MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài thực vật. Điều này có thể thấy rõ qua sự đa dạng về số lượng và các chủng loại loài thực vật khác nhau. Ngoài vai trò về giữ cân bằng sinh thái, cải tạo môi sinh trong việc điều hòa khí hậu thủy văn, các loài thực vật còn là nguồn cung cấp số lượng lớn các hợp chất thiên nhiên có tác dụng dược lý thú vị có thể ứng dụng trong nghiên cứu phát triển các thế hệ thuốc mới trong điều trị bệnh như: các bệnh về đường tiêu hóa, tim mạch, hệ hô hấp, bài tiết, máu, ung thư,.
Do đó, nghiên cứu sàng lọc các loại thảo dược có công dụng chữa bệnh nhằm tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên mới có hoạt tính sinh học cao hiện nay đang là một hướng đi tích cực thu hút được rất nhiều quan tâm từ các nhà khoa học. Hiện nay ung thư được đánh giá là một căn bệnh nan y. Mặc dù với sự tiến bộ của khoa học, tiến trình điều trị ung thư vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn và thách thức. Nguyên nhân chính là do sự khác biệt lớn giữa tế bào người và các đối tượng được tiền kiểm nghiệm, do độc tính quá cao của hoạt chất kháng ung thư với tế bào bình thường, và sự phát triển đa kháng thuốc quá nhanh của tế bào ung thư đối với thuốc điều trị.
Vì vậy việc tìm kiếm hoạt chất mới ứng dụng trong điều trị các bệnh ung thư luôn là một trong những mục tiêu đặc biệt quan trọng và hấp dẫn các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực hóa học, sinh học, hóa sinh và y dược học. Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu phát triển thuốc điều trị bệnh. Sự đa dạng về cấu trúc, hoạt tính gây độc tế bào cao và chọn lọc của các hợp chất thiên nhiên nổi trội so với các phương pháp nghiên cứu sàng lọc khác, đã chứng tỏ thiên nhiên là nguồn giàu tiềm năng có thể cung các hoạt chất đáp ứng việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới trong lĩnh vực hóa dược. Điều này được chứng tỏ qua xu hướng quay trở lại nghiên cứu và khai thác các lớp chất có nguồn gôc thiên nhiên từ năm 2000.
Ước tính từ 1981 đến 2010 có trên 60% số thuốc được chấp nhận trong điều trị bệnh có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên, được phân lập từ vi sinh vật trên cạn cũng như từ các vi sinh vật biển (vinca alkaloid, anthracyclin, podophyltotoxin, taxan, camptothecin,…. 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Cây đỉnh tùng phân bố chủ yếu ở một số nước Châu Á như: Trung Quốc, Đài Loan, Lào, Việt Nam, Myanma, Thái Lan, Nhật, Hàn Quốc. Thành phần hóa học chính là các alkaloid ester, các flavonoid và diterpenoid. Một số cephalotaxine alkaloid ester như harringtonine, homoharringtonine, isoharringtonine thể hiện được hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư mạnh như: phổi, máu, Sarcoma-180, HCT116, SK-BR-3 và HepG2.
Đáng chú ý, năm 2012 homoharringtonine đã được FDA chấp nhận là thuốc hỗ trợ trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính do tủy xương tạo ra, và đặc biệt áp dụng trên những người gặp khó khăn trong điều trị với đơn thuốc imatinib. Cơ chế của thuốc được cho là ngăn chặn quá trình tổng hợp protein trong tế bào gốc, từ đó thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình định sẵn (apoptosis). Theo kết quả điều tra của các nhà thực vật, ở Tây Nguyên có 16 loài thông, trong đó chỉ có loài thông đỏ nam (thông đỏ lá dài Taxus wallichiana Zucc.) được nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Ba loài: đỉnh tùng, thông lá dẹt, thông tre lá dài đã được nghiên cứu trên thế giới nhưng chưa nhiều.
Chi Cephalotaxus (chi đỉnh tùng) thuộc họ đỉnh tùng (Cephalotaxaceae), bộ thông (Pinales) trên thế giới có khoảng 11 loài nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Ở Việt Nam, chỉ có một loài thuộc chi Cephalotaxus là đỉnh tùng (tên khác là phỉ lược bí) có tên khoa học Cephalotaxus mannii Hook. Tuy nhiên ở nước ta hiện nay chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học cây đỉnh tùng, đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii) ở Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu thành phần hóa học của cây đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Thu thập, xử lý nguyên liệu là vỏ của cây đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.) Chiết mẫu thực vật bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Phân lập, tinh chế một số thành phần hóa học có trong vỏ cây đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.
Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết Phương pháp nghiên cứu và cô lập các hợp chất tự nhiên. Tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài Đỉnh tùng. Tìm hiểu các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng của chi và loài cây đang nghiên cứu. Nghiên cứu lý thuyết về các phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên.
Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm Nguyên liệu: vỏ cây đỉnh tùng được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ. Nguyên liệu đã xử lý được chiết theo trình tự với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và methanol sẽ thu được cao n-hexane, cao ethyl acetate và cao methanol. Phân lập, tách và tinh chế các chất từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, phương pháp kết tinh phân đoạn. Các phương pháp xác định cấu trúc: kết hợp các phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, phổ hồng ngoại (IR), phổ khối MS để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.
3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ HÌNH THÁI CỦA HỌ ĐỈNH TÙNG (CEPHALOTAXACEAE) Họ đỉnh tùng có danh pháp khoa học là Cephalotaxaceae, là một nhóm các loài thực vật quả nón, với 3 chi và khoảng hơn 20 loài. Ba chi của họ Cephalotaxaceae là: - Amentotaxus: Dẻ tùng hay sam bông - Cephalotaxus: Đỉnh tùng hay phỉ ba mũi - Torreya: Phỉ Họ đỉnh tùng Cephalotaxaceae bao gồm các loại cây bụi hay cây thân gỗ có nhiều cành. Lá của chúng thường xanh, sắp xếp theo vòng xoắn, thường vặn xoắn lại tại gốc lá để xuất hiện theo kiểu hai hàng lá.
Lá có hình dáng từ thẳng tới mũi mác, có màu xanh lục nhạt hoặc có các dải khí khổng trắng ở mặt dưới. Các loài của họ này hoặc là đơn tính cùng gốc hoặc là đơn tính cận khác gốc hay đơn tính khác gốc. Các nón đực dài khoảng 4 – 25 mm và phát tán phấn vào đầu xuân. Các nón cái bị thoái hóa, với một hoặc một số lá noãn và một hạt trên một lá noãn.
Khi hạt phát triển đầy đủ thì lá noãn cũng phát triển thành một dạng áo hạt nhiều thịt có màu lục, tía hay đỏ, mềm và có chứa nhựa. Thông thường hạt trưởng thành có độ dài 12 – 40 mm. Mỗi lá noãn nằm rời rạc, vì thế nón cái phát triển thành một cọng ngắn với một hay vài hạt trông giống như một loại quả mọng. Chúng có thể do chim hay một số loài động vật khác ăn để sau đó phát tán phần hạt cứng không bị phân hủy.
Chi Amentotaxus Amentotaxus là một chi thuộc họ đỉnh tùng Cephalotaxaceae gồm có 5 loài: Amentotaxus argotaenia Amentotaxus assamica Amentotaxus formosana 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Amentotaxus poilanei Amentotaxus yunnanensis Hình 1. Amentotaxus hóa thạch Hình 1. Amentotaxus formosana Các loài của chi Amentotaxus gồm các cây bụi, lá kim cao 2 – 15 mét, phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á, Đài Loan, miền nam Trung Quốc, phía đông dãy Himalaya, phía nam Việt Nam. Lá của chúng thường xanh, sắp xếp theo vòng xoắn, thường vặn xoắn lại tại gốc lá để xuất hiện theo kiểu hai hàng lá.
Lá có hình mũi mác, dài 4 – 12 cm và rộng 6 – 10 mm, có hai hàng khí khổng màu trắng ở mặt dưới của lá. Các loài của chi này có thể là đơn tính cùng gốc hoặc đơn tính khác gốc. Khi cây có hoa đực và hoa cái cùng ở chung một thân thì nón đực và nón cái thường nằm trên các chi nhánh khác nhau. Các nón đực dài 3 - 15 cm, nhóm lại thành cụm từ 2 – 6 cái, các nón cái mọc đơn hoặc mọc chụm vài cái trên một thân ngắn.
Chúng phát triển trong khoảng 18 tháng, hạt trưởng thành dài 1,5 – 3 cm được bao quanh bởi áo hạt ban đầu có màu cam và chuyển sang màu đỏ khi trưởng thành, đỉnh của hạt thường nhô ra một ít khỏi áo hạt. Chi Torreya Chi Torreya được đặt tên theo nhà thực vật học người Mỹ John Torrey, gồm khoảng 7 loài, chúng có nguồn gốc từ phía đông châu Á và Bắc Mỹ. Torreya californica Torreya clarnensis 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Torreya fargesii Torreya grandis Torreya jackii Torreya nucifera Torreya taxifolia Hình 1. Toreya nucifera Hình 1.
Torreya californica Chi Torreya gồm các loài cây lá kim cao 5 – 20 mét. Lá của chúng thường xanh, sắp xếp theo vòng xoắn, thường vặn xoắn lại tại gốc lá, lá dài 2 – 8 cm, rộng 3 - 4 mm. Các loài của chi này có thể là đơn tính cùng gốc hoặc đơn tính khác gốc. Khi cây có hoa đực và hoa cái cùng ở chung một thân thì nón đực và nón cái thường nằm trên các chi nhánh khác nhau.
Các nón đực dài 5 – 8 mm, xếp thành nhóm dọc theo cành cây. Các nón cái mọc đơn hoặc nhóm 2 – 8 cái trên một thân ngắn. Chúng phát triển khoảng 18 tháng, hạt trưởng thành dài 2 – 4 cm được bao quanh bởi áo hạt ban đầu có màu xanh lá và chuyển sang màu tím lúc trưởng thành. Hạt của một số loài như Torreyanucifera ở Nhật Bản có thể ăn được.
Hạt của những loài thuộc chi Torreya có thể phát tán tự nhiên nhờ động vật, loài sóc thường ăn hạt các loại cây này, vào mùa đông chúng chôn những hạt của cây để dự trữ thức ăn, một số ít các hạt còn thừa lại sẽ là hạt giống có thể nảy mầm và phát triển thành cây non. 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Chi Cephalotaxus Chi Cephalotaxus (chi đỉnh tùng) thuộc họ Cephalotaxaceae (họ đỉnh tùng), bộ Pinales (bộ thông), chi này có tến tiếng Anh là Plum Yew hoặc Cowtail Pine.