Tổng quan nghiên cứu

Bệnh xuất huyết trên cá tra do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam. Theo báo cáo của ngành, xuất khẩu cá tra năm 2021 đạt trên 1,6 tỷ USD, chiếm gần 18% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản, tuy nhiên sự bùng phát dịch bệnh do A. hydrophila đã ảnh hưởng tiêu cực đến sản lượng và chất lượng cá tra. Việc sử dụng kháng sinh truyền thống đang dần mất hiệu quả do sự kháng thuốc ngày càng gia tăng của vi khuẩn này, với tỷ lệ kháng đa thuốc lên đến gần 100% đối với một số loại kháng sinh phổ biến. Dư lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm cũng gây ra nhiều vấn đề về an toàn thực phẩm và môi trường.

Trong bối cảnh đó, nghiên cứu tập trung vào việc tạo protein endolysin tái tổ hợp từ thực khuẩn thể PVN02, một loại virus xâm nhiễm đặc hiệu A. hydrophila, nhằm phát triển tác nhân kháng khuẩn mới, thân thiện môi trường và hiệu quả hơn. Mục tiêu chính của nghiên cứu là tổng hợp gene endolysin cell wall hydrolase, tạo dòng biểu hiện trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3) và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của protein tái tổ hợp trên vi khuẩn A. hydrophila. Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh từ tháng 02/2021 đến tháng 06/2022. Kết quả nghiên cứu góp phần mở ra hướng đi mới trong kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra, giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và nâng cao tính bền vững của ngành thủy sản.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về thực khuẩn thể (bacteriophage) và enzyme endolysin. Thực khuẩn thể là virus xâm nhiễm vi khuẩn, có chu trình sống tan (lytic) và tiềm tan (lysogenic). Endolysin là enzyme phân cắt peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn, được tổng hợp trong giai đoạn cuối của chu trình tan, giúp ly giải tế bào chủ và giải phóng phage mới. Endolysin có cấu trúc gồm enzymatically active domain (EAD) và cell wall binding domain (CBD), trong đó EAD chịu trách nhiệm phân cắt liên kết peptidoglycan, còn CBD giúp nhận biết và bám vào thành tế bào vi khuẩn với độ đặc hiệu cao.

Đối với vi khuẩn Gram âm như A. hydrophila, lớp màng ngoài tế bào là rào cản lớn đối với hoạt tính của endolysin từ bên ngoài. Tuy nhiên, một số endolysin có khả năng kháng khuẩn mà không cần sử dụng chất thấm màng ngoài, mở ra tiềm năng ứng dụng trong liệu pháp thay thế kháng sinh. Ngoài ra, lý thuyết về tối ưu hóa codon và biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống E. coli BL21 (DE3) được áp dụng để tăng hiệu quả sản xuất endolysin.

Các khái niệm chính bao gồm:

  • Thực khuẩn thể và chu trình sống (lytic và lysogenic)
  • Endolysin và cơ chế ly giải thành tế bào vi khuẩn
  • Cấu trúc protein endolysin (EAD và CBD)
  • Tối ưu hóa codon cho biểu hiện protein tái tổ hợp
  • Hoạt tính kháng khuẩn của endolysin đối với vi khuẩn Gram âm

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 4.4T phân lập từ cá tra bệnh tại Cần Thơ và thực khuẩn thể PVN02 được phân lập từ môi trường ao nuôi cá tra. Gene endolysin cell wall hydrolase được tổng hợp sau khi tối ưu hóa codon dựa trên trình tự genome phage PVN02. Gene này được khuếch đại bằng PCR, cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và HindIII, sau đó nối vào vector biểu hiện pET-28a(+).

Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) bằng phương pháp biến nạp lạnh-nóng. Các khuẩn lạc được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự để xác nhận trình tự gene. Protein endolysin tái tổ hợp được biểu hiện bằng cảm ứng IPTG và lactose, thu nhận sau 4 giờ cảm ứng. Dịch protein thô được thu nhận bằng phá tế bào siêu âm và ly tâm.

Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột Ni-NTA dựa trên His-tag gắn ở đầu N của protein. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch endolysin thô được khảo sát bằng phương pháp spot test và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, đo giảm số lượng vi khuẩn A. hydrophila sau 60 phút ủ. Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại độc lập, dữ liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm IBM SPSS Statistic 20.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Tối ưu hóa và tổng hợp gene endolysin: Gene endolysin cell wall hydrolase dài 540 bp, mã hóa protein 179 amino acid (~19,6 kDa), được tối ưu hóa codon với chỉ số CAI đạt 0.93 và thành phần GC 56%, phù hợp cho biểu hiện trong E. coli. Việc thay thế codon hiếm và bộ ba mở đầu GTG thành ATG giúp tăng hiệu quả biểu hiện.

  2. Tạo dòng và xác nhận vector tái tổ hợp: Gene endolysin được chèn thành công vào vector pET-28a(+), biến nạp vào E. coli BL21 (DE3) và xác nhận bằng PCR khuẩn lạc với sản phẩm 562 bp. Giải trình tự plasmid tái tổ hợp cho thấy trình tự gene chính xác, đảm bảo tính đúng đắn của vector biểu hiện.

  3. Biểu hiện protein endolysin tái tổ hợp: Protein được biểu hiện hiệu quả khi cảm ứng bằng IPTG và lactose, với thời gian cảm ứng 4 giờ. Điện di SDS-PAGE cho thấy băng protein mục tiêu ~20 kDa rõ ràng trong dịch tế bào. Cảm ứng bằng lactose với nồng độ 2 mM cho kết quả biểu hiện tương đương IPTG, mở ra lựa chọn thay thế tiết kiệm chi phí.

  4. Hoạt tính kháng khuẩn của endolysin tái tổ hợp: Dịch protein thô làm giảm 1.17 log CFU/ml vi khuẩn A. hydrophila sau 60 phút ủ, không cần sử dụng chất thấm màng ngoài tế bào. Phương pháp spot test cho thấy vòng ly giải rõ ràng trên đĩa thạch, chứng minh khả năng ly giải vi khuẩn từ bên ngoài. So với các nghiên cứu trước, hoạt tính này là đáng kể đối với vi khuẩn Gram âm mà không cần tiền xử lý.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy endolysin cell wall hydrolase từ phage PVN02 có cấu trúc đặc trưng với domain hydrolase_2 và vùng xoắn xuyên màng, có thể giúp enzyme xuyên qua màng ngoài của vi khuẩn Gram âm. Việc tối ưu hóa codon và sử dụng hệ thống biểu hiện E. coli BL21 (DE3) đã tạo điều kiện thuận lợi cho sản xuất protein tái tổ hợp với hiệu suất cao.

Hoạt tính kháng khuẩn không cần chất thấm màng ngoài là điểm nổi bật, phù hợp với các nghiên cứu gần đây về endolysin có khả năng tự xuyên màng hoặc có cấu trúc đặc biệt giúp vượt qua rào cản này. Kết quả này cũng tương đồng với các nghiên cứu về endolysin tái tổ hợp kháng vi khuẩn Gram âm khác như KF2_Lys và Abtn-4, tuy nhiên mức giảm vi khuẩn trong nghiên cứu này vẫn còn ở mức trung bình, cần cải thiện trong các nghiên cứu tiếp theo.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện mức giảm log CFU/ml vi khuẩn sau các khoảng thời gian ủ với endolysin tái tổ hợp so với đối chứng, cùng bảng so sánh hoạt tính với các endolysin khác trong cùng nhóm vi khuẩn Gram âm. Điều này giúp minh họa rõ ràng hiệu quả và tiềm năng ứng dụng của protein.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Nâng cao hiệu quả biểu hiện protein: Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng, như nồng độ lactose, thời gian và nhiệt độ, nhằm tăng năng suất endolysin tái tổ hợp. Thực hiện trong vòng 6 tháng, do nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học.

  2. Tinh sạch và tinh chế protein đạt độ tinh khiết cao: Áp dụng các kỹ thuật tinh sạch bổ sung như sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký lọc gel để thu nhận endolysin tinh khiết, phục vụ cho các thử nghiệm hoạt tính sâu hơn. Thời gian thực hiện 3-4 tháng, do nhóm kỹ thuật protein đảm nhiệm.

  3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên quy mô lớn và trong điều kiện thực tế: Thử nghiệm trên cá tra trong điều kiện nuôi thực nghiệm để đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh xuất huyết do A. hydrophila. Thời gian 12 tháng, phối hợp với các trại nuôi cá tra.

  4. Nghiên cứu cơ chế tác động và khả năng đề kháng của vi khuẩn: Phân tích chi tiết cơ chế ly giải tế bào và khảo sát khả năng phát triển đề kháng của A. hydrophila với endolysin tái tổ hợp. Thời gian 6 tháng, do nhóm nghiên cứu sinh học phân tử thực hiện.

  5. Phát triển sản phẩm ứng dụng thương mại: Dựa trên kết quả nghiên cứu, phối hợp với doanh nghiệp để phát triển sản phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, hướng đến thị trường trong và ngoài nước. Kế hoạch dài hạn 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm về biểu hiện và hoạt tính endolysin tái tổ hợp, làm nền tảng cho các đề tài phát triển liệu pháp kháng khuẩn mới.

  2. Chuyên gia và kỹ sư trong ngành nuôi trồng thủy sản: Tham khảo giải pháp thay thế kháng sinh truyền thống, ứng dụng công nghệ sinh học để kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra, nâng cao hiệu quả sản xuất và an toàn thực phẩm.

  3. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và dược phẩm thủy sản: Tài liệu giúp phát triển sản phẩm endolysin sinh học, mở rộng thị trường và đáp ứng nhu cầu kiểm soát dịch bệnh bền vững.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách về an toàn thực phẩm và thủy sản: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách kiểm soát sử dụng kháng sinh và khuyến khích ứng dụng công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản.

Câu hỏi thường gặp

  1. Endolysin là gì và tại sao được quan tâm trong kiểm soát vi khuẩn?
    Endolysin là enzyme do thực khuẩn thể tổng hợp để ly giải thành tế bào vi khuẩn chủ, giúp giải phóng phage mới. Chúng được quan tâm vì khả năng kháng khuẩn đặc hiệu, giảm nguy cơ đề kháng so với kháng sinh truyền thống.

  2. Tại sao cần tối ưu hóa codon khi biểu hiện protein tái tổ hợp?
    Tối ưu hóa codon giúp tăng hiệu quả phiên mã và dịch mã trong tế bào chủ, giảm codon hiếm, từ đó tăng năng suất và chất lượng protein tái tổ hợp.

  3. Endolysin có thể kháng được vi khuẩn Gram âm như Aeromonas hydrophila không?
    Thông thường, màng ngoài của vi khuẩn Gram âm cản trở endolysin, nhưng một số endolysin có cấu trúc đặc biệt hoặc được biến đổi có thể xuyên qua màng ngoài và ly giải vi khuẩn như trong nghiên cứu này.

  4. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của endolysin?
    Phương pháp spot test và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch được sử dụng để đánh giá khả năng ly giải và ức chế sinh trưởng vi khuẩn sau khi xử lý với endolysin.

  5. Endolysin có thể thay thế hoàn toàn kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản không?
    Endolysin là giải pháp tiềm năng nhưng hiện vẫn cần nghiên cứu thêm về hiệu quả, an toàn và ứng dụng thực tế. Chúng có thể được sử dụng kết hợp hoặc thay thế từng phần kháng sinh truyền thống.

Kết luận

  • Đã thành công trong việc tổng hợp, tối ưu hóa codon và tạo dòng biểu hiện gene endolysin cell wall hydrolase từ phage PVN02 trong E. coli BL21 (DE3).
  • Protein endolysin tái tổ hợp có trọng lượng khoảng 19,6 kDa được biểu hiện hiệu quả và thu nhận dưới dạng dịch thô.
  • Endolysin tái tổ hợp thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt với Aeromonas hydrophila, giảm 1.17 log CFU/ml sau 60 phút mà không cần chất thấm màng ngoài.
  • Nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho liệu pháp sinh học thay thế kháng sinh trong kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra.
  • Các bước tiếp theo bao gồm tối ưu hóa biểu hiện, tinh sạch protein, thử nghiệm in vivo và phát triển sản phẩm ứng dụng thực tiễn.

Luận văn này là tài liệu tham khảo quý giá cho các nhà khoa học, chuyên gia thủy sản và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học và nuôi trồng thủy sản. Để thúc đẩy ứng dụng rộng rãi, cần tiếp tục nghiên cứu và hợp tác đa ngành nhằm phát triển các giải pháp bền vững, an toàn và hiệu quả.