CHƯƠNG 1. Lý do chọn đề tài Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những loài cá da trơn nước ngọt, có giá trị kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Trong năm 2021, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt trên 8,9 tỷ USD, trong đó xuất khẩu cá tra đạt trên 1,6 tỷ USD (chiếm hơn 17,9%) là mặt hàng đứng thứ hai chỉ sau xuất khẩu tôm [1]. Tuy nhiên sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh là yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển bền vững của ngành cá tra.
Trong đó, một trong những tác nhân phổ biến nhất gây bệnh xuất huyết trên cá tra đó là vi khuẩn Aeromonas hydrophila, có thể gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi cá tra. Các chất kháng sinh thường được sử dụng để điều trị và ngăn chặn bệnh này, tuy nhiên gần đây cho thấy rằng việc kiểm soát bằng kháng sinh có thể không còn thích hợp do sự kháng kháng sinh của vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Theo một nghiên cứu của Quách Văn Cao Thi và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã kháng hoàn toàn một số loại kháng sinh như nhóm penicillin, cefalexin và trimethoprim/sulfamethoxazole; kháng cao với các kháng sinh tetracyclin, florfenicol và các chủng vi khuẩn này đều đa kháng thuốc [2]. Bên cạnh đó, dư lượng kháng sinh cũng đã được phát hiện trong khi xuất khẩu, nhiều lô hàng của Việt Nam đã bị từ chối do tồn dư dư lượng thuốc kháng sinh cao hơn mức đã được phê duyệt.
Việc tiêu thụ dư lượng kháng sinh vượt quá giới hạn chấp nhận có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người về lâu dài. Ngoài ra, việc sử dụng kháng sinh không phù hợp có thể ảnh hưởng đến tính bền vững lâu dài của ngành công nghiệp thủy sản nói chung và ngành cá tra nói riêng do những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường nuôi và hệ sinh thái [3]. Do những yếu tố trên, vì thế nhu cầu cấp thiết để có một giải pháp thay thế, hiệu quả và thân thiện với môi trường đó là liệu pháp phage. Thực khuẩn thể (bacteriophage hay phage) là virus xâm nhiễm vi khuẩn.
Nó có thể sao chép sau khi xâm nhiễm và có khả năng ly giải hoặc tích hợp bộ gen của nó vào tế bào chủ [4]. Việc sử dụng phage ly giải để chống lại các tác nhân vi khuẩn gây 2 bệnh đã được sử dụng từ lâu, cách đây hàng trăm năm [5] nhưng phương pháp này chỉ mới được chú ý trong ngành thủy sản trong vòng 40 năm qua, đặc biệt là khi đối mặt với sự lan truyền vi khuẩn kháng lại kháng sinh. Nghiên cứu của Richards (2014) cũng đã báo cáo liệu pháp phage đã được sử dụng để chống lại các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản [6]. Jun và cộng sự báo cáo rằng phage pAh1-C và pAh6-C có tác dụng bảo vệ chống lại sự chết hàng loạt của cá chạch do A.
hydrophila gây ra [7]. Ngoài ra, các liệu pháp sử dụng A. hydrophila-phage 2 và A. hydrophila-phage 5 được áp dụng cho cá da trơn trong quá trình nhiễm vi khuẩn đã làm tăng tỷ lệ sống sót của cá thử nghiệm một cách đáng kể [8].
Liệu pháp phage cũng đã được nghiên cứu để kiểm soát A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra [3]. Thay vì sử dụng thực khuẩn thể thì sử dụng enzyme ly giải của nó (endolysin) để diệt tế bào vi khuẩn chủ được xem như là một ứng viên, tác nhân kháng khuẩn đặc hiệu mới. Endolysin (còn được gọi là phage lysin hoặc lysin) là các enzyme của thực khuẩn thể có khả năng phân cắt lớp peptidoglycan, làm mất ổn định thành tế bào và phá vỡ tế bào vi khuẩn, dẫn đến việc giải phóng các phage mới.
Đã có nhiều nghiên cứu về tạo dòng, biểu hiện endolysin tái tổ hợp kháng lại các tác nhân vi khuẩn gây bệnh [9], [10]. Tuy nhiên, cho đến hiện tại các công bố nghiên cứu về endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng vi khuẩn A. hydrophila, tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá tra còn rất hạn chế. Nghiên cứu trước đó của Từ Quang Vinh và cộng sự (2020) đã khảo sát cho thấy phage PVN02 có hoạt tính ly giải cao vi khuẩn A.
hydrophila và toàn bộ genome của phage PVN02 đã được giải trình tự [11]. Các kết quả này là tiền đề để thực hiện nghiên cứu: “Tạo protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể kháng Aeromonas hydrophila quy mô phòng thí nghiệm”. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá khả năng tạo endolysin tái tổ hợp từ gene cell wall hydrolase của phage PVN02. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Phạm vi của nghiên cứu là thiết lập hệ thống biểu hiện gene endolysin tái tổ hợp và đánh giá định tính hoạt tính endolysin tái tổ hợp thô ở phòng thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu - Phân tích các ORF từ trình tự genome của phage PVN02 để xác định các gene mã hóa cho endolysin. - Tối ưu hóa codon và tổng hợp gene endolysin cell wall hydrolase. - Tạo dòng và biểu hiện gene endolysin cell wall hydrolase trong tế bào biểu hiện E. - Khảo sát hoạt tính ly giải vi khuẩn Aeromonas hydrophila của endolysin tái tổ hợp dạng thô.
- Khảo sát sử dụng cột Ni-NTA để thu hồi enzyme. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: đề tài bước đầu tạo chủng E. coli BL21 (DE3) mang plasmid pET28a(+) có mang gene endolysin cell wall hydrolase, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. - Ý nghĩa thực tiễn: với phạm vi nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu cách thức tái tổ hợp endolysin, do đó chưa đặt ra ý nghĩa ý thực tiễn.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila và bệnh xuất huyết ở cá tra Aeromonas hydrophila (hình 2.1) là một loài vi khuẩn dị dưỡng, Gram âm, hình que, có thể tồn tại trong cả môi trường hiếu khí và thiếu khí, nó thường được tìm thấy trong môi trường nước. Vi khuẩn này thường gây bệnh trên một số loài động vật như: cá, rùa, rắn và động vật lưỡng cư. Trong số các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá thì Aeromonas hydrophila là vi khuẩn gây bệnh nhiều nhất cho nhiều loài cá nước ngọt trên toàn thế giới với các dấu hiệu bệnh lý như nhiễm trùng máu, xuất huyết và lở loét [12].
Ở cá tra, một trong những bệnh do vi khuẩn phổ biến nhất là bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra. Nó gây ra tỷ lệ tử vong lên đến 80% với các dấu hiệu lâm sàng như xuất huyết trên đầu, miệng và ở gốc vây, hậu môn xuất huyết và sự hiện diện của chất dịch màu hồng tới vàng tích tụ trong khoang bụng (hình 2. Sự xâm nhiễm này thường xảy ra vào thời điểm thay đổi từ mùa khô sang mùa mưa, đặc biệt là trong thời kỳ cá bị căng thẳng trong khi xử lý và vận chuyển [13]. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila.dk/microatlas/food/bacteria/Aeromonas_hydrophila/).
Bệnh xuất huyết ở cá tra [13]. Độc lực của Aeromonas hydrophila đối với cá là do nhiều yếu tố, do vi khuẩn này sản xuất, tiết ra các yếu tố độc lực chẳng hạn như chất kết dính (adhensin) cytotoxin, hemolysin, lipase và protease cũng như là khả năng hình thành màng biofilm, sử dụng con đường trao đổi chất đặc trưng và sự biểu hiện các yếu tố độc lực trung gian thông qua một dạng quorum sensing (tín hiệu giao tiếp của vi khuẩn) [15]. Nhìn chung, việc phòng ngừa và điều trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào việc áp dụng rộng rãi các chất kháng sinh [16]. Thuốc kháng sinh không chỉ tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu mà còn có thể phá vỡ hệ sinh vật và sự cân bằng sinh thái của môi trường nước [17].
Với việc sử dụng thường xuyên các loại thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, các chủng A. hydrophila kháng thuốc đang ngày càng tăng lên; tồn dư thuốc kháng sinh trong sản phẩm và môi trường ngày càng nghiêm trọng [18], [19]. Vivekanandhan và cộng sự đã chỉ ra rằng 99% các chủng A. hydrophila phân lập từ cá và tôm đã kháng với methicillin, rifampicin, bacitracin và novobiocin [20].
Gần đây, De Silva và cộng sự (2019) đã thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của 32 chủng Aeromonas, và thấy rằng tất cả các chủng đều kháng đa thuốc và 100% kháng ampicillin, colistin, vancomycin và cephalothin [21]. Các chủng kháng thuốc có thể sinh sản và truyền sức đề kháng của nó, tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh và kháng với nồng độ ngày càng cao [22]. Ngoài ra, nhiều bệnh nhiễm khuẩn là do vi khuẩn hình thành màng sinh học (biofilm) [23]. hydrophila có khả năng hình thành màng sinh học trên mô vật chủ, cũng như các cơ chất khi nuôi trồng thủy sản [24].
Vi khuẩn trong màng sinh học có khả năng kháng thuốc kháng sinh 6 cao hơn, vì cấu trúc màng sinh học giúp giảm sự xâm nhập của các hợp chất kháng khuẩn khiến việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gặp phải thách thức nghiêm trọng [25]. Vì vậy, các liệu pháp kháng khuẩn mới là cấp thiết phải được phát triển [26]. Thực khuẩn thể và liệu pháp thực khuẩn thể 2. Thực thuẩn thể Thực khuẩn thể (bacteriophage, hay phage) là các virus xâm nhiễm vi khuẩn.
Chúng tồn tại phổ biến ở khắp mọi nơi và cần vật chủ là vi khuẩn. Chúng cũng là một trong những loài sinh vật phong phú nhất được tìm thấy trên sinh quyển. Sự tương tác giữa thực khuẩn thể và vi khuẩn chủ đã được các nhà nghiên cứu khai thác như một công cụ để hiểu về sinh học phân tử cơ bản, tái tổ hợp di truyền, chuyển gene ngang và sự tiến hóa của vi khuẩn được thúc đẩy bởi phage [27]. Phage có thể trải qua hai chu trình sống khác nhau, đó là chu trình tan (lytic) và chu trình tiềm tan (lysogenic) (hình 2.
Trong chu trình tan có các giai đoạn sau: phage nhận biết tế bào vi khuẩn chủ (1), sau đó phage bám vào vi khuẩn chủ đặc hiệu trên một thụ thể được tìm thấy trên bề mặt vi khuẩn (2) và tiêm vật chất di truyền của nó vào tế bào vi khuẩn chủ (3). Sau đó phage sẽ dùng hệ thống của vi khuẩn chủ để sao chép vật chất di truyền (4), tổng hợp các protein cấu trúc (5) và lắp ráp các protein tạo thành các phage hoàn chỉnh mới (6). Bước cuối cùng là các protein được mã hóa bởi phage chẳng hạn như endolysin và holin giúp ly giải tế bào vi khuẩn chủ (7). Holin là những protein nhỏ tích tụ trong màng tế bào chất của tế bào chủ và hỗ trợ endolysin phân cắt peptidoglycan và giải phóng phage mới [28].