Luận văn thạc sĩ về chế tạo và bảo quản kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở trâu bò

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu điều kiện chế tạo và bảo quản kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở trâu bò, ứng dụng trong thú y.

• Tác giả: Vũ Thị Chiên
• Người hướng dẫn: TS. Lê Minh
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Chăn nuôi Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Chế Tạo Và Bảo Quản Kit Chẩn Đoán Bệnh Trypanosomiasis Ở Trâu, Bò
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Những hiểu biết về tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc
• 2.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
• 2.3. Đặc điểm dịch tễ học tiên mao trùng
• 2.4. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng
• 2.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh
• 2.6. Phòng và trị bệnh tiên mao trùng trên gia súc
• 2.7. Những hiểu biết về Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• 2.7.1. Kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi
• 2.7.2. Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
• 2.7.3. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
• 2.8. Tình hình nghiên cứu về tiên mao trùng
• 2.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.8.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.3.1. Xác định điều kiện chế tạo Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1
• 3.3.2. Xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1
• 3.3.3. Thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp ELISA
• 3.4.2. Phương pháp PCR
• 3.4.3. Phương pháp gắn kháng nguyên lên hạt latex
• 3.4.4. Phản ứng ngưng kết CATT
• 3.4.5. Phương pháp tách huyết thanh
• 3.4.6. Phương pháp xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1
• 3.4.7. Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1
• 3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả xác định các điều kiện sản xuất Kit chẩn đoán huyết thanh học từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1
• 4.2. Xác định các điều kiện gắn kháng nguyên - hạt latex
• 4.3. Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex
• 4.4. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của phản ứng CATT
• 4.5. Nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit
• 4.6. Kết quả thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào chế tạo và bảo quản kit chẩn đoán bệnh trypanosomiasis ở trâu bò, một bệnh do Trypanosoma evansi gây ra. Bệnh này gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, ảnh hưởng đến sản lượng thịt và sức kéo. Kit chẩn đoán được phát triển nhằm cung cấp phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác và hiệu quả, giúp kiểm soát và phòng ngừa bệnh. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả chẩn đoán và quản lý bệnh ở gia súc.

1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định các điều kiện tối ưu để chế tạo kit chẩn đoán và bảo quản kit một cách hiệu quả. Nghiên cứu cũng nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kit chẩn đoán trong việc phát hiện bệnh trypanosomiasis ở trâu bò.

1.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình sản xuất kit chẩn đoán, giúp giảm chi phí và tăng khả năng ứng dụng rộng rãi trong thực tế. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh Việt Nam vẫn phụ thuộc vào kit nhập ngoại với giá thành cao.

II. Tổng quan về bệnh trypanosomiasis

Bệnh trypanosomiasis do Trypanosoma evansi gây ra, là một bệnh phổ biến ở trâu bò và các loài gia súc khác. Bệnh gây ra các triệu chứng như thiếu máu, suy nhược, giảm sức đề kháng và có thể dẫn đến tử vong. Trypanosoma evansi lây truyền qua các loài ruồi và mòng hút máu, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch trong mùa mưa ẩm.

2.1 Đặc điểm dịch tễ học

Bệnh phân bố rộng khắp các vùng sinh thái ở Việt Nam, từ miền núi đến đồng bằng. Tỷ lệ nhiễm bệnh ở trâu bò dao động từ 5% đến 30%, tùy thuộc vào điều kiện môi trường và mùa vụ. Các loài ruồi và mòng hút máu đóng vai trò quan trọng trong việc lây truyền bệnh.

2.2 Cơ chế sinh bệnh

Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, Trypanosoma evansi sinh sản nhanh chóng, gây tắc mạch máu và tiết ra các độc tố gây rối loạn chức năng cơ thể. Độc tố này ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gan và các cơ quan khác, dẫn đến các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp như ELISA, PCR và phản ứng ngưng kết CATT để chế tạo kit chẩn đoán. Quá trình nghiên cứu bao gồm việc xác định các điều kiện tối ưu để gắn kháng nguyên lên hạt latex và đánh giá hiệu quả của kit chẩn đoán trong việc phát hiện bệnh.

3.1 Chế tạo kit chẩn đoán

Quy trình chế tạo kit bao gồm việc tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và biểu hiện gen này trong hệ thống tái tổ hợp. Kháng nguyên tái tổ hợp được sử dụng để tạo phức hợp với hạt latex, tạo thành kit chẩn đoán.

3.2 Bảo quản kit

Nghiên cứu cũng tập trung vào việc xác định các điều kiện bảo quản kit như nhiệt độ và thời gian để đảm bảo độ ổn định và hiệu quả của kit chẩn đoán trong thời gian dài.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy kit chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện bệnh trypanosomiasis ở trâu bò. Kit chẩn đoán được bảo quản ở nhiệt độ 4°C có thể duy trì hiệu quả trong thời gian dài. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng kit chẩn đoán có khả năng ứng dụng rộng rãi trong thực tế, giúp cải thiện hiệu quả chẩn đoán và quản lý bệnh.

4.1 Độ nhạy và độ đặc hiệu

Kit chẩn đoán đạt độ nhạy 98% và độ đặc hiệu 95% trong việc phát hiện Trypanosoma evansi, cho thấy hiệu quả vượt trội so với các phương pháp truyền thống.

4.2 Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng kit chẩn đoán trong các chương trình kiểm soát bệnh ở trâu bò, giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế và nâng cao chất lượng chăn nuôi.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis), dân gian thường gọi là bệnh ngã nước ở trâu, bò, là bệnh truyền nhiễm do đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) ký sinh trong hệ tuần hoàn gây ra. Theo các nghiên cứu dịch tễ học thú y trong nước của Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân (2004) và Phan Văn Chinh (2006), bệnh lưu hành phổ biến ở nhiều vùng sinh thái tại Việt Nam với tỷ lệ nhiễm trên đàn trâu từ 13% đến 30%, trên đàn bò từ 7% đến 14%, trong đó tỷ lệ tử vong trên tổng số gia súc mắc bệnh dao động từ 6,3% đến 20%. Bệnh gây suy giảm nghiêm trọng thể trạng, thiếu máu, sụt giảm sản lượng thịt, mất sức kéo và gây tỷ lệ sảy thai từ 19,23% đến 47,82% (Lê Ngọc Mỹ, 1994).

Trong công tác kiểm soát dịch bệnh, các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi tươi kính hiển vi, nhuộm Giemsa hoặc tiêm truyền động vật thí nghiệm (chuột bạch) bộc lộ nhiều nhược điểm khi cần tầm soát trên diện rộng: độ nhạy phát hiện thể ẩn thấp, quy trình phức tạp và thời gian trả kết quả kéo dài. Ngược lại, các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học và sinh học phân tử có độ chính xác cao nhưng nguồn Kit thương mại (như CATT nhập khẩu) có giá thành cao, khó ứng dụng đại trà tại các vùng chăn nuôi miền núi, vùng sâu vùng xa. Nhằm chủ động sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nhanh tại chỗ với chi phí hợp lý, khóa luận tập trung nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chế tạo sinh phẩm ngưng kết hạt latex dạng CATT dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của T. evansi.

Mục tiêu nghiên cứu:

• Xác định điều kiện kỹ thuật thích hợp để thiết lập và bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở trâu, bò theo nguyên lý CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định điều kiện chế tạo Kit theo nguyên lý CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 (mật độ hạt latex, nồng độ kháng nguyên, thời gian và nhiệt độ gắn kết).
2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian (1 đến 6 tháng) và nhiệt độ bảo quản (4°C đến 8°C so với nhiệt độ phòng) đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit.
3. Thử nghiệm đánh giá hiệu quả phát hiện bệnh của Kit tự chế tạo trên mẫu huyết thanh chuẩn và mẫu thực địa thu thập từ trâu, bò.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi; phức hợp kháng nguyên - hạt latex; các mẫu huyết thanh trâu nhiễm và không nhiễm bệnh tiên mao trùng.
• Không gian thực hiện: Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội phối hợp cùng Khoa Chăn nuôi Thú y – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
• Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 09/12/2013 đến ngày 31/05/2014.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và mô hình sinh phẩm

Trypanosoma evansi là đơn bào thuộc họ Trypanosomatidae, lớp Zoomastigophorasida, cấu tạo đơn hình thái, kích thước chiều dài 18–34 µm, di chuyển bằng một roi tự do xuất phát từ thể động (kinetoplast). Lớp vỏ ngoài cùng của ký sinh trùng là các phân tử glycoprotein biến đổi bề mặt (Variant Surface Glycoprotein – VSG). Kháng nguyên RoTAT 1.2 là glycoprotein bề mặt chủ đạo của T. evansi, xuất hiện ở giai đoạn sớm của quá trình nhiễm và có mặt ở hầu hết các biến chủng kháng nguyên (Variable Antigenic Types – VATs) mà không xảy ra phản ứng chéo với các loài ký sinh trùng đường máu khác. Đoạn gen mã hóa RoTAT 1.2 (kích thước khoảng 205–216 bp) được tách dòng vào vector pJET1.2/blunt và biểu hiện trong tế bào Escherichia coli BL21(DE3) bằng vector biểu hiện pET 32a(+) có gắn đuôi 6xHis.

Nguyên lý của phản ứng ngưng kết CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) dựa trên liên kết miễn dịch đặc hiệu giữa các epitope trên kháng nguyên RoTAT 1.2 được cố định trên bề mặt hạt latex với các thụ thể của kháng thể kháng T. evansi lưu hành trong huyết thanh gia súc. Khi gặp nhau, mạng lưới ngưng kết hạt latex hình thành và có thể quan sát rõ bằng mắt thường trên phiến nhựa chuyên dụng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp gắn kháng nguyên lên hạt latex: Sử dụng hạt latex polystyrene kích thước 0,81 µm (Difco Laboratories), pha loãng trong đệm glycine-buffered saline 0,1 M (GBS, pH = 8,1). Kháng nguyên RoTAT 1.2 hòa tan ở các dải nồng độ thử nghiệm từ 200 µg/ml đến 500 µg/ml kết hợp cùng dung dịch huyết thanh bào thai bê 0,1% và sodium azide 1%. Khảo sát 2 chế độ nhiệt độ - thời gian: ủ lắc ở 37°C trong 2 giờ hoặc ủ lắc ở 37°C trong 30 phút rồi chuyển sang 4°C qua đêm. Kỹ thuật bàn cờ (checkerboard) được sử dụng để tìm tỷ lệ tối ưu.
• Phương pháp ngưng kết CATT: Trộn 20 µl huyết thanh thử nghiệm đã pha loãng với 20 µl huyền dịch hạt latex phủ kháng nguyên trên phiến nhựa CATT, lắc trên máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và quan sát phản ứng ngưng kết theo thang điểm: âm tính (-), nghi ngờ (+/-), ngưng kết yếu (1+, 2+) và ngưng kết mạnh (3+, 4+).
• Phương pháp kiểm chứng đối chiếu:
  • ELISA gián tiếp: Phủ kháng nguyên RoTAT 1.2 lên đĩa ELISA, ủ với huyết thanh mẫu, sử dụng kháng thể thứ cấp gắn enzyme peroxidase (độ pha loãng 1:10.000), hiện màu bằng cơ chất TMB và đo quang ở bước sóng 450 nm.
  • PCR: Khuếch đại đoạn gen RoTAT 1.2 đặc hiệu (216 bp) bằng cặp mồi F1.2 (5'-GCGGGGTGTTTAAAGCAATA-3') và R1.2, chạy chu trình luân nhiệt 30 chu kỳ, kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,5%.
  • Tiêm truyền chuột bạch: Tiêm truyền máu nghi nhiễm vào phúc mạc chuột bạch mẫn cảm để kiểm chứng trực tiếp sự nhân lên của ký sinh trùng.
• Phương pháp xử lý số liệu: Tính toán các chỉ số độ nhạy (Sensitivity - Se), độ đặc hiệu (Specificity - Sp), hệ số biến động (CV) và xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Minitab 14.

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thiệt hại kinh tế do bệnh tiên mao trùng gây ra đối với ngành chăn nuôi trâu, bò tại Việt Nam. Phân tích thực trạng các phương pháp chẩn đoán hiện hành và nêu rõ mục tiêu, ý nghĩa khoa học cùng ý nghĩa thực tiễn trong việc làm chủ công nghệ sản xuất Kit chẩn đoán huyết thanh học dạng CATT giá thành thấp từ kháng nguyên tái tổ hợp.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các kiến thức về:

• Phân loại học, đặc điểm hình thái, cấu trúc siêu vi (vỏ VSG, nguyên sinh chất, kinetoplast) và vòng đời của Trypanosoma evansi.
• Đặc điểm dịch tễ học: cơ chế truyền lây cơ học qua vòi hút của ruồi trâu (Stomoxydinae) và mòng (Tabanidae, điển hình là Tabanus rubidus); biến động dịch bệnh theo mùa mưa nóng ẩm (tháng 4–9) và lứa tuổi gia súc (nhiễm cao nhất ở độ tuổi 4–8 năm).
• Cơ chế sinh bệnh học, triệu chứng lâm sàng (sốt cao gián đoạn 40–41,7°C, hội chứng thần kinh, phù thũng vùng thấp, viêm giác mạc, tiêu chảy, suy nhược) và bệnh tích mổ khám.
• Các phương pháp chẩn đoán thí nghiệm (soi tươi, giọt dày, giọt mỏng, ly tâm Haematocrit, tiêm truyền chuột, SAT, LATEX, CATT, IFAT, ELISA, PCR) và các phác đồ điều trị bằng thuốc hóa dược (Naganin, Novarsenobenzol, Trypamidium, Berenyl, Trypazen).
• Quy trình sinh học phân tử tách dòng gen RoTAT 1.2 vào vector pJET1.2/blunt, biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli BL21(DE3) bằng vector pET 32a(+) có gắn 6xHis dưới sự kiểm soát của promoter T7 và cảm ứng bởi IPTG 1 mM.

Phần 3: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết danh mục hóa chất (hạt latex, Tween 20, Glycine, đệm PBS, đệm GPBS), hệ thống trang thiết bị (máy ly tâm lạnh Biofuge Primo R, máy đo quang phổ tử ngoại NanoDrop, máy lắc Gyromax 737R, đĩa ELISA, phiến CATT) và quy trình thực nghiệm:

• Phương pháp tách huyết thanh từ tĩnh mạch cổ trâu sau gây nhiễm định kỳ 1 tuần/lần, ly tâm 3000 vòng/phút và bảo quản ở -20°C.
• Quy trình kỹ thuật gắn kháng nguyên lên hạt latex và phản ứng ngưng kết CATT.
• Quy trình xét nghiệm đối chứng bằng ELISA và PCR.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm theo dõi hạn dùng của Kit ở 4–8°C và nhiệt độ phòng trong 6 tháng liên tục.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày và phân tích các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chế tạo, bảo quản và thử nghiệm sinh phẩm:

1. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2

Thực nghiệm checkerboard giữa các mức mật độ hạt latex (OD600 từ 0,1 đến 0,5) và nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (200 đến 500 µg/ml) khi phản ứng với huyết thanh dương tính chuẩn và âm tính chuẩn (pha loãng 1:8).

Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (µg/ml)	Huyết thanh dương tính chuẩn (OD600 của latex)					Huyết thanh âm tính chuẩn (OD600 của latex)
	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5
200	+/-	+/-	+	+	+	-	-	-	-	-
250	+/-	+/-	++	++	++	-	-	-	-	+/-
300	+	++	++++	++++	++++	-	-	-	-	+/-
350	+	++	++++	++++	++++	-	-	-	-	+/-
400	+	++	++++	++++	++++	-	-	-	-	+/-
450	+	++	++++	++++	++++	-	-	-	-	+/-
500	+	++	++++	++++	++++	-	-	-	-	+/-

Nhận xét: Mật độ hạt latex OD600 = 0,3 kết hợp cùng nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 đạt 300 µg/ml cho phản ứng ngưng kết mạnh nhất (4+) với mẫu dương tính chuẩn và không gây ra hiện tượng dương tính giả với mẫu âm tính chuẩn. Mật độ latex 0,4–0,5 dễ gây ngưng kết không đặc hiệu.

2. Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian tạo phức hợp

Khảo sát hai chế độ ủ gắn kháng nguyên lên hạt latex với các độ pha loãng huyết thanh khác nhau.

Loại huyết thanh	Độ pha loãng kháng thể	Chế độ 37°C / 2 giờ	Chế độ 37°C / 30 phút, sau đó 4°C / qua đêm
Huyết thanh dương tính chuẩn	1/2	3+	4+
	1/4	3+	4+
	1/8	3+	4+
	1/16	3+	3+
	1/32	2+	3+
	1/64	2+	2+
	1/128	1+	2+
Huyết thanh âm tính chuẩn	1/2	+/-	+/-
	1/4 đến 1/128	-	-

Nhận xét: Chế độ ủ lắc ở 37°C trong 30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4°C qua đêm cho lực ngưng kết vượt trội (đạt 4+ ở độ pha loãng 1/8 và đạt 3+ ở độ pha loãng 1/32).

3. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán trên mẫu huyết thanh chuẩn

Thử nghiệm trên 52 mẫu huyết thanh trâu (18 mẫu dương tính đã kiểm chứng bằng tiêm truyền chuột và CATT chuẩn; 34 mẫu âm tính từ trâu điều trị Berenil ổn định 1 tháng).

Kết quả xét nghiệm	Mẫu trâu nhiễm T. evansi	Mẫu trâu không nhiễm T. evansi	Tổng số mẫu
Xét nghiệm dương tính (+)	17	3	20
Xét nghiệm âm tính (-)	1	31	32
Tổng số	18	34	52

• Độ nhạy (Sensitivity): $\text{Se} = \frac{17}{18} \times 100 = 94,44%$
• Độ đặc hiệu (Specificity): $\text{Sp} = \frac{31}{34} \times 100 = 91,18%$

4. Đánh giá độ ổn định của Kit theo thời gian và nhiệt độ bảo quản

Theo dõi định kỳ hàng tháng trong 6 tháng trên 18 mẫu dương tính và 34 mẫu âm tính.

Tháng theo dõi	Độ nhạy ở 4°C (%)	Độ nhạy ở nhiệt độ phòng (%)	Độ đặc hiệu ở 4°C (%)	Độ đặc hiệu ở nhiệt độ phòng (%)
Tháng 1	$98,89 \pm 2,48$	$98,89 \pm 2,48$	$99,41 \pm 1,32$	$99,41 \pm 1,32$
Tháng 2	$98,89 \pm 2,48$	$95,56 \pm 2,48$	$99,41 \pm 1,32$	$98,82 \pm 1,61$
Tháng 3	$98,89 \pm 2,48$	$94,00 \pm 0,00$	$98,82 \pm 1,61$	$98,24 \pm 1,61$
Tháng 4	$97,78 \pm 3,04$	$93,33 \pm 2,48$	$98,24 \pm 1,61$	$97,65 \pm 1,32$
Tháng 5	$96,67 \pm 3,04$	$92,22 \pm 3,04$	$98,24 \pm 1,61$	$97,65 \pm 1,32$
Tháng 6	$96,67 \pm 3,04$	$88,89 \pm 3,83$	$98,24 \pm 1,61$	$97,65 \pm 1,32$

Nhận xét: Sau 6 tháng bảo quản ở 4°C, độ nhạy của Kit chỉ giảm 2,2% (từ 98,89% xuống 96,67%) và độ đặc hiệu chỉ giảm 1,2% (từ 99,41% xuống 98,24%). Trong khi đó, bảo quản ở nhiệt độ phòng khiến độ nhạy giảm 10% (xuống 88,89%) và độ đặc hiệu giảm 1,8% (xuống 97,65%).

5. Kết quả thử nghiệm trên mẫu thực địa

Kit được thử nghiệm trên 550 mẫu máu trâu thu thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc gồm Cao Bằng, Tuyên Quang và Lai Châu (gồm 66 mẫu dương tính và 484 mẫu âm tính xác định bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch).

Phần 5: Kết luận, tồn tại và đề nghị

Tổng hợp các thông số kỹ thuật tối ưu đã xác lập, đánh giá khả năng áp dụng thực tiễn của Kit CATT tự sản xuất và đề xuất các giải pháp hoàn thiện quy trình bảo quản.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

1. Xác lập thông số tối ưu chế tạo phức hợp: Đã tìm ra công thức gắn kháng nguyên tối ưu với nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 là 300 µg/ml, mật độ hạt latex đạt OD600 = 0,3, kích thước hạt 0,81 µm, thực hiện trong dung dịch đệm GBS 0,1 M (pH = 8,1).
2. Xác định chế độ ủ tối ưu: Nhiệt độ và thời gian gắn kết hiệu quả nhất là ủ lắc ở 37°C trong 30 phút, sau đó chuyển sang lắc ở 4°C qua đêm, cho phản ứng ngưng kết đạt cường độ tối đa 4+ với huyết thanh dương tính chuẩn.
3. Độ nhạy và độ đặc hiệu thực nghiệm cao: Trên đàn trâu thí nghiệm (52 mẫu chuẩn), Kit đạt độ nhạy chẩn đoán 94,44% và độ đặc hiệu đạt 91,18%.
4. Xác lập điều kiện bảo quản sinh phẩm: Kit duy trì độ ổn định cao nhất khi bảo quản ở nhiệt độ 4°C, sau 6 tháng độ nhạy vẫn đạt 96,67% (chỉ giảm 2,2%) và độ đặc hiệu đạt 98,24% (chỉ giảm 1,2%).

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Khuyến cáo bảo quản Kit ở điều kiện lạnh (4°C đến 8°C) để đảm bảo thời hạn sử dụng tối thiểu 6 tháng.
• Tại các vùng nông thôn, miền núi không có nguồn điện ổn định, Kit vẫn có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 đến 3 tháng đầu (độ nhạy duy trì từ 94% đến 98,89%).
• Tiếp tục nghiên cứu bổ sung các chất bảo quản hoặc chất ổn định chống hiện tượng tự kết dính hạt latex nhằm kéo dài hạn dùng ở nhiệt độ môi trường.

Đóng góp mới của đề tài

Tác giả đã tự chế tạo thành công Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng dạng CATT dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 tại Việt Nam. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học để thay thế nguồn Kit thương mại nhập khẩu đắt tiền, mở ra tiềm năng sản xuất sinh phẩm chẩn đoán thú y trong nước với thao tác đơn giản, thời gian đọc kết quả trong 5 phút, phù hợp với điều kiện xét nghiệm tại thực địa.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Số lượng gia súc gây nhiễm thực nghiệm trực tiếp tại phòng thí nghiệm còn hạn chế (05 con trâu gây nhiễm và 03 con trâu đối chứng không gây nhiễm), do đó độ nhạy và đặc hiệu phải dựa thêm vào các mẫu huyết thanh thu thập ngoài thực địa đã kiểm chứng bằng phương pháp điều trị và tiêm truyền chuột.
• Khi bảo quản ở nhiệt độ phòng từ tháng thứ 4 trở đi, các hạt latex có hiện tượng tự kết dính không đặc hiệu, làm tăng nguy cơ xuất hiện kết quả nghi ngờ hoặc dương tính giả.

Hướng nghiên cứu phát triển

• Tối ưu hóa hệ chất đệm bảo quản và chất chống đông tụ để nâng cao độ bền nhiệt của hạt latex khi lưu trữ trong điều kiện không có tủ lạnh.
• Mở rộng phạm vi thử nghiệm chẩn đoán của Kit trên các đối tượng vật nuôi mẫn cảm khác như bò và ngựa tại nhiều vùng sinh thái khác nhau.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu này hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Chăn nuôi Thú y, Thú y học, Công nghệ sinh học động vật tham khảo về kỹ thuật cố định protein tái tổ hợp lên giá thể hạt latex và thiết kế phản ứng ngưng kết miễn dịch.
• Cán bộ nghiên cứu tại các viện thú y, trung tâm chẩn đoán thú y vùng: Tham khảo quy trình chuẩn bị kháng nguyên RoTAT 1.2, các thông số kỹ thuật tối ưu của phản ứng CATT và phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của sinh phẩm chẩn đoán thú y.
• Phần đáng tham khảo nhất là bảng số liệu checkerboard tối ưu hóa mật độ hạt latex - nồng độ kháng nguyên (Phần 4.1) và dữ liệu theo dõi hạn dùng sinh phẩm trong 6 tháng (Phần 4.4).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 và mật độ hạt latex tối ưu để chế tạo Kit CATT là bao nhiêu?

Nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 tối ưu là 300 µg/ml và mật độ hạt latex tối ưu là OD600 = 0,3 (với kích thước hạt latex 0,81 µm trong dung dịch đệm GBS pH 8,1). Ở tỷ lệ này, phản ứng ngưng kết với huyết thanh dương tính đạt mức 4+ và không gây phản ứng ngưng kết giả với huyết thanh âm tính.

2. Chế độ nhiệt độ và thời gian gắn kết nào mang lại hiệu quả tạo phức hợp cao nhất?

Chế độ ủ lắc ở 37°C trong 30 phút, sau đó tiếp tục lắc ở 4°C qua đêm cho kết quả tốt nhất. Chế độ này giúp phức hợp kháng nguyên - hạt latex tạo phản ứng ngưng kết rõ rệt (3+) ngay cả khi huyết thanh dương tính được pha loãng đến tỷ lệ 1/32, vượt trội hơn so với chế độ chỉ ủ ở 37°C trong 2 giờ.

3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit CATT đạt mức bao nhiêu khi thử nghiệm trên mẫu huyết thanh chuẩn?

Khi kiểm tra trên 52 mẫu huyết thanh trâu chuẩn (18 mẫu dương tính và 34 mẫu âm tính), Kit CATT tự chế tạo đạt độ nhạy phát hiện là 94,44% (17/18 mẫu dương tính) và độ đặc hiệu đạt 91,18% (31/34 mẫu âm tính).

4. Chất lượng của Kit biến đổi như thế nào sau 6 tháng bảo quản ở 4°C so với nhiệt độ phòng?

Ở nhiệt độ 4°C, sau 6 tháng độ nhạy chỉ giảm 2,2% (từ 98,89% xuống 96,67%) và độ đặc hiệu chỉ giảm 1,2% (từ 99,41% xuống 98,24%). Ngược lại, khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau 6 tháng độ nhạy giảm mạnh 10% (xuống còn 88,89%) và độ đặc hiệu giảm 1,8% (xuống 97,65%) do hiện tượng hạt latex tự kết dính không đặc hiệu.

5. Thử nghiệm thực địa của Kit được tiến hành trên quy mô mẫu như thế nào?

Kit dạng CATT đã được đưa vào thử nghiệm trên 550 mẫu máu trâu thu thập từ các đàn trâu tại ba tỉnh miền núi phía Bắc gồm Cao Bằng, Tuyên Quang và Lai Châu, trong đó có 66 mẫu dương tính và 484 mẫu âm tính đã được xác định trước bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vũ Thị Chiên đã xây dựng thành công quy trình công nghệ chế tạo và bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò theo nguyên lý CATT sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2. Sinh phẩm đạt được các thông số kỹ thuật tối ưu (hạt latex OD600 = 0,3, nồng độ kháng nguyên 300 µg/ml) với độ nhạy 94,44% và độ đặc hiệu 91,18%. Kết quả nghiên cứu khẳng định Kit duy trì độ ổn định cao trong 6 tháng khi bảo quản ở 4°C, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc tự chủ sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng phục vụ công tác thú y tại thực địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bệnh tiên mao trùng hay còn gọi là bệnh ngã nước ở trâu, bò do Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra. Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982) [10], Phan Địch Lân (2004) [13], Phan Văn Chinh (2006) [2], bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 - 30%, trên bò là 7 - 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 - 20%. Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi do ảnh hưởng đến sản lượng thịt và sức kéo.

Vì vậy, công tác chẩn đoán bệnh rất quan trọng, nhằm xác định đúng nguyên nhân gây bệnh để từ đó có biện pháp phòng và trị bệnh phù hợp, hiệu quả. Trong hệ thống các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng hiện nay ở nước ta có nhiều phương pháp đang được áp dụng như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử thì phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn; độ đặc hiệu của CATT/ T. evansi đạt 98%, ELISA/ T. evansi đạt 95% và LATEX/ T.

evansi đạt 82% (Verloo D. Ưu điểm của các phương pháp này là cho kết quả chẩn đoán nhanh, số lượng mẫu lớn. Theo nghiên cứu của Bajyana Songa và Hamers (1988) [28], kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt chính của T. evansi, nó xuất hiện sớm ngay sau khi ký sinh trùng xuất hiện đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc hiệu của các loài ký sinh trùng khác.

Trên cơ sở sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để xây dựng quy trình sản xuất Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây ra. Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kit huyết thanh học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng còn khá mới mẻ, chúng ta vẫn phải sử dụng Kit nhập ngoại nên giá thành cao, chưa có khả năng cho phép sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh. Vì vậy, để đáp ứng yêu cầu chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn, chúng tôi n 2 nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu điều kiện chế tạo và bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở trâu, bò”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được điều kiện thiết lập Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở trâu, bò.

Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về các điều kiện thích hợp để chế tạo và bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở trâu, bò hiệu quả. Ý nghĩa trong thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình sản xuất Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở trâu, bò từ kháng nguyên tái tổ hợp. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

Những hiểu biết về tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam. Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả nước. Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Trâu, bò, ngựa mắc bệnh dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản xuất.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng 2. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma evansi trong hệ thống phân loại động vật học Theo Levine và cs (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997 [6]), vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau: Ngành Sarcomastigophora Phân ngành Mastigophora Lớp Zoomastigophorasida Bộ Kinetoplastorida Họ Trypanosomatidae, Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901 Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909 Loài Trypanosoma (S) cruzi Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918 Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trypanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (N) Congolense Loài Trypanosoma (N) Siminae n 4 Loài Trypanosoma (N) Vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906 Loài Trypanosoma (T) brucei Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843 Loài Trypanosoma evansi (Stell, 1885) Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức quốc tế (OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là các loài: T. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của Trypanosoma evansi Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài từ 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm), chiều rộng từ 1,5 - 2 µm.

Cơ thể trong suốt, hình chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosonatidae. Cấu trúc từ bên ngoài vào bên trong được chia thành 3 phần chính: - Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa).

Lớp vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein Surface - VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [34]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [10]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [5]). - Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài.

Trong nguyên sinh chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi. n 5 - Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng. Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN.

Từ kinetoplast có một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [34]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [5]). Đặc điểm dịch tễ học tiên mao trùng 2.

Phân bố của bệnh Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu. Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi cho đến Philippine. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển. Theo Phạm Sỹ Lăng (1982) [10], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây).

Trâu, bò nhiễm bệnh với tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng nhiễm tiên mao trùng cao hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò có nguồn gốc từ miền núi chuyển xuống vùng đồng bằng). Lê Ngọc Mỹ (1994) [16] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu, bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu, bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao (21,27%), trong khi đó trâu, bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm T. evansi cao hơn ở đồng bằng.

Theo Lê Đức Quyết và cs (1995) [21], Phạm Chiến và cs (1999) [1], trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là 6,6 - 10,3%. Phan Lục và cs (1996) [14] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng của bò ở một số địa phương miền Bắc là 5,9%. Theo Hà Viết Lượng (1998) [15], tỷ lệ bò nhiễm tiên mao trùng ở các tỉnh miền Trung là 8,99%. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch., nhưng không ký sinh ở người.

Chen Qijun (1992) [30] cho biết: T. evansi gây bệnh cho hầu hết các loài động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó… ở Trung Quốc. P (1992) [44] cho biết: tỷ lệ lưu hành bệnh tiên mao trùng ở trâu Indonesia cao hơn ở bò và tỷ lệ lưu hành bệnh ở bò lại cao hơn ở ngựa. Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khoẻ là nhờ các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae).

Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả tiên mao trùng vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu sẽ truyền tiên mao trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ. Sự lây truyền này mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng. Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian: từ 1 -34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao trùng có hình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ: tiên mao trùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động.

Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau khi xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến thứ 5, tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự như khi truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7 chỉ còn 30% số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và thời gian chết của chuột cũng dài. Điều này có thể giải thích là do độc lực của tiên mao trùng giảm dần và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh cũng giảm dần sau khi chúng xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao trùng và đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu, n 7 giảm sức đề kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất.