng ức chế Salmonella spp. của bacteriocin thô được đánh giá bằng các phương pháp như phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp pha loãng. Các phương pháp này cho phép xác định nồng độ bacteriocin cần thiết để ức chế sự phát triển của Salmonella spp. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng ứng dụng của bacteriocin trong việc kiểm soát Salmonella spp..

4.3. Phân Tích Cơ Chế Kháng Khuẩn Của Bacteriocin Nếu Có

Nếu có điều kiện, nghiên cứu có thể đi sâu vào phân tích cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin. Điều này có thể bao gồm việc xác định các mục tiêu tác động của bacteriocin trên tế bào Salmonella spp., chẳng hạn như màng tế bào hoặc các enzyme quan trọng. Việc hiểu rõ cơ chế kháng khuẩn sẽ giúp tối ưu hóa việc sử dụng bacteriocin trong các ứng dụng thực tế.

V. Phát Hiện Gen Mã Hóa Bacteriocin Bằng Kỹ Thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để phát hiện các gen mã hóa bacteriocin trong các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng Salmonella spp. Việc xác định các gen mã hóa bacteriocin giúp hiểu rõ hơn về khả năng sản xuất bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic và tiềm năng ứng dụng của chúng trong an toàn thực phẩm và ứng dụng sinh học.

5.1. Ly Trích DNA Từ Các Chủng Vi Khuẩn Lactic Phân Lập

Để thực hiện PCR, DNA được ly trích từ các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập. Quá trình ly trích DNA bao gồm phá vỡ tế bào vi khuẩn, loại bỏ protein và RNA, và thu nhận DNA tinh khiết. DNA tinh khiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.

5.2. Thiết Kế Mồi Đặc Hiệu Cho Các Gen Mã Hóa Bacteriocin

Mồi (primer) đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự DNA của các gen mã hóa bacteriocin đã biết. Mồi được sử dụng để khuếch đại các gen mục tiêu trong phản ứng PCR. Việc thiết kế mồi chính xác là rất quan trọng để đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR.

5.3. Thực Hiện Phản Ứng PCR Và Phân Tích Kết Quả Điện Di

Phản ứng PCR được thực hiện với DNA khuôn, mồi đặc hiệu, và các enzyme cần thiết. Sau khi kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Các băng DNA có kích thước phù hợp với gen mục tiêu cho thấy sự hiện diện của gen mã hóa bacteriocin trong chủng vi khuẩn lactic.

VI. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Kết quả nghiên cứu này có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe và các giải pháp an toàn thực phẩm dựa trên vi khuẩn lactic và bacteriocin. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất bacteriocin, đánh giá hiệu quả in vivo, và phát triển các sản phẩm ứng dụng cụ thể.

6.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Sản Xuất Thực Phẩm Lên Men

Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng Salmonella spp. có thể được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm lên men như sữa chua, phô mai, và rau quả muối chua. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn lactic này có thể giúp cải thiện an toàn thực phẩm và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm.

6.2. Phát Triển Các Sản Phẩm Probiotics Chứa Vi Khuẩn Lactic

Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng Salmonella spp. có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm probiotics. Probiotics là các chế phẩm chứa vi sinh vật có lợi, có tác dụng cải thiện hệ tiêu hóa và tăng cường hệ miễn dịch. Việc sử dụng probiotics có thể giúp phòng ngừa nhiễm khuẩn Salmonella spp..

6.3. Nghiên Cứu In Vivo Và Thử Nghiệm Lâm Sàng Nếu Có

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào đánh giá hiệu quả của vi khuẩn lactic và bacteriocin in vivo trên động vật hoặc trong các thử nghiệm lâm sàng trên người. Các nghiên cứu này sẽ cung cấp bằng chứng khoa học về hiệu quả và lợi ích sức khỏe của việc sử dụng vi khuẩn lactic và bacteriocin trong việc kiểm soát Salmonella spp..