Đặt vấn đề Tách dòng gene là một phương pháp phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Phương pháp tách dòng phổ biến nhất là sử dụng enzyme DNA ligase để tạo liên kết hóa trị giữa các đầu tương thích của đoạn DNA cần tách dòng và vector plasmid. Polymerase Chain Reaction (PCR) là một phản ứng khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu. Kĩ thuật này được phát minh cách đây hơn một thập kỉ và cho đến nay đã trở thành kĩ thuật nền tảng căn bản cho tất cả các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử trên toàn thế giới (Kolmodin and Birch 2002).
Mặc dù sản phẩm PCR có thể sử dụng trực tiếp trong nhiều ứng dụng, nhưng một số ứng dụng yêu cầu sản phẩm PCR phải được tách dòng và duy trì trong một vector (Kolmodin and Birch 2002). Vì hầu hết sản phẩm PCR đều có gốc Adenine ở 2 đầu 3’ bởi hoạt tính Terminal transferase của enzyme Taq polymerase nên T-vector được thiết kế có thymidine ở 2 đầu 3’ của T-vector và Adenosine ở đầu 3’ của sản phẩm PCR được gọi là “ TA cloning” (Vries 1998). Do hiệu quả của tách dòng TA cao, phương pháp này đã được thương mại hóa dưới dạng các bộ KIT. Mỗi bộ KIT tách dòng bao gồm 2 thành phần chính đó là T-vector và enzyme T4 DNA ligase, trong đó thành phần thứ 2 có thể được mua riêng biệt với giá rẻ hơn đáng kể.
Vì vậy, giá trị của bộ KIT tách dòng TA thực chất nằm ở T-vector. Trong thực tiễn nghiên cứu tại Việt nam các nguồn vật liệu dùng trong tách dòng gen chủ yếu là sản phẩm thương mại. T-vector thương mại thường được sử dụng tại các phòng thí nghiệm cho hiệu quả tách dòng cao nhưng chi phí cũng cao (bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất Tên hãng Số phản ứng Chi phí (VND) Thermo scientific 10 3.000 Hiện nay T-vector được tạo ra bằng một số phương pháp bao gồm terminal trasferase và dùng enzyme giới hạn như EcoRV, Eam1105I (Chen, Songkumarn et al. 2009), XcmI (Borovkov and Rivkin 1997) (Testori, Listowsky et al.
Trong đó phương pháp sử dụng enzyme XcmI để tạo T-vector là phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả tách dòng cao (93%) (Arashi-Heese, Miwa et al. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung. Mục tiêu nghiên cứu - Tạo được T-vector pTUAF - Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng phân tử 1. Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công T-vector pTUAF bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI phục vụ cho tách dòng phân tử.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo điều kiện để phát triển các hướng nghiên cứu thiết kế T-vector bằng việc sử dụng enzyme XcmI trên các vector khác nhau. Ý nghĩa thực tiễn. Sản phẩm T-vector có thể được tạo ra với số lượng lớn nhằm đáp ứng nhu cầu tách dòng gene trong các phòng thí nghiệm và làm giảm chi phí cho các nghiên cứu về sinh học phân tử.
4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Cơ sở khoa học 2. Tách dòng gene từ sản phẩm PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ thuật phân tử ngày càng phổ biến trong ngành khoa học sinh học và y học hiện đại. Vì vậy hệ thống tách dòng của sản phẩm PCR nhanh chóng trở thành sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học (Ido and Hayami 1997).
Tách dòng gen thành công từ sản phẩm PCR là một bước quan trọng để phân tích đoạn DNA kép được khuếch đại, mặc dù việc này còn gặp khó khăn. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng cho tách dòng sản phẩm PCR (Borovkov and Rivkin 1997) như: Tách dòng đầu bằng, tách dòng đầu dính và tách dòng TA. Để chọn một phương pháp tách dòng phù hợp cần dựa vào mục đích tách dòng, vector tách dòng (đầu bằng hoặc đầu dính) và sản phẩm PCR được tạo ra có đầu treo hoặc đầu bằng do các DNA polymerase khác nhau tạo ra sản phẩm PCR với kết thúc khác nhau, phù hợp cho vector tách dòng đầu bằng hoặc đầu dính. Đối với tách dòng sản phẩm PCR có kích thước lớn (ví dụ hơn 10kb) vượt quá khả năng tách dòng của các vector thông thường thì dùng vector cosmid hoặc λDNA (Bi 2002) 2.
Phương pháp tách dòng đầu bằng Tách dòng đầu bằng là một trong các phương án được sử dụng để tách dòng sản phẩm PCR. Trong phương pháp này sản phẩm PCR đầu bằng và vector cũng có đầu bằng có thể được nối lại với nhau (Bi 2002). Để tạo sản phẩm PCR với kết thúc đầu bằng mà không qua các bước biến đổi sau PCR thì cách đơn giản nhất là lựa chọn enzyme DNA polymerase chịu nhiệt tạo sản phẩm PCR đầu bằng, ví dụ như Vent và Tth, do chúng có hoạt tính 3’-5’ exonuclease (Lohff and Cease 1992). Tuy nhiên, ở 5 khoảng thời điểm những năm 1990 thì những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt tạo ra sản phẩm đầu bằng có tỉ lệ lỗi cao hơn so với enzyme Taq DNA polymerase.
Vấn đề đặt ra khi sử dụng Taq cho mục đích tách dòng đầu bằng đó là enzyme này có hoạt tính terminal transferase có thể gắn thêm một nucleotide adenine vào đầu 3’-OH cuối cùng mỗi mạch của sản phẩm PCR (Clark 1988) gây cản trở việc nối sản phẩm PCR với vector đầu bằng. Để khắc phục khó khăn này, đã có một số giải pháp đề ra. Thứ nhất, sản phẩm PCR được xử lý với đoạn Klenow của DNA polymerase I Thứ hai, sử dụng T4 (Skryabin and Vassilacopoulou 1993, Costa and Weiner 1994) hoặc pfu polymerase (Costa and Weiner 1994) để tạo đầu bằng của đoạn DNA cuối cùng. Mặc dù có thể sử dụng một số phương pháp để khắc phục nhược điểm nhưng khi đó thao tác thí nghiệm trở nên cồng kềnh, phức tạp, mất nhiều thời gian Hơn nữa, tách dòng đầu bằng còn có một yếu điểm rất đáng kể đó là xu hướng tự nối của vector cao dẫn đến các dòng mang vector tái tổ hợp thấp (Costa, Grafsky et al.
Phương pháp tách dòng đầu dính Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp sử dụng đầu bằng trong tách dòng sản phẩm PCR thì một phương án khác có thể cân nhắc đó là tách dòng đầu dính. Trên thực tế phương pháp này đã được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm. Vị tri cắt giới hạn của enzyme bất kì có thể được đưa vào đầu 5’ kết thúc của mồi và bám vào trong sản phẩm PCR. Sau khi cắt bởi các enzyme giới hạn tương ứng thì hai đầu kết thúc của sản phẩm PCR được tạo ra là đầu dính.
Sản phẩm PCR được cắt tạo đầu dính nối với vector cũng được cắt tạo đầu dính tương ứng, hiệu quả trong tách dòng đầu dính là tương đối hiệu quả (Scharf, Horn et al. 1986, Gal, Schnell et al. Tuy nhiên một vài khó khăn thường gặp trong tách dòng đầu dính đó là nhiều enzyme cắt hạn chế cắt không hiệu quả khi vị trí nhận biết của enzyme 6 nằm ở đầu 5’ của sản phẩm PCR mạch kép. Đặc biệt những vị trí này ở gần hoặc gần cuối cùng của đầu 5’ (Jung, Pestka et al.
1990, Kaufman and Evans 1990). Điều này có thể dẫn đến kết quả là sự liên kết không ổn định của enzyme cắt giới hạn với điểm cuối của DNA. Một giải pháp có thể khắc phục được vấn đề này là thêm một nucleotide vào đầu 5’ ngoài vị trí cắt giới hạn, nhưng điều này làm tăng chi phí tổng hợp mồi và cũng có thể làm giảm hiệu quả nối của mồi với khuôn. Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector Khắc phục những nhược điểm của hai phương pháp trên thì việc sử dụng T-vector cho tách dòng phân tử được coi là phương pháp dễ dàng, tiết kiệm thời gian, công sức và có hiệu quả cao.
Nền tảng của phương pháp này dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase đã thêm một nucleotide đơn vào đầu 3’-OH cuối cùng của đoạn khuếch đại, điển hình là adenosine (Clark, 1988). Sản phẩm PCR có một nucleotide adenosine nhô ra ở đầu 3’-OH ở hai đầu đoạn DNA khuếch đại. Do đó, sản phẩm PCR này có thể được tách dòng bằng cách đưa vào một vector có một nucleotide đơn Thymidine nhô ra ở đầu 3’-OH (Hình 2.1) mà không cần qua các bước xử lí sản phẩm sau PCR. Phương pháp này được gọi là Tách dòng TA (TA cloning) và vector đó được gọi là T-vector.1: Mô hình minh họa phương pháp tách dòng TA (Hermosa, Grondona et al.
Các phương pháp tạo T-vector 2. Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase. Dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase gắn thêm một trong 4 loại nucleotid vào đầu 3’-OH cuối cùng của sản phẩm PCR, một phương pháp thiết kế T-vector được tạo ra sử dụng enzyme cắt đầu bằng kết hợp với hoạt tính terminal transferase. Vector được cắt với enzyme giới hạn tạo đầu bằng EcoRV hoặc các enzyme tạo vector đầu bằng khác có vị trí nhận biết trên vector, được ủ với Taq polymerase (1 đơn vị/µg cho tổng thể tích là 20µl), sử dụng buffer 8 (50mM KCl, 10mM Tris pH: 8.5mM MgCl2 và 200µg/ml BSA) trong sự có mặt của 2mM dTTP, ủ ở 70oC trong 2 giờ, kết quả là thêm một thymidine vào đầu 3’ cuối cùng của mỗi mạch của vector mạch thẳng.
T-vector sau khi được tinh sạch và cô đặc (hình 2.2), được sử dụng cho tách dòng sản phẩm PCR (Hong, Choi et al. Cắt mở vòngvector bằng EcoRV dTTP, Taq và thu nhận T-vector Hình 2.2: Quy trình tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel và được nối với T-vector ở 14oC. Vector và sản phẩm PCR được nối với nhau bởi liên kết phosphodiester giữa đầu 5’-P của vector và nhóm 3’-OH của sản phẩm PCR. Phương pháp này hạn chế được khả năng vector tự đóng vòng do có một nucleotide thymidine thò ra ở đầu 3’-OH (Holton and Graham 1991).
Giải trình tự của các dòng 9 chứa đoạn chèn cho thấy có sự liên kết của một cặp T:A giữa vị trí của enzyme EcoRV và trình tự mồi của sản phẩm PCR. Chứng tỏ T-vector đã được tạo thành công. Phương pháp này tạo vector có đầu dính cho hiệu quả tách dòng cao hơn so với tách dòng đầu bằng mà không cần sửa đổi sản phẩm PCR .