Luận văn thạc sĩ: Tạo protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng Aeromonas hydrophila

• Tác giả: Nguyễn Tấn Lộc
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Phi Nga
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tạo protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng Aeromonas hydrophila
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: Lý do chọn đề tài
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila và bệnh xuất huyết ở cá tra
• 2.2. Thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể
• 2.3. Thực thuẩn thể. Liệu pháp thực khuẩn thể. Aeromonas phage PVN02
• 2.4. Tổng quan về endolysin
• 2.4.1. Giới thiệu endolysin và phân loại. Cấu trúc endolysin. Cơ chế hoạt động của endolysin kháng các vi khuẩn gây bệnh Gram dương
• 2.4.2. Ứng dụng của endolysin kháng các vi khuẩn Gram âm
• 2.4.3. Sự đề kháng endolysin
• 2.4.4. Ứng dụng của endolysin
• 2.4.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Chủng vi sinh vật, plasmid. Môi trường, hóa chất, vật liệu
• 3.4. Thiết bị, dụng cụ
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phân tích trình tự endolysin cell wall hydrolase
• 3.5.2. Tối ưu hóa codon gene endolysin cell wall hydrolase
• 3.5.3. Tạo dòng gene endolysin cell wall hydrolase
• 3.5.4. Tách chiết plasmid và giải trình tự
• 3.5.5. Biểu hiện endolysin tái tổ hợp trong tế bào E.
• 3.5.6. Thu hồi endolysin tái tổ hợp bằng cột Ni-NTA
• 3.5.7. Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch endolysin tái tổ hợp thô
• 3.5.8. Độ lặp lại và phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân tích trình tự endolysin và tối ưu hóa gene endolysin
• 4.2. Kết quả tạo vector biểu hiện mang gene endolysin tái tổ hợp
• 4.3. Kết quả biểu hiện endolysin tái tổ hợp trong tế bào E.
• 4.4. Kết quả biểu hiện endolysin khi cảm ứng bằng IPTG
• 4.5. Kết quả biểu hiện endolysin khi cảm ứng bằng lactose
• 4.6. Kết quả thu hồi endolysin tái tổ hợp bằng cột Ni-NTA
• 4.7. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của dịch endolysin tái tổ hợp thô
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về Nghiên cứu protein endolysin

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng Aeromonas hydrophila. Endolysin là enzyme có khả năng phân cắt peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn, giúp tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Việc sử dụng endolysin như một phương pháp điều trị thay thế cho kháng sinh đang trở nên cần thiết do tình trạng kháng kháng sinh gia tăng trong các chủng Aeromonas hydrophila. Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển một phương pháp hiệu quả và an toàn để kiểm soát bệnh xuất huyết ở cá tra, một trong những vấn đề nghiêm trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam.

1.1. Tình hình nghiên cứu hiện tại

Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Aeromonas hydrophila là nguyên nhân chính gây ra bệnh xuất huyết ở cá tra, với tỷ lệ tử vong cao. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này không còn hiệu quả do sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Thực khuẩn thể, đặc biệt là endolysin, được xem là một giải pháp khả thi. Nghiên cứu của Từ Quang Vinh và cộng sự (2020) đã chỉ ra rằng phage PVN02 có hoạt tính ly giải cao đối với Aeromonas hydrophila, tạo điều kiện cho việc phát triển endolysin từ phage này.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc tái tổ hợp gene endolysin cell wall hydrolase từ phage PVN02. Các bước chính bao gồm phân tích trình tự gene, tối ưu hóa codon, và tạo dòng gene trong tế bào E. coli. Sau đó, endolysin được biểu hiện và thu hồi bằng phương pháp cột Ni-NTA. Cuối cùng, hoạt tính kháng vi khuẩn của endolysin tái tổ hợp được khảo sát bằng các phương pháp thử nghiệm khác nhau. Kết quả cho thấy endolysin có khả năng giảm số lượng vi khuẩn Aeromonas hydrophila một cách hiệu quả mà không cần sử dụng các chất thấm màng ngoài tế bào vi khuẩn.

2.1. Tạo dòng gene và biểu hiện

Quá trình tạo dòng gene bắt đầu với việc phân tích các ORF từ genome của phage PVN02 để xác định gene mã hóa cho endolysin. Sau khi tối ưu hóa codon, gene được tổng hợp và đưa vào plasmid pET28a(+). Hệ thống biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3) được sử dụng để biểu hiện endolysin. Kết quả cho thấy endolysin tái tổ hợp có hoạt tính kháng vi khuẩn rõ rệt, với mức giảm 1.17 log CFU/ml vi khuẩn sau 60 phút thử nghiệm.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy endolysin tái tổ hợp từ phage PVN02 có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila mạnh mẽ. Việc sử dụng endolysin như một liệu pháp điều trị có thể giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế trong ngành nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm sinh học an toàn và hiệu quả để thay thế cho kháng sinh truyền thống. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong lĩnh vực sinh học phân tử mà còn có ứng dụng thực tiễn cao trong ngành nuôi trồng thủy sản.

3.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp mới để kiểm soát bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra, nhằm giảm thiểu sự phụ thuộc vào kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản. Việc phát triển endolysin tái tổ hợp không chỉ giúp tăng cường sức khỏe cho cá mà còn bảo vệ môi trường sống, giảm thiểu rủi ro về dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản. Kết quả nghiên cứu này có thể được áp dụng để phát triển các sản phẩm sinh học trong tương lai, phục vụ cho nhu cầu ngày càng cao về thực phẩm an toàn và bền vững.