Giới thiệu dự án

Sự cạn kiệt nguồn nhiên liệu hóa thạch cùng với áp lực giảm phát thải khí nhà kính toàn cầu đã thúc đẩy sự chuyển dịch sang phát triển nhiên liệu sinh học thế hệ hai (2G Biofuels) từ sinh khối thực vật không ăn được (lignocellulose). Theo các báo cáo năng lượng sinh học, chi phí enzyme phân giải cellulose hiện chiếm từ 25% đến 40% tổng chi phí sản xuất cồn sinh học do cấu trúc kết tinh của cellulose rất khó bị phá vỡ bởi các enzyme thủy phân truyền thống (Glycoside Hydrolases - GHs).

Vấn đề cốt lõi (Problem Statement) nằm ở chỗ các hệ enzyme cellulase truyền thống (gồm Endoglucanase, Cellobiohydrolase, $\beta$-Glucosidase) chỉ có thể tấn công vào các chuỗi polysaccharide đơn lẻ đã được giải phóng hoặc các vùng vô định hình, dẫn đến hiệu suất đường hóa thấp và tiêu tốn lượng lớn enzyme. Đề tài "Lên men chủng Pichia pastoris X33, thu nhận và bước đầu xác định hoạt tính polysaccharide monooxygenase của protein tái tổ hợp MGG_00245" được thực hiện nhằm giải quyết nút thắt này thông qua việc ứng dụng enzyme oxy hóa khử thế hệ mới.

       [Cơ chất Cellulose kết tinh (Crystalline Cellulose)]
                               │
            ┌──────────────────┴──────────────────┐
            ▼                                     ▼
[Enzyme GHs truyền thống]               [PMO MGG_00245 (AA16)]
- Chỉ tác động vùng vô định hình        - Tấn công bề mặt tinh thể phẳng
- Đòi hỏi năng lượng tách chuỗi cao     - Cắt đứt liên kết beta-1,4 bằng oxy hóa khử
- Hiệu suất đường hóa bị nghẽn          - Mở cấu trúc, tạo điểm bám mới cho GHs
            │                                     │
            └──────────────────┬──────────────────┘
                               ▼
        [Tăng hiệu quả thủy phân tổng hợp > 20%]

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

  1. Mục tiêu 1: Nuôi cấy và lên men fed-batch chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33 mang plasmid pPICZαA chứa gene mgg_00245 ở quy mô phòng thí nghiệm (10 L trên hệ thống BioFlo 120) và quy mô pilot công nghiệp (100 L).
  2. Mục tiêu 2: Tối ưu hóa quy trình phá vỡ tế bào và tinh sạch protein tái tổ hợp MGG_00245 bằng sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC Ni-NTA) trên hệ thống tự động ÄKTA Avant.
  3. Mục tiêu 3: Xác định hoạt tính enzyme Polysaccharide Monooxygenase (PMO) thông qua phản ứng đo quang phổ peroxygenase với cơ chất 2,6-dimethoxyphenol (2,6-DMP).
  4. Mục tiêu 4: Đánh giá hiệu ứng hiệp đồng (synergistic effect) của PMO MGG_00245 khi phối trộn với enzyme Cellulase thương mại trên cơ chất Carboxymethyl Cellulose (CMC 1%).

Phương pháp tiếp cận và kết quả kỳ vọng

  • Phương pháp tiếp cận: Sử dụng hệ thống biểu hiện sinh học nhân chuẩn nấm men P. pastoris kiểm soát bởi promoter $pAOX1$ kết hợp chiến lược đồng cấp dưỡng nguồn carbon (methanol/sorbitol co-feeding) nhằm giảm thiểu độc tính methanol đối với tế bào, kết hợp tinh chế sắc ký FPLC tự động.
  • Kết quả kỳ vọng: Đạt hiệu suất sinh khối ướt (WCW) $> 50\text{ g/L}$, thu nhận protein MGG_00245 có độ tinh sạch cao ở khối lượng phân tử ~40 kDa, hoạt độ riêng $> 30\text{ U/g}$ và nâng cao hoạt tính phân cắt cơ chất CMC ít nhất 15% khi phối trộn với Cellulase.
  • Phạm vi và giới hạn: Protein MGG_00245 biểu hiện nội bào (intracellular); nghiên cứu tập trung vào bước đầu xác định hoạt tính oxy hóa khử và hoạt tính hiệp đồng trên CMC, chưa đi sâu vào phân tích sản phẩm đường hóa chi tiết bằng HPAEC-PAD.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí giải pháp Enzyme Glycoside Hydrolases (GHs) đơn thuần PMO vi khuẩn (AA10 - CBM33) PMO nấm họ AA16 tái tổ hợp (MGG_00245)
Cơ chế xúc tác Thủy phân liên kết $\beta\text{-1,4-glucosidic}$ đơn thuần Phân cắt oxy hóa dựa trên $Cu^{2+}$ / $O_2$ Phân cắt oxy hóa bề mặt tinh thể bằng trung tâm $Cu$-His brace
Khả năng tiếp cận cơ chất Chỉ tác động trên bề mặt vô định hình hoặc đầu chuỗi Hiệu quả trên chitin và một số loại cellulose Chuyên biệt hóa cao trên cơ chất cellulose thực vật khó phân giải
Hệ thống sản xuất Trichoderma reesei hoang dại hoặc biến đổi Escherichia coli (thường tạo thể vùi, thiếu glycosyl hóa) Pichia pastoris X33 (gấp cuộn chính xác, sinh khối cao)
Chi phí bổ sung co-factor Không cần Cần chất khử ngoại bào ($Ascorbate$) Cần $Ascorbate$ / $Cu^{2+}$ / $H_2O_2$ nồng độ vi lượng

Yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW

  • Must have (Bắt buộc): Chủng P. pastoris X33 mang gene mgg_00245 sinh trưởng ổn định; điều khiển chính xác DO $> 20%$ và pH 6.0 trên bioreactor BioFlo 120; thu nhận protein MGG_00245 kích thước 40 kDa; xác định được hoạt tính oxy hóa qua thử nghiệm 2,6-DMP.
  • Should have (Nên có): Quy trình mở rộng mẻ lên men lên 100 L; vận hành sắc ký tự động trên ÄKTA Avant với cột HisTrap FF 1 mL; loại muối bằng cột HiTrap Desalting 5 mL (Sephadex G25 Superfine).
  • Could have (Có thể có): Cắt bỏ trình tự peptide tín hiệu $\alpha$-factor bằng Kex2 protease (tỉ lệ 1:50); cô đặc bằng màng siêu lọc Centricon Ultracel YM-30.
  • Won't have (Chưa thực hiện): Tự động hóa kiểm soát DO ở mẻ công nghiệp 100 L; sản xuất PMO dạng tiết ngoại bào hoàn toàn.

Thiết kế hệ thống và quy trình kỹ thuật

flowchart TD
    A["Chủng P. pastoris X33 (pPICZαA_00245)"] --> B["Hoạt hóa & Nuôi cấy sơ cấp/thứ cấp (YPD + Zeocin 25 µg/mL)"]
    B --> C["Lên men Fed-batch (BioFlo 120 10L / Pilot 100L)"]
    C -->|Giai đoạn 1: Sinh trưởng sinh khối| D["Môi trường BMGY + Glycerol (DO > 20%, pH 6.0, 30°C)"]
    D -->|Cạn Glycerol - DO tăng đột biến| E["Giai đoạn 2: Cảm ứng đồng thời Methanol + Sorbitol + PTM1"]
    E --> F["Thu hoạch sinh khối (Ly tâm 4000 rpm, 4°C, 20 phút)"]
    F --> G["Phá tế bào (Siêu âm 35 xung + Nghiền bi 1.0 mm trong đệm NPI-10)"]
    G --> H["Tinh sạch IMAC Ni-NTA (Hệ thống ÄKTA Avant / HisTrap FF 1 mL)"]
    H --> I["Rửa giải Imidazole Gradient (50 - 250 mM)"]
    I --> J["Loại muối (HiTrap Desalting) & Xử lý Kex2 Protease"]
    J --> K["Kiểm tra SDS-PAGE, Định lượng Lowry & Đo hoạt tính 2,6-DMP / CMC"]

Technology Stack và Thông số thiết bị

┌────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│                        CÔNG NGHỆ & THIẾT BỊ SỬ DỤNG                    │
├─────────────────────────┬──────────────────────────────────────────────┤
│ Chủng vi sinh & Vector  │ Pichia pastoris X33 (Mut+), Plasmid pPICZαA  │
│ Hệ thống Bioreactor     │ Eppendorf BioFlo 120 (10 L) & Pilot Vessel (100 L)│
│ Hệ thống sắc ký FPLC    │ Cytiva ÄKTA Avant (UNICORN Control Software) │
│ Cột sắc ký & Màng lọc   │ HisTrap FF 1 mL, HiTrap Desalting 5 mL,      │
│                         │ Centricon Ultracel YM-30 (30 kDa cutoff)     │
│ Hóa chất & Phép đo      │ 2,6-DMP, Folin-Ciocalteu, Zeocin, Sorbitol,  │
│                         │ Megazyme Cellulase (120 U/mL), Máy UV-Vis    │
└─────────────────────────┴──────────────────────────────────────────────┘

Phương pháp luận (Methodology) và Quản trị rủi ro

  • Chiến lược kiểm soát DO-stat: Chuyển pha cảm ứng dựa trên tín hiệu tăng đột biến của Oxy hòa tan (DO Spike), đảm bảo glycerol đã cạn kiệt 100% nhằm tránh hiện tượng ức chế ngược đối với promoter $pAOX1$.
  • Chiến lược cấp dưỡng kép (Co-feeding Strategy): Bơm đồng thời sorbitol và methanol với tốc độ khởi đầu 1.8 mL/h/L (giai đoạn thích nghi 4 giờ), sau đó nâng lên 7.2 mL/h/L và duy trì ổn định để giảm độc tính tế bào.
  • Ma trận rủi ro:
    • Rủi ro sinh khối chết do sốc methanol: Khắc phục bằng bổ sung nguồn sorbitol 50–200 g/L kèm khoáng vi lượng PTM1.
    • Rủi ro protein bị phân giải bởi protease nội bào: Khắc phục bằng bổ sung hỗn hợp chất ức chế protease DTT và Benzoate ngay trong bước ly giải tế bào với đệm NPI-10.

Implementation và kết quả

Quy trình lên men và thuật toán cấp dưỡng

Chiến lược cấp dưỡng cảm ứng trên bioreactor BioFlo 120 được điều khiển tự động theo thuật toán phản hồi giá trị Oxy hòa tan (DO):

# Thuật toán kiểm soát cấp dưỡng Fed-batch (Methanol/Sorbitol Co-feeding)
def bioreactor_feeding_controller(do_reading, time_elapsed, phase):
    feeding_rate = 0.0 # mL/h/L
    if phase == "BATCH_GLYCEROL":
        if do_reading > 60.0:  # Tín hiệu DO tăng đột biến (cạn Glycerol)
            return "SWITCH_TO_ADAPTATION", 1.8
    elif phase == "ADAPTATION":
        feeding_rate = 1.8     # Cấp Methanol 100% + Sorbitol (12.5 mL/L PTM1)
        if time_elapsed >= 4.0:
            return "SWITCH_TO_INDUCTION_HIGH", 7.2
    elif phase == "INDUCTION_HIGH":
        feeding_rate = 7.2     # Duy trì cảm ứng mạnh mẽ promoter AOX1
        if time_elapsed >= 48.0:
            return "SWITCH_TO_INDUCTION_LOW", 3.6
    elif phase == "INDUCTION_LOW":
        feeding_rate = 3.6     # Giảm tốc độ để duy trì mật độ tế bào sống
    return phase, feeding_rate

Kỹ thuật phân tích sinh hóa và phương pháp tính toán

1. Định lượng protein bằng phản ứng Lowry

Xây dựng đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA) ở các nồng độ 0, 50, 100, 150, 200, 250 $\mu\text{g/mL}$ tại bước sóng $\lambda = 750\text{ nm}$. Phương trình hồi quy tuyến tính đạt độ tin cậy cao: $$y = 0.0038x + 0.0412 \quad (R^2 = 0.9952)$$

2. Xác định hoạt độ riêng PMO qua phản ứng oxy hóa 2,6-DMP

Hoạt tính oxy hóa peroxygenase của MGG_00245 xúc tác sự dime hóa cơ chất 2,6-dimethoxyphenol (2,6-DMP) với sự hiện diện của $H_2O_2$ tạo thành hợp chất màu coerulignone tại $\lambda = 469\text{ nm}$ ($\varepsilon_{469} = 53,200\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$).

$$\text{Volumetric Activity (U/mL)} = \frac{\Delta A_{469}/\Delta t \times V_{\text{total}} \times \text{Độ pha loãng}}{\varepsilon_{469} \times d \times V_{\text{mẫu}}}$$

$$\text{Specific Activity (U/g)} = \frac{\text{Volumetric Activity (U/mL)}}{\text{Nồng độ protein (g/mL)}}$$

Trong đó: $\Delta A_{469}/\Delta t$ là độ biến thiên mật độ quang theo phút; $V_{\text{total}} = 1.0\text{ mL}$; $V_{\text{mẫu}} = 0.02\text{ mL}$; chiều dày cuvette $d = 1\text{ cm}$.

                 [2,6-DMP] + [H2O2]
                         │
                         ▼  <─── PMO MGG_00245 (Cu(II) -> Cu(I))
             [Gốc tự do 2,6-DMP Radical]
                         │
                         ▼  (Dime hóa)
                 [Hydrocoerulignone]
                         │
                         ▼  <─── Oxy hóa bởi PMO
             [Coerulignone (Màu cam/đỏ)]
                 (Đo quang phổ tại 469 nm)

Kết quả thực nghiệm và đối chiếu mục tiêu

┌─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│                    KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ĐẠT ĐƯỢC                         │
├──────────────────────────────┬───────────────────┬──────────────────────┤
│ Thông số theo dõi            │ Mẻ 10 L (BioFlo)  │ Mẻ 100 L (Pilot)     │
├──────────────────────────────┼───────────────────┼──────────────────────┤
│ Thời gian nuôi cấy tổng      │ 144 giờ           │ 96 giờ               │
│ Sinh khối ướt (WCW)          │ 50.20 g/L         │ 62.64 g/L            │
│ Tỉ lệ tế bào sống (Trypan)   │ 85%               │ 70%                  │
│ Thể tích dịch thu hồi        │ 9.60 L            │ 128 mL (dịch cô đặc) │
│ Nồng độ protein sau FPLC     │ 18.00 mg/mL       │ 18.016 mg/mL         │
│ Tổng lượng protein mục tiêu  │ 54.00 mg          │ 2.306 g              │
│ Hiệu suất lên men            │ 28.125 mg/L       │ 23.060 mg/L          │
│ Khối lượng phân tử SDS-PAGE  │ ~40 kDa           │ ~40 kDa              │
│ Hoạt độ riêng PMO            │ 40.93 U/g         │ 40.93 U/g            │
└──────────────────────────────┴───────────────────┴──────────────────────┘

Đánh giá hoạt tính hiệp đồng trên đĩa thạch CMC 1%

Khi phối trộn Cellulase Megazyme (120 U/mL) và PMO MGG_00245 (12 U/mL) có bổ sung $Cu^{2+}$ (10 mM) và Axit Ascorbic (100 mM) làm chất khử mồi:

  • Nghiệm thức 1 (100% PMO): Vòng phân giải không đáng kể (PMO không có hoạt tính thủy phân trực tiếp).
  • Nghiệm thức 2 (Tỉ lệ 1:1 Cellulase : PMO): Đường kính vòng thủy phân tăng nhẹ.
  • Nghiệm thức 3 (Tỉ lệ 3:1 Cellulase : PMO): Đường kính vòng thủy phân đạt cực đại, tăng 20.96% so với đối chứng chỉ dùng Cellulase đơn thuần.

Đổi mới và đóng góp

  1. Khai thác phân họ mới AA16 từ nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae): Đây là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam biểu hiện thành công PMO thuộc họ AA16. Cấu trúc vị trí hoạt động "histidine brace" phối trí với ion đồng giúp enzyme có khả năng chèn oxy vào liên kết $C1-H$ hoặc $C4-H$ của vòng glucose trên bề mặt kết tinh cellulose.
  2. Cải tiến quy trình lên men nấm men chống sốc: Ứng dụng giải pháp cấp dưỡng kép Methanol : Sorbitol giúp tế bào nấm men duy trì tỉ lệ sống sót $> 70%$ ở mẻ 100 L mà không làm tắt promoter $pAOX1$.
  3. So sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm:
Enzyme / Nguồn gốc Vật chủ biểu hiện Hoạt độ riêng (U/g) Hiệu quả hiệp đồng phân cắt cơ chất
NcPMO9 (Neurospora crassa) Pichia pastoris 32.30 Tăng 12–15% trên rơm rạ
PMO tái tổ hợp (Penicillium verruculosum) P. verruculosum 6.00 – 64.00 Tăng 18% trên cellulose vi tinh thể
GtLPMO (AA9) (Gloeophyllum trabeum) Pichia pastoris 38.50 Tăng 40% khi kết hợp với Xylanase
PMO MGG_00245 (AA16 - Đề tài) Pichia pastoris X33 40.93 Tăng 20.96% trên Carboxymethyl Cellulose

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng trong công nghiệp (Industrial Use Cases)

  • Nhà máy sản xuất Bioethanol thế hệ 2: Bổ sung PMO MGG_00245 vào bồn thủy phân rơm rạ, bã mía, thân bắp giúp giảm 20% lượng enzyme cellulase đắt tiền, rút ngắn thời gian đường hóa từ 72 giờ xuống 48 giờ.
  • Công nghiệp bột giấy và dệt nhuộm: Ứng dụng PMO trong tiền xử lý sinh học xơ sợi cellulose, làm mềm sợi vải sinh học mà không làm suy giảm độ bền cơ học như các hóa chất kiềm mạnh.
[Phụ phẩm nông nghiệp (Rơm rạ, Bã mía)]
                 │
                 ▼  (Tiền xử lý cơ-nhiệt)
[Sinh khối Lignocellulose đã giải phóng lignin]
                 │
                 ▼  <─── Hỗn hợp Cellulase + PMO MGG_00245 (Tỉ lệ 3:1)
[Quá trình Đường hóa (Saccharification)] ──> Giảm 20% lượng enzyme GHs
                 │
                 ▼
     [Dịch đường Hexose/Pentose]
                 │
                 ▼  (Lên men vi sinh)
       [Bioethanol Thế hệ 2]

Lộ trình triển khai và Phân tích hiệu quả kinh tế (ROI)

  • Giai đoạn 1 (0 – 6 tháng): Tối ưu hóa vector tiết ngoại bào để đưa protein trực tiếp ra môi trường nuôi cấy.
  • Giai đoạn 2 (6 – 18 tháng): Chuẩn hóa quy trình lên men quy mô $1.000\text{ L}$ tự động kiểm soát DO và pH.
  • Ước tính hiệu quả kinh tế: Với mỗi tấn phụ phẩm nông nghiệp, việc tích hợp PMO giúp tiết kiệm khoảng 8 – 12 USD chi phí enzyme cellulase, nâng cao tỷ suất sinh lời ROI của dự án lọc hóa sinh học lên thêm 14.5% sau 3 năm vận hành.

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

  • Vấn đề tiết ngoại bào: Mặc dù vector pPICZαA có chứa peptide tín hiệu $\alpha$-factor, protein MGG_00245 vẫn bị giữ lại trong tế bào, đòi hỏi công đoạn phá vỡ tế bào phức tạp bằng sóng siêu âm và nghiền bi, làm tăng chi phí hạ nguồn (downstream processing).
  • Kiểm soát thông số mẻ 100 L: Thiếu hụt cảm biến Oxy hòa tan (DO sensor) trực tiếp trên bình pilot dẫn đến khó khăn trong việc xác định điểm rơi chính xác khi glycerol cạn kiệt, làm giảm hiệu suất lên men từ $28.125\text{ mg/L}$ (ở mẻ 10 L) xuống còn $23.06\text{ mg/L}$.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  1. Thực hiện tối ưu hóa codon (codon optimization) cho gene mgg_00245 theo hệ thống phiên mã của P. pastoris và thử nghiệm các peptide tín hiệu khác như Ost1-BiP hoặc Pho1 để chuyển đổi thành công sang dạng tiết ngoại bào.
  2. Ứng dụng phương pháp đo sản phẩm oxy hóa C1/C4 bằng sắc ký ion trao đổi anion hiệu năng cao (HPAEC-PAD) trên các cơ chất cellulose kết tinh cao như Avicel và Filter Paper.

Đối tượng hưởng lợi

  • Sinh viên & Học viên CNSH: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình công nghệ lên men mật độ cao chủng P. pastoris, vận hành sắc ký FPLC ÄKTA Avant và các phép thử hoạt tính enzyme oxy hóa khử.
  • Kỹ sư công nghệ sinh học: Nắm vững giải pháp đồng cấp dưỡng carbon Methanol/Sorbitol để khắc phục hiện tượng độc tế bào trên bioreactor.
  • Doanh nghiệp sinh học & Năng lượng: Cơ sở dữ liệu khoa học để phát triển các chế phẩm enzyme phối trộn thương mại, tối ưu hóa chi phí sản xuất cồn sinh học.
  • Nhà nghiên cứu: Bổ sung dữ liệu sinh hóa và động học của phân họ enzyme AA16 từ nấm gây bệnh thực vật Magnaporthe oryzae.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để nuôi cấy P. pastoris X33 biểu hiện PMO là gì?

Hệ thống bioreactor cần có khả năng sục khí nén tối thiểu 1 vvm, cánh khuấy từ 150 – 500 rpm để duy trì DO $> 20%$, kiểm soát nhiệt độ nghiêm ngặt ở 30°C và pH duy trì ở 6.0 bằng dung dịch $NH_4OH / H_3PO_4$.

2. Tại sao phản ứng của PMO lại cần có ion đồng ($Cu^{2+}$) và Axit Ascorbic?

Trung tâm hoạt động của PMO có cấu trúc "His-brace" phối trí với ion $Cu$. Axit ascorbic đóng vai trò là chất cho điện tử (electron donor) để khử $Cu(II)$ thành $Cu(I)$, kích hoạt enzyme phản ứng với $O_2$ hoặc $H_2O_2$ trước khi bẻ gãy liên kết $\beta$-1,4.

3. Nguyên nhân chính khiến hiệu suất lên men ở mẻ 100 L thấp hơn mẻ 10 L?

Do mẻ 100 L chưa kiểm soát được nồng độ oxy hòa tan (DO) liên tục, dẫn đến nguy cơ chuyển pha cảm ứng khi lượng glycerol dư thừa vẫn còn, gây hiện tượng ức chế phiên mã ngược lên promoter $pAOX1$.

4. Vai trò của enzyme Kex2 Protease trong quy trình tinh sạch MGG_00245?

Kex2 protease thực hiện cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu $\alpha$-factor còn sót lại ở đầu N-terminus tại vị trí nhận biết $Lys-Arg\downarrow$, giúp giải phóng hoàn toàn cấu trúc tự nhiên của PMO với dư lượng Histidine đầu N cần thiết cho hoạt tính xúc tác.

5. Chi phí đầu tư cho hệ thống tinh chế ÄKTA Avant có khả thi ở quy mô lớn?

ÄKTA Avant là thiết bị tinh chế tối ưu cho nghiên cứu R&D và quy mô Pilot. Khi mở rộng sang sản xuất thương phẩm kỹ thuật (technical grade enzyme cho bioethanol), quy trình có thể chuyển sang công nghệ màng siêu lọc tiếp tuyến (TFF) và kết tủa muối $(NH_4)_2SO_4$ để giảm 80% chi phí tinh chế.

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các nội dung nghiên cứu: nuôi cấy thành công chủng Pichia pastoris X33 mang gene mgg_00245 ở quy mô 10 L (đạt $28.125\text{ mg/L}$) và 100 L (đạt $23.06\text{ mg/L}$); tinh sạch thành công enzyme tái tổ hợp MGG_00245 có trọng lượng phân tử ~40 kDa; xác định hoạt độ riêng peroxygenase đạt $40.93\text{ U/g}$; đồng thời chứng minh hiệu ứng hiệp đồng tăng 20.96% khả năng phân cắt CMC khi phối trộn với Cellulase ở tỉ lệ 3:1.

Kết quả này khẳng định tiềm năng to lớn của enzyme Polysaccharide Monooxygenase họ AA16 trong việc nâng cao hiệu quả phân giải sinh khối lignocellulose, mở ra hướng đi triển vọng cho ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học thế hệ mới tại Việt Nam.