Thiết Kế T-Vector Dùng Cho Tách Dòng Phân Tử Bằng Phương Pháp Sử Dụng Enzyme XcmI

• Tác giả: Lương Thị Thúy Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Thiết Kế T-Vector Để Tách Dòng Phân Tử Bằng Enzyme XcmI
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cơ sở khoa học
• 2.2. Tách dòng gene từ sản phẩm PCR
• 2.2.1. Phương pháp tách dòng đầu bằng
• 2.2.2. Phương pháp tách dòng đầu dính
• 2.2.3. Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector
• 2.3. Các phương pháp tạo T-vector
• 2.3.1. Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase
• 2.3.2. Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I
• 2.3.3. Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI
• 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Thiết kế T-vector pTUAF
• 3.2.2. Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM của hãng Thermo scientific
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Quy trình thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm
• 3.3.2. Thiết kế T-vector pTUAF
• 3.3.3. Thiết kế adapter
• 3.3.4. Gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T
• 3.3.5. Ứng dụng T–vector pTUAF trong tách dòng TA và đánh giá hiệu quả tách dòng
• 3.3.6. Thực hiện phản ứng TA cloning
• 3.3.7. Phương pháp biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt
• 3.3.8. Đánh giá hiệu quả tách dòng
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thiết kế T-vector pTUAF
• 4.2. Kết quả lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu
• 4.3. Kết quả gắn adapter vào vector PTZ57R/T tạo ra T-vector pTUAF
• 4.4. Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM
• 4.5. Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng
• 4.6. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
• 4.7. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 4.8. Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một enzyme giới hạn
• 4.9. So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Tài liệu trong nước
• Tài liệu nước ngoài

I. Tổng Quan Về Thiết Kế T Vector Cho Tách Dòng Phân Tử

Tách dòng gene là một phương pháp quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng enzyme DNA ligase để tạo liên kết giữa đoạn DNA cần tách dòng và vector plasmid. PCR cloning là một kỹ thuật nền tảng trong các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử. Mặc dù sản phẩm PCR có thể sử dụng trực tiếp trong nhiều ứng dụng, một số ứng dụng yêu cầu sản phẩm PCR phải được tách dòng và duy trì trong một vector. Do hiệu quả của tách dòng TA cao, phương pháp này đã được thương mại hóa dưới dạng các bộ KIT. Giá trị của bộ KIT tách dòng TA thực chất nằm ở T-vector.

1.1. Giới thiệu về phương pháp tách dòng phân tử PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là kỹ thuật phân tử ngày càng phổ biến trong ngành khoa học sinh học và y học hiện đại. Vì vậy hệ thống tách dòng của sản phẩm PCR nhanh chóng trở thành sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học. Tách dòng gen thành công từ sản phẩm PCR là một bước quan trọng để phân tích đoạn DNA kép được khuếch đại, mặc dù việc này còn gặp khó khăn. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng cho tách dòng sản phẩm PCR như: Tách dòng đầu bằng, tách dòng đầu dính và tách dòng TA.

1.2. Ưu điểm của T vector trong tách dòng phân tử

Khắc phục những nhược điểm của hai phương pháp trên thì việc sử dụng T-vector cho tách dòng phân tử được coi là phương pháp dễ dàng, tiết kiệm thời gian, công sức và có hiệu quả cao. Nền tảng của phương pháp này dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase đã thêm một nucleotide đơn vào đầu 3’-OH cuối cùng của đoạn khuếch đại, điển hình là adenosine (Clark, 1988). Sản phẩm PCR có một nucleotide adenosine nhô ra ở đầu 3’-OH ở hai đầu đoạn DNA khuếch đại. Do đó, sản phẩm PCR này có thể được tách dòng bằng cách đưa vào một vector có một nucleotide đơn Thymidine nhô ra ở đầu 3’-OH (Hình 2.1) mà không cần qua các bước xử lí sản phẩm sau PCR. Phương pháp này được gọi là Tách dòng TA (TA cloning) và vector đó được gọi là T-vector.

II. Thách Thức Giải Pháp Tách Dòng Enzyme XcmI T Vector

Trong thực tiễn nghiên cứu tại Việt Nam, các nguồn vật liệu dùng trong tách dòng gen chủ yếu là sản phẩm thương mại. T-vector thương mại thường được sử dụng tại các phòng thí nghiệm cho hiệu quả tách dòng cao nhưng chi phí cũng cao. Hiện nay T-vector được tạo ra bằng một số phương pháp bao gồm terminal transferase và dùng enzyme giới hạn như EcoRV, Eam1105I, XcmI. Trong đó phương pháp sử dụng enzyme XcmI để tạo T-vector là phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả tách dòng cao (93%).

2.1. Vấn đề chi phí trong tách dòng phân tử tại Việt Nam

Trong thực tiễn nghiên cứu tại Việt nam các nguồn vật liệu dùng trong tách dòng gen chủ yếu là sản phẩm thương mại. T-vector thương mại thường được sử dụng tại các phòng thí nghiệm cho hiệu quả tách dòng cao nhưng chi phí cũng cao (bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất Tên hãng Số phản ứng Chi phí (VND) Thermo scientific 10 3.000 Hiện nay T-vector được tạo ra bằng một số phương pháp bao gồm terminal trasferase và dùng enzyme giới hạn như EcoRV, Eam1105I (Chen, Songkumarn et al. 2009), XcmI (Borovkov and Rivkin 1997) (Testori, Listowsky et al.

2.2. Ưu điểm của enzyme XcmI trong tạo T vector

Trong khi đó, enzyme XcmI hầu như không có trên các vector tách dòng, vì vậy ta có thể chèn trình tự nhận biết enzyme này vào vùng MCS của vector mà vẫn duy trì hoạt động của một T-vector bình thường. Trình tự nhận biết của enzyme XcmI là 5’CCANNNNNNNNNTGG 3’, các nucleotide ở giữa có thể thay đổi (Arashi-Heese, Miwa et al.

III. Phương Pháp Thiết Kế T Vector Hiệu Quả Với Enzyme XcmI

Đề tài nghiên cứu tập trung vào việc “Thiết kế T-vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung. Mục tiêu nghiên cứu là tạo được T-vector pTUAF và ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng phân tử.

3.1. Mục tiêu và ý nghĩa của việc thiết kế T vector pTUAF

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung. Mục tiêu nghiên cứu - Tạo được T-vector pTUAF - Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng phân tử

3.2. Quy trình thiết kế T vector pTUAF sử dụng enzyme XcmI

Theo cách này có thể thiết kế một T-vector bằng cách chèn một đoạn oligonucleotid ngắn chứa hai vị trí cắt của enzyme XcmI. Khi đưa vào trong vector, vị trí này cho phép có thể thiết kế T-vector khi cắt với XcmI. Trình tự nhận biết của enzyme XcmI là 5’CCANNNNNNNNNTGG 3’, các nucleotide ở giữa có thể thay đổi (Arashi-Heese, Miwa et al.

IV. Ứng Dụng T Vector pTUAF Trong Tách Dòng TA Kết Quả

Nghiên cứu đã ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM. Kết quả cho thấy khả năng gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng thành công. Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc bằng phương pháp PCR và lập bản đồ giới hạn. Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một enzyme giới hạn cũng được đánh giá.

4.1. So sánh hiệu suất tách dòng của T vector pTUAF và KIT InsTAcloneTM

Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM. Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng . Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR . Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn .

4.2. Đánh giá khả năng tự đóng vòng của vector pTUAF

Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một enzyme giới hạn. So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase.

V. So Sánh Quy Trình Tạo T Vector XcmI vs Terminal Transferase

So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase. Phương pháp sử dụng enzyme XcmI đơn giản hơn và hiệu quả tách dòng cao hơn. Tuy nhiên, cần lưu ý đến khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế.

5.1. Ưu điểm của phương pháp sử dụng enzyme XcmI

Trong đó phương pháp sử dụng enzyme XcmI để tạo T-vector là phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả tách dòng cao (93%) (Arashi-Heese, Miwa et al. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung.

5.2. Lưu ý khi thiết kế T vector sử dụng enzyme XcmI

Tuy nhiên, thiết kế một vị trí duy nhất như vậy sẽ tạo ra một Adenosine ở đầu 5’-OH trên một sợi và một thydimidine thò ra ở sợi đối diện. Chính vì lý do này nên đòi hỏi cần có hai vị trí của enzyme XcmI để khi cắt ở hai vị trí nhận biết của XcmI sẽ tạo ra T ở đầu 3’-OH của mỗi sợi.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển T Vector Trong Tương Lai

Nghiên cứu đã tạo ra T-vector pTUAF thành công và ứng dụng hiệu quả trong tách dòng phân tử. Kết quả nghiên cứu tạo điều kiện để phát triển các hướng nghiên cứu thiết kế T-vector bằng việc sử dụng enzyme XcmI trên các vector khác nhau. Sản phẩm T-vector có thể được tạo ra với số lượng lớn nhằm đáp ứng nhu cầu tách dòng gene trong các phòng thí nghiệm và làm giảm chi phí cho các nghiên cứu về sinh học phân tử.

6.1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo điều kiện để phát triển các hướng nghiên cứu thiết kế T-vector bằng việc sử dụng enzyme XcmI trên các vector khác nhau. Ý nghĩa thực tiễn. Sản phẩm T-vector có thể được tạo ra với số lượng lớn nhằm đáp ứng nhu cầu tách dòng gene trong các phòng thí nghiệm và làm giảm chi phí cho các nghiên cứu về sinh học phân tử.

6.2. Hướng phát triển T vector sử dụng enzyme XcmI

Ở Việt Nam, năm 2005 Phan Trọng Hoàng và cộng sự đã thiết kế thành công vector tách dòng TA bằng việc chèn đoạn adapter dài 36bp, hai đầu của adapter là vị trí nhận biết của enzyme BamHI và đoạn adapter được chèn vào 11 vị trí đa tách dòng của vector pUC được cắt mở vòng với BamHI. Hiệu quả tách dòng đạt 91,4 % khi tiến hành tách dòng sản phẩm PCR dài 953 bp (Phan Trọng Hoàng et al, 2005).