Đặt vấn đề Trong bối cảnh khủng hoảng năng lượng toàn cầu, các vấn đề ô nhiễm môi trường, an ninh lương thực đang ngày một gia tăng, nhiên liệu sinh học thế hệ hai sử dụng sinh khối (cellulose) đang được quan tâm nghiên cứu. Việc sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối gap nhiều khó khăn, sử dung các enzyme glycoside hydrolase xử lý cellulose chưa thật sự hiệu quả. Chính vì thế các nhà khoa học đã tìm ra Polysaccharide monooxygenase có khả năng hỗ trợ các enzyme glycoside hydrolase trong việc phân giải cellulose. Một bước đột phá lớn vào năm 2010 khi Vaaje-Kolstad va ctv đã mô tả sự phân cắt oxy hóa của các liên kết glycosid bởi các enzyme ngày nay được gọi là Lytic polysaccharide monooxygenase.
Lytic polysaccharide monooxygenase là các enzyme don nhan đồng, với sự có mặt của một chất cho điện tử bên ngoải, xúc tác quá trình hydroxyl hóa một trong các nguyên tử cacbon (C1 hoặc C4) trong liên kết glycosid cắt kéo, cuối cùng dẫn đến phá vỡ liên kết bằng phản ứng oxy hóa khử. Việc phát hiện ra sự phân cắt oxy hóa của các liên kết glycosid bởi các Lytic polysaccharide monooxygenase đã có tac động rat lớn đến sự hiểu biết hiện tại của chúng ta về chuyển đổi các polysaccharide khó tính như chitin va cellulose. Số lượng các họ Lytic polysaccharide monooxygenase tiếp tục mở rộng và các đặc tính cơ chất mới cũng như các chức năng sinh học đang được khám phá. Trái ngược với các enzyme thủy phân tương tác với các chuỗi polysaccharide đơn lẻ, Lytic polysaccharide monooxygenase có thể hoạt động trên các chuỗi polysaccharide trong môi trường tinh thê.
Điều này dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc, làm cho cellulose đễ tiếp cận hơn đối với các enzyme thủy phân. Ngoài ra, các nghiên cứu cơ bản về cấu trúc và cơ chế xúc tác của Lytic polysaccharide monooxygenase đã được thực hiện mạnh mẽ dé khám phá triệt dé quá trình phân cắt oxy hóa chưa từng được biết đến trước đây của các thành phần cellulose (Eijsink và ctv, 2019). Hơn nữa, các nghiên cứu gan đây đã tiết lộ rang các Lytic polysaccharide monooxygenase kiêu hoang da được thiết kế khác nhau có thể góp phần vào quá trình đường hóa hiệu quả của các polysacarit khó tính thông qua tác dụng hiệp đồng của chúng với GH (Bernardi và ctv, 2021). Tuy nhiên, việc áp dụng Lytic polysaccharide monooxygenase cho các quy trình | xúc tác sinh học thực tế đã bị cản trở bởi những nhược điểm như khó sản xuất quy mô lớn và độ ôn định trong quá trình phân cắt.
Năm 2019, Filiatrault va ctv đã phát hiện một nhóm enzyme mới có hoạt tính PMO có nguồn sốc từ nắm, được xếp vào họ AA16, đặc hiệu với cơ chat cellulose, trong đó có MGG 00245 là enzyme có trình tự axit amin tương đồng với trình tự enzyme AA16 được công bố được lưu trên cơ sở dữ liệu enzyme Carbonhydrat (CAZymes, www. Năm 2020, Loan va ctv đã thiết kế thành công vector biểu hiện pPICZaA mang gene mgg 00245 mã hóa cho PMO MGG 00245, đồng thời tạo thành công chủng P. Pastoris X33:PMO00245 mang gen mã hóa PMO MoAAl6 MGG 00245. Gen mgg_ 00245 có nguồn từ nắm Magnaporthe oryzae gây bệnh đạo ôn ở lúa, có hoạt tính với cơ chất cellulose, được mang đi tạo dòng và biểu hiện bởi hệ thống nam men Pichia pastoris.
Day được xem như một hệ thống nôi bật với nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, tăng trưởng nhanh, protein được biến đổi cần thiết sau dịch mã, khả năng tiết cao, an toàn. Từ những lý do nêu trên, với mong muốn chủ động nguồn enzyme có tiềm năng hỗ trợ phân cat cellulose, đề tài “Lên men chủng Pichia pastoris x33, thu nhận và bước đầu xác định hoạt tính polysaccharide monooxygenase của protein tái tổ hợp MGG_ 00245” được tiến hành. Mục tiêu đề tài Mục tiêu: Thu nhận sản xuất tái tổ hợp enzyme Polysaccharide monooxygenase họ AA16 và bước đầu xác định hoạt tính Polysaccharide monooxygenase. Nội dung thực hiện Đề tài gồm 4 nội dung: Đầu tiên, tiến hành lên men chủng nam men tái tổ hợp Pichia pastoris X33 có kiêu hình Mut+ đã được biến nạp thành công plasmid pPICZaA mang gen mgg 00245 mã hóa tạo protein MGG_ 00245 ở quy mô phòng thí nghiệm (10 lit) và quy mô công nghiệp (100 lít).
Sau đó tiễn hành thu nhận và tinh chế protein mục tiêu ở mẻ lên men trong phòng thí nghiệm và mẻ lên men công nghiệp. Đánh giá hoạt tính enzyme PMO MGG 00245 bằng phương pháp đo quang phổ 2,6-DMP. Và cuối cùng là khảo sát khả năng hỗ trợ phân cắt Cellulose của enzyme PMO MGG 00245. Ý nghĩa của đề tài Thu nhận và sản xuất chủ động enzyme Polysaccharide monooxygenase họ AA16, trỗ trợ phân cat cellulose, tiềm năng trong việc xử lý sinh khối và phát triển NLSH thế hệ 2.
TONG QUAN TÀI LIEU 2. Tổng quan về Lytic polysaccharide monooxygenase 2. Sự ra doi Lytic polysaccharide monooxygenase Những lo ngại về sự nóng lên toàn cau và sự cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch đã thúc day sự phát triển các chiến lược đa dạng dé đối phó với biến đổi khí hậu và đạt được mức trung hòa carbon. Chính vì thế sinh khối được coi là một trong những nguyên liệu quan trọng nhất dé xây dựng nền kinh tế carbon tuần hoàn (Moon va ctv, 2022; Park va ctv, 2022).
Trong số đó, sinh khối lignocellulose không ăn được được nhấn mạnh. bởi vì nó tránh được nhu cầu lựa chọn giữa thực phẩm và năng lượng và có thể được sản xuất với số lượng lớn. Trong các nhà máy tinh chế sinh học dựa trên lignocellulose, tiền xử lý bằng nhiệt hóa (tiền xử lý bằng axit loãng, kiềm và dung môi hữu co) là bước đầu tiên để chuyền đổi hiệu quả trong các quy trình tiếp theo dé phân hủy các thành phan lignin cứng dau. Sau đó, quá trình đường hóa thường được thực hiện dé thu được đường có thể lên men từ các thành phần cellulose hoặc hemicellulose.
Cuối cùng, quá trình lên men vi sinh vật sử dụng đường có thé lên men tạo ra nguồn carbon làm tiền đề dé san xuất nhiên liệu sinh học (Yoo vàc ctv, 2020). Đề đường hóa lignocellulose đã được xử lý trước, các hydrolase glycosid (GHs) đã được áp dụng rộng rãi trong một thời gian dài. Cellulase và hemicellulase tác động lên các polysacarit kết tinh trong lignocellulose dé tạo ra đường oligomeric hoặc monomeric thông qua quá trình thủy phân. Do đó, các nghiên cứu đã tập trung vào việc cải thiện quá trình sản xuất cellulase/hemicellulose với năng suất cao, kỹ thuật xúc tác hiệu qua và ôn định, phát triển các kết hợp khả thi cho các phản ứng lên men tiếp theo va lam sáng tỏ các co chế xúc tác (Guo va ctv, 2018; Min va ctv, 2021; Min va ctv, 2022).
Vào năm 1974, Erikson va ctv phát hiện rang quá trình phân cat cellulose bang enzyme hiện diện trong dung dịch nuôi cấy các loại nam phân hủy cellulose cho thay hiệu quả cao hơn nếu phản ứng được thực hiện trong điều kiện hiếu khí. Điều này dẫn đến một giả thuyết rang phan ứng oxy hóa có thé có liên quan đến việc phân cắt cellulose. Năm 2005, Vaaje-Kolstad và ctv phát hiện ra một số protein vốn được biết đến với tên gọi là “protein liên kết chitin” hay họ CBM33 (family 33 carbohydratebinding modules) có tác dung tăng cường hiệu qua cua các chitinase, enzyme thủy phân chính trong qua trình phân hủy chitin. Sau đó, vào năm 2010 Vaaje-Kolstad và ctv lần đầu tiên phát hiện ra rằng Lytic polysaccharide monooxygenase một loại protein liên kết chitin chứa Cu (CBP) với bề mặt liên kết phẳng, thúc đây oxy hóa quá trình phân hủy polysacarit, việc xác định Lytic polysaccharide monooxygenase đã thay đổi sâu sắc sự hiểu biết về quá trình đường hóa enzyme, liên quan đến sự phân cắt oxy hóa của polysacarit.
Enzyne CBP2I từ Serratia marcescens có thé tách các liên kết glycosid trong chitin tinh thé, là một chất tương tự của cellulose, và tạo ra các đầu chuỗi bị oxy hóa, do đó thúc đây quá trình phân hủy bằng cách mở ra polysacarit không thể tiếp cận để thủy phân bằng hydrolase (Vaaje-Kolstad va ctv, 2010). Khái niệm polysaccharide monooxygenase Lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO; PMO) đại diện cho một nhóm enzyme có trung tâm hoạt động gốc đồng duy nhất thực hiện xúc tác trên bề mặt tinh thé, oxy hóa các chuỗi polysacarit (Vaaje-Kolstad và ctv, 2010). Harris va ctv, 2010 cho rang PMO là một loại enzyme đóng vai trò chính trong quá trình khử polyme của cellulose và các polysacarit có cấu trúc phức tạp. Vào năm 2016, Kracher và ctv cho rằng PMO là các enzym độc đáo sử dụng oxy phân tử dé phân tách oxy hóa các liên kết glycosid trong polysacarit kết tinh.
PMO đóng vai trò quan trong trong công nghiệp giúp tăng cường kha năng tiếp cận của sinh khối lignocellulose dé chuyên đổi sinh học. Năm 2018, Bissaro và ctv khang định PMO sé trở thành các enzyme chủ chốt tham gia vào quá trình phân hủy sinh khối cellulose và rất được quan tâm dé sản xuất nhiên liệu sinh học lignocellulose trong tương lai. Kể từ báo cáo đầu tiên về PMO, cơ chế xúc tác va thông tin cấu trúc của nó đã được nghiên cứu chuyên sâu. Vào năm 2010, E1Jsink va ctv đã mô tả kha năng oxi hóa của PMO trên cellulose thông qua quá trình oxi hóa gắn kết dioxigen (O2) lên carbon, thay vì qua một quá trình hydrolysis như glycoside hydrolase truyền thống.
Điều này chứng minh rằng PMO thuộc nhóm oxyase. Năm 2011, Phillips và ctv cho rằng PMO có thể chèn oxy vào các liên kết C-H gần các liên kết glycosid, dẫn đến tăng sự phân hủy cellulose. Cho đến cuối năm 2011, các enzyme này mới có tên chính thức là LPMO/PMO. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các enzyme này không phải là glycoside hydrolase thực sự, mà thuộc nhóm oxydase.
Cấu trúc của PMO Vào những năm 1990, Suzuki và ctv đã phát hiện ra một loại Polysaccharide monooxygenase (PMO) có khả năng tạo lực liên kết mạnh với B-chitin, va đã đặt tên là protein liên kết chitin (Chitin binding protein, CBP21). Chỉ có ba cấu trúc của các enzyme này đã được xác định (CBP21, HjGH61 và TtGH61). Đến nay, đã có hơn 20 cau trúc PMO được đưa vào ngân hàng di liệu protein. Tất cả các PMO được mô tả cho đến nay đều có cấu trúc ba chiều tương tự nhau vả có một vi trí đặc trưng cao được bao tồn trên bề mặt.
Cấu trúc ba chiều và trạng thái hoạt động của mot PMO điên hình (E1isink và ctv, 2019). Mặc dù có sự biến đối trong các họ PMO khác nhau, nhưng cấu trúc cơ bản của PMO không thay đồi. Đó là một protein hình cầu với cấu trúc nếp gấp B-sandwich giống globulin miễn dịch, gồm 8-10 sợi B song song nối với nhau bang các vòng xoắn a có chứa các vị trí hoạt động và điểm tiếp cận chất.