CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 1.1 Hình thể Staphylococcus aureus thuộc họ Staphylococcaceae.aureus có dạng hình cầu, bắt màu Gram dương, đường kính (0,8 – 1) x (0,5 – 1,5) µm, không sắp xếp theo thứ tự nhất định, thường đứng tụ lại thành đám, đôi khi đứng từng đôi hay phân tán rải rác từng tế bào riêng lẻ. Tụ cầu khuẩn không có lông, không sinh nha bào [2].2 Điều kiện nuôi cấy S.aureus là loại vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thông thường ở nhiệt độ 37°C và có giới hạn nhiệt độ là từ 10 – 45°C, pH 7,2 – 7,4. Trên môi trường thạch nuôi cấy như thạch máu blood agar (BA), thạch máu nâu chocolate agar (CA) tụ cầu thường tạo khuẩn lạc thể S (smooth), đường kính 1 – 4 mm. Màu sắc khuẩn lạc tùy thuộc vào sự tạo sắc tố, ở nhiệt độ phòng, có ánh sáng, tụ cầu sinh ra sắc tố vàng, vàng chanh, trắng nên còn được gọi là tụ cầu vàng.
Ở môi trường nuôi cấy lỏng, cầu khuẩn mọc làm đục đều và có cặn ở đáy. Trong trường hợp có đầy đủ không khí, cầu khuẩn mọc và tạo thành lớp váng trên bề mặt. Ở môi trường BA, tụ cầu gây tan máu dạng beta (Hình 1. Hình dạng khuẩn lạc S.aureus trên môi trường BA 4 1.3 Đặc tính sinh hóa S.aureus tiết ra các enzyme như protease, urease, catalase, phosphatase.
Catalase enzyme được dùng trong phản ứng phân biệt tụ cầu staphylococci và liên cầu streptococci. Trong phản ứng phân biệt tụ cầu và liên cầu, đánh tan khuẩn lạc vào dung dịch H2O2 trên phiến kính, quan sát phản ứng oxy hóa khuẩn lạc. Khuẩn lạc staphylococci cho phản ứng sủi bọt khí khi gặp H2O2 do tụ cầu có sinh men catalase, ngược lại streptococci không gây sủi bọt do không có men catalase.aureus tổng hợp hơn 25 protein, độc tố và enzyme có tính chất gây bệnh như: (i) alpha, beta, gamma hemolysin có đặc tính gây tan máu, gây chết và hoại tử da; (ii) leucocidin tiêu hủy bạch cầu, tiểu cầu và các tế bào thần kinh; (iii) coagulase gây đông huyết tương và là một tiêu chuẩn quan trọng để nhận biết loài tụ cầu gây bệnh như S. Trong xét nghiệm lâm sàng, huyết tương thỏ được sử dụng trong phản ứng phân biệt S.aureus với các staphylococci coagulase âm khác, S.aureus gây đông tụ huyết tương thỏ có thể quan sát bằng mắt thường hay dưới kính hiển vi; (iv) fibrinolysin gây tiêu sợi huyết; (v) hyaluronidase phá hủy hyaluronic acid là thành phần các tổ chức liên kết; (vi) lecithinase phá hủy lecithin, chất có trong thành phần vỏ hồng cầu người, cừu và thỏ; (vii) anticoagulantum được tạo ra ở các dịch tiết của ổ viêm khi có tụ cầu gây bệnh xâm nhập, làm kìm hãm quá trình đông máu; (viii) β-lactamase phá hủy vòng β-lactam giúp vi khuẩn kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam; (ix) hemagglutinin gây kết dính hồng cầu; (x) độc tố gây hội chứng choáng nhiễm độc đe dọa tính mạng; (xi) độc tố ruột bền vững với các enzyme ở ruột; (xii) exfoliatin S toxin và epidermolytic toxin gây hội chứng bong vảy da [2].2 Biofilm của Staphylococcus aureus 1.1 Khái niệm chung về biofilm Biofilm là một cộng đồng vi sinh vật ba chiều phức tạp bám trên một bề mặt giá thể, được bao bọc trong một hợp chất ngoại bào do chính các vi sinh vật này tiết ra.
Biofilm là một phức hợp sinh học phức tạp bao gồm nhiều thành phần sinh học đa dạng với tỉ lệ phần trăm khác nhau (bảng 1. Các thành phần và tỷ lệ cấu tạo biofilm STT Thành phần Tỉ lệ phần trăm 1 Nước > 97% 2 Tế bào vi khuẩn 2 – 5% 3 Các polysaccharide 1 – 2% 4 Các protein < 1 – 2% (bao gồm cả enzyme) 5 DNA và RNA < 1 – 2% 6 Các loại ion Tự do và gắn kết [3] 1.1 Các giai đoạn hình thành biofilm Sự hình thành biofilm trải qua năm giai đoạn chính: (1) Giai đoạn đầu tiên, các tế bào vi sinh vật ở dạng tự do (planktonic) phát tán và bám dính lên bề mặt giá thể. Giá thể giúp các tế bào kết dính tạo biofilm và được bao bọc trong một lượng nhỏ vật chất exopolymeric. (2) Giai đoạn hai, các tế bào bám dính tiết ra các chất cao phân tử ngoại bào (extracellular polymeric substances – EPS) gắn chặt quần thể sinh vật vào bề mặt giá thể và không thể tách rời.
Kết quả là tế bào bám chặt lên bề mặt, hình thành một thể ma trận. (3) Giai đoạn ba, biofilm bắt đầu trưởng thành, tăng sinh thêm nhiều tế bào và phát triển các hệ thống kênh vận chuyển nước, đồng thời biofilm cũng phát triển nhiều lớp hơn. Các giai đoạn hình thành biofilm [78] Ghi chú: A: Giai đoạn một; B: Giai đoạn hai; C: Giai đoạn ba; D: Giai đoạn bốn; E: Giai đoạn năm 1.2 Đặc tính của biofilm a. Các chất cao phân tử ngoại bào (extracellular polymeric substances – EPS) Các chất cao phân tử bao bọc các tế bào sinh vật bên trong biofilm bao gồm hỗn hợp phức tạp của các lipid, protein, acid nucleic (DNA ngoại bào) [5].
Lớp màng cao phân tử này giúp bảo vệ các tế bào vi sinh vật ở lớp bề mặt biofilm, hấp thu các chất dinh dưỡng, hỗ trợ cấu trúc màng, tạo lá chắn chống lại hàng rào miễn dịch trong cơ thể vật chủ và các tác nhân kháng khuẩn khác [1]. Quorum sensing Quorum sensing là cách biofilm kiểm soát mật độ tế bào thông qua việc truyền tín hiệu từ tế bào này sang tế bào khác. Quorum sensing phụ thuộc vào các phân tử tín hiệu gọi là đầu dò tự động peptide autoinducing (AIP). Các đầu dò tự động được tạo ra liên tục bởi các tế bào vi sinh vật.
Vì thế khi mật độ tế bào tăng lên thì số lượng các đầu dò cũng tăng lên. Ở một mật độ tế bào cụ thể, các đầu dò tự động đạt đến ngưỡng quorum, ức chế hoặc kích hoạt một số gen mục tiêu giúp duy trì kích thước biofilm. Tóm lại, quorum sensing có chức năng kiểm soát mật độ tế bào trong quần thể, hỗ trợ truyền các đột biến có lợi khắp quần thể, tăng cường tiếp cận nguồn dinh dưỡng [1,5]. Khả năng chịu đựng kháng sinh (biofilm antibiotic tolerance – BAT) Tế bào vi khuẩn bên trong biofilm có khả năng chịu đựng kháng sinh tốt hơn tế bào dạng tự do.
Trong khi các cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn tự do đã được hiểu rõ, những cơ chế như đột biến, bơm đẩy kháng sinh và sản sinh enzyme ức chế kháng sinh lại không được tìm thấy ở biofilm. Những chủng vi khuẩn vốn dĩ nhạy cảm với kháng sinh thì thường sẽ biểu hiện kháng kháng sinh khi ở trong biofilm, tuy nhiên khi tế bào bị ly giải khỏi cộng đồng chính, tế bào vi khuẩn lại nhạy cảm với kháng sinh trở lại [6]. Vì thế BAT được cho là một cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn trong biofilm. BAT được chia làm 2 nhóm: bẩm sinh từ sự phát triển của biofilm và cảm ứng từ sau quá trình điều trị kháng sinh [1].
Khả năng dung nạp kháng sinh của biofilm bị hạn chế bởi các EPS. EPS ở một số loài có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của kháng sinh một cách bẩm sinh. Tuy nhiên, hiện tượng này chỉ có tác dụng với những kháng sinh cụ thể. Ví dụ, ciprofloxacin và ampicillin vẫn xâm nhập và khuếch tán hiệu quả qua biofilm của Klebsiella pneumoniae, đến được các tế bào nằm sâu nhất trong biofilm [7].
Giảm tốc độ tăng trưởng là một yếu tố quan trọng trong việc điều hòa dung nạp kháng sinh của biofilm. Cấu trúc phức tạp bên trong biofilm tạo ra các khu vực khác nhau, có nhiều khu vực bị thiếu oxy và chất dinh dưỡng. Đối với các loại kháng sinh tác động lên khả năng tăng trưởng của vi khuẩn, ở các khu vực vi khuẩn phát triển chậm hoặc ở dạng không hoạt động, tế bào không bị tác động bởi kháng sinh [8]. Persister là nhóm tế bào đại diện cho lượng nhỏ các tế bào vi khuẩn tồn tại ở trạng thái không hoạt động và thể hiện khả năng kháng kháng sinh cực mạnh.
Không giống như nhóm tế bào ở dạng tự do – planktonic, biofilm bảo vệ persister khỏi sự đào thải của hệ miễn dịch. Mặc dù persister chiếm số lượng nhỏ nhưng đóng góp đáng kể trong cơ chế sinh bệnh của biofilm. Một số nghiên cứu cho thấy sau khi đã xử lý biofilm với kháng sinh, một số lượng nhỏ các persister vẫn tồn tại dai dẳng bất kể nồng độ kháng sinh được sử dụng. Khi quá trình điều trị kháng sinh kết thúc, nồng độ kháng sinh giảm, các persister còn lại sẽ hoạt động như những tế bào mầm giúp tái tạo lại biofilm, dẫn đến các nhiễm trùng thứ phát.
Cho đến nay, các persister được 8 xem là cơ chế bẩm sinh hợp lý nhất giải thích cho sự hạn chế dung nạp kháng sinh của biofilm [1]. Cơ chế cảm ứng có điều kiện phức tạp hơn cơ chế điều hòa bẩm sinh và chưa được nghiên cứu cụ thể. Cơ chế cảm ứng có điều kiện xuất hiện sau một đợt điều trị kháng sinh tạo ra một tín hiệu cho các tế bào trong biofilm. Vì vậy có thể giả định kháng sinh giúp chọn lọc ra các gen kháng thuốc đặc hiệu cho quần thể biofilm [1].3 Các phương pháp kiểm soát biofilm a.
Kháng sinh Việc sử dụng kết hợp nhiều kháng sinh tốt hơn là dùng đơn độc một loại trong điều trị nhiễm biofilm. Ngoài việc lựa chọn kháng sinh phù hợp, liều dùng thích hợp cũng cần thiết. Mặc dù có khả năng vượt trội trong sử dụng fluoroquinolones cho vi khuẩn Gram âm, rifampicin cho vi khuẩn Gram dương để chống lại biofilm, sự phá hủy hoàn toàn biofilm vẫn rất khó khăn [9]. Ức chế quorum sensing Phương pháp nhắm vào cơ chế hoạt động của quorum sensing giúp kiểm soát sự lây nhiễm của biofilm.
Khi độc lực của vi khuẩn suy giảm, hệ miễn dịch của vật chủ dễ dàng loại bỏ vi khuẩn và không hoạt hóa các cơ chế nhiễm trùng đặc hiệu. Bất hoạt các thụ thể LuxR bằng cách sử dụng chất đối kháng với N-acyl homoserine lactone (AHL). Các chất đối kháng hạn chế sự liên kết của LuxR với các phân tử tín hiệu AHL có liên quan đến biểu hiện quorum sensing của vi khuẩn [10]. Tuy nhiên, vi khuẩn đang phát triển để chống lại các tác nhân ức chế quorum sensing.
Probiotic và các chất chuyển hóa của Probiotic - Postbiotic Probiotic và các chất hòa tan được chúng giải phóng trong quá trình phát triển, được gọi là postbiotic, mở ra nhiều cơ hội mới kháng lại biofilm của các vi khuẩn gây bệnh. Các phân tích tổng hợp cho thấy tỷ lệ làm giảm biofilm hiệu quả của dịch CFS là 76% và của probiotic là 77% [11].
