MỞ ĐẦU Dựa trên quá trình đông máu tự nhiên của cơ thể các nghiên cứu đã tìm cách tách chiết, cố gắng thu thập được lượng fibrinogen và thrombin trong huyết tương nhiều chất cô đặc để tạo ra keo fibrin. Với chức năng là một loại keo sinh học, giúp cầm máu và gắn kết mô, bịt kín vết thương, keo fibrin được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực phẫu thuật như cắt mộng ghép kết mạc, phẫu thuật cột sống… Có nhiều phương pháp thu thập fibrinogen và thrombin. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng. Ví dụ, phương pháp tách fibrinogen có sử dụng protamin cho kết quả nhanh và hiệu quả, nhưng chưa kiểm chứng được sự ảnh hưởng của thuốc lên keo fibrin.
Hiện nay, các công ty thương mại đã thu thập các thành phần của keo từ huyết tương của động vật (bò, ngựa…) hoặc máu của nhiều người gộp lại, điều này tiềm ẩn nguy cơ lây các bệnh qua đường máu. Vì vậy, xu hướng mới được các nghiên cứu tập trung gần đây là sản xuất keo fibrin tự thân. Nghĩa là sản phẩm keo tạo ra được dùng cho chính đối tượng đó, nhằm giảm nguy cơ lây truyền, giảm phản ứng của cơ thể với keo khác loài. Một số công bố thực tế cho thấy đã tách chiết được fibrinogen từ chính máu của người đó, nhưng lại sử dụng thrombin thương mại để tạo keo fibrin, vậy bản chất của keo vẫn không hoàn toàn mang nghĩa tự thân.
Các nghiên cứu về tác dụng của keo fibrin gần đây cũng chỉ ra, keo fibrin còn đóng một vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình lành vết thương do fibrin và fibrinogen rất quan trọng đối với sự ổn định cấu trúc của vết thương. Tuy nhiên, nếu sử dụng keo fibrin đơn thuần đôi khi chỉ mang tính chất cầm máu và kích thích liền sẹo mà không có khả năng kháng khuẩn ở các vết thương chậm liền hoặc không liền. Để tăng cường hiệu quả của keo fibrin thương mại, người ta đã rắc kháng sinh lên keo với mục đích cung cấp một lượng kháng sinh nhanh, nồng độ cao tại vết thương. Hiện nay, tại Việt Nam đã có Vũ Thị Kim Liên và cộng sự chế tạo thành công keo fibrin tự thân tách chiết có sử dụng protamin và chưa có công bố nào nghiên cứu về việc tạo mẫu keo fibrin có sự hòa trộn kháng sinh.
2 Từ những vấn đề trên, với mong muốn tìm được phương pháp tách các thành phần tạo keo fibrin từ huyết tương tự thân đơn giản, rẻ tiền và mang tính kháng khuẩn chúng tôi đã lựa chọn phương pháp gây đông lạnh huyết tương nhằm giảm thiểu tối đa lượng hóa chất trong quá trình tách chiết, đồng thời sử dụng kháng sinh cefazolin kết hợp với keo. Sở dĩ chúng tôi sử dụng cefazolin vì, cefazolin là kháng sinh phổ rộng, thường được dùng trên lâm sàng, dễ mua, giá thành rẻ. Do vậy chúng tôi thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và làm lành vết loét của keo fibrin tự thân trộn cefazolin trên thỏ thực nghiệm”. Với các mục tiêu sau: 1.
Xây dựng quy trình tạo keo fibrin in vitro bằng phương pháp gây đông lạnh huyết tương. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của keo fibrin kết hợp với kháng sinh Cefazolin. Đánh giá hiệu quả cầm máu, làm lành vết thương và vết loét của keo fibrin tự thân trên thỏ thực nghiệm. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Quá trình đông máu Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc nhờ sự chuyển fibrinogen thành các sợi fibrin không hòa tan dưới tác dụng của thrombin. Đông máu đóng vai trò quan trọng trong quá trình cầm máu, đây là quá trình phức tạp tạo ra các cục máu đông, là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Ngay sau khi xảy ra chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu, phản ứng đông máu được kích hoạt, các tiểu cầu ngưng tập tại vùng tổn thương. Các tiểu cầu này giải phóng các yếu tố gây khởi động quá trình đông máu.
Quá trình này được diễn ra theo hai con đường chính là đông máu nội sinh và đông máu ngoại sinh. Trên thực tế có sự xảy ra đồng thời của cả hai con đường và cả hai con đường cuối cùng đều dẫn tới con đường đông máu chung với sự hoạt hóa yếu tố đông máu X, yếu tố này có nhiệm vụ chuyển prothrombin thành thrombin – là một chất có vai trò vô cùng quan trọng trong cơ chế đông cầm máu. Thrombin sẽ kích thích hình thành fibrin (là yếu tố Ia) từ fibrinogen (yếu tố I), fibrin có vai trò giam giữ tiểu cầu và các thành phần khác của máu tạo nên cục máu đông ổn định vững chắc có khả năng cầm máu tại vị trí tổn thương. Khi các tổn thương lành lại, cục đông fibrin không còn cần thiết nữa, nó sẽ được tan đi nhờ các chất gây tiêu fibrin trong cơ thể như plasmin nhằm trả lại sự thông thoáng cho lòng mạch.
Sau quá trình này lượng các yếu tố đông máu dư thừa sẽ được các chất ức chế fibrin làm bất hoạt. Con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh 1. Hai thành phần cơ bản của keo fibrin 1. Đặc điểm của fibrinogen Fibrinogen là một glycoprotein hòa tan trong huyết tương, do gan sản xuất, nó là yếu tố đông máu thứ nhất trong 13 yếu tố đông máu của huyết tương.
Fibrinogen chiếm khoảng 0,2% thể tích máu toàn phần (khoảng 3 mg ml huyết tương), chứa 3 cặp chuỗi polypeptide (α, β, γ) được nối với nhau bởi cầu nối disulphua tạo thành một cấu trúc đối xứng. Vùng trung tâm của fibrinogen chứa fibrinopeptides α và β, fibrinopeptides α và β sẽ được tách khi có mặt của thrombin để tạo thành fibrin đơn phân (fibrin monomer). Sau khi fibrin monomer kết hợp với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo thành dạng sợi xoắn (fibrin dimer), các dạng sợi xoắn tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành fibrin polymer. Dưới tác dụng của thrombin, yếu tố XIII được hoạt hóa để tạo thành XIIIa, sự hoạt hóa này được tăng lên khi có mặt ion calci.
Với sự có mặt của yếu tố XIIIa, các liên kết đồng hóa trị 5 giữa các fibrin monomer đứng kề nhau được tạo thành và chuyển sang dạng fibrin polymer không hòa tan, tạo cục máu đông vững chắc. Sơ đồ mô phỏng cấu trúc fibrinogen của con người [8] 1. Đặc điểm của thrombin Thrombin là dạng hoạt động của prothrombin, yếu tố đông máu thứ 2 trong 13 yếu tố đông máu của huyết tương. Prothrombin có bản chất là một protein hòa tan trong huyết tương, do gan sản xuất.
Với sự có mặt của ion calci, prothrombinase sẽ chuyển prothrombin thành thrombin. Sự tạo thành prothrombinase diễn ra ở trong ống nghiệm như sau: yếu tố XII được hoạt hoá khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ tích điện âm. Yếu tố XIIa xúc tác cho sự hoạt hoá của yếu tố XI. Với sự có mặt của ion calci, yếu tố XIa sẽ hoạt hoá yếu tố IX.
Yếu tố IXa tương tác với yếu tố VIIIa trên bề mặt các hạt mixen phospholipid của tiểu cầu, với sự có mặt của ion calci tạo ra một phức hợp enzym để hoạt hoá yếu tố X. Yếu tố Xa, với sự có mặt của ion calci, tương tác với yếu tố V trên bề mặt các hạt mixen phospholipid tiểu cầu tạo ra phức hợp prothrombinase. Vai trò của thrombin là phân giải fibrinogen, giải phóng fibrinopeptide A. Việc mất peptide nhỏ này không đủ để làm cho phân tử fibrin không hòa tan, nhưng nó có xu hướng tạo liên kết giữa các phân tử fibrin liền kề nhau.
Thrombin sau đó phân cắt fibrinopeptide B thứ hai, từ fibrin và các monome fibrin được hình thành sau đó trùng hợp một cách tự nhiên để tạo thành một loại gel không hòa tan. Fibrin trùng hợp được giữ với nhau bởi các lực không tĩnh điện và tĩnh điện và được ổn định bởi yếu tố enzyme chuyển hóa XIIIa, được tạo ra bởi tác động của thrombin trên yếu tố XIII. Các cấu trúc fibrin không hòa tan (cục máu đông) và tiểu cầu có vai trò lấp vào vị trí mạch máu bị tổn thương để ngăn chảy máu [8]. Vai trò của thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin [8] Bình thường quá trình đông cầm máu trải qua 4 giai đoạn (co mạch tại chỗ, tạo nút tiểu cầu, tạo cục máu đông, co và tan cục máu đông).
Quá trình tạo keo fibrin dựa trên quá trình tạo cục máu đông máu, qui trình "bắt chước" để tách thành phần là thrombin và fibrinogen trong huyết tương sau đó trộn hai thành phần để hình thành nên mạng lưới fibrin (cục đông không có các tế bào máu). Sơ đồ chuyển hóa prothrombin thành thrombin và sự trùng hợp fibrinogen tạo thành các sợi fibrin 7 1. Phƣơng pháp tách chiết các thành phần keo fibrin 1. Phƣơng pháp tách chiết fibrinogen tự thân Khác với keo fibrin thương mại, keo fibrin tự thân là keo được tạo ra từ máu của 1 đối tượng và được dùng cho chính đối tượng đó.
Cả 2 thành phần fibrinogen và thrombin đều được chiết xuất từ huyết tương. Nồng độ fibrinogen và thrombin trong keo fibrin tự thân thường thấp hơn so với keo thương mại do vậy độ dính kém hơn và thời gian dính cũng lâu hơn. Dƣới đây là các phƣơng pháp tách chiết fibrinogen t huyết tƣơng ngƣời Kết tủa lạnh: Là một phương pháp khá phổ biến, được coi là tiêu chuẩn vàng cho việc tách chiết fibrinogen từ máu người. Huyết tương được đông lạnh ở nhiệt độ bằng hoặc dưới -180C trong ít nhất 12 giờ, sau đó máu được rã đông trong vài giờ ở nhiệt độ 40C, rồi đem ly tâm lấy tủa fibrinogen.
Nồng độ fibrinogen thu được từ kỹ thuật này không cao, có ưu điểm là không cần các chất hóa học. Phương pháp siêu lọc huyết tương giàu tiểu cầu cũng được sử dụng để tách chiết fibrinogen, nồng độ fibrinogen có được từ phương pháp này thấp. + Ly tâm: Dựa trên sự khác nhau về t trọng các thành phần trong máu để tách chiết fibrinogen, phương pháp này cũng cho nồng độ fibrinogen không cao. Phương pháp hóa học có sử dụng một số hóa chất như: Ethanol, polyethylen glycol (PEG) có ưu điểm hơn so với phương pháp kết tủa lạnh vì tổng thời gian tiến hành kỹ thuật ngắn hơn (khoảng 90 phút), cho nồng độ fỉbrinogen cao hơn, tuy nhiên do ảnh hưởng của các chất hóa học sẽ làm giảm đặc tính của keo dán, ví dụ như khi có mặt của ethanol sẽ làm giảm hoạt tính của yếu tố XIII.
Tách chiết fibrinogen có sử dụng protamin: Protamin có vai trò trung hòa tác dụng chống đông của heparin do có tác dụng ức chế hoặc tiêu thrombin, khi đó fibrinogen không chuyển dạng fibrin được, tạo điều kiện cho việc tách chiết fibrinogen.