Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Lưu Anh Tú có tiêu đề "Sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học và chẩn đoán miễn dịch", được thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (chuyên ngành Ký sinh trùng học, mã số 62.05, năm 2018), dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Phạm Ngọc Doanh và TS. Bùi Khánh Linh.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu xuất phát từ thực tiễn sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus là ký sinh trùng lây truyền qua thực phẩm, ký sinh ở phổi người và động vật có vú, gây bệnh paragonimiasis với các tổn thương áp xe phổi mạn tính tương tự bệnh lao. Hơn 50 loài thuộc giống Paragonimus đã được ghi nhận trên thế giới, trong đó có 7 loài gây bệnh cho người (riêng châu Á có 3 loài: P. heterotremus, P. westermani, và P. skrjabini). Tại Việt Nam, 7 loài SLP đã được phát hiện, bao gồm cả 3 loài có khả năng lây nhiễm sang người. Tuy nhiên, P. skrjabini có tỷ lệ bắt gặp rất thấp; hai loài chiếm ưu thế là P. heterotremus (phân bố chủ yếu ở miền Bắc) và P. westermani (phân bố phổ biến ở Bắc Trung Bộ). Khoảng trống nghiên cứu được tác giả chỉ ra gồm:

  • Loài P. heterotremus đã được khảo sát về dịch tễ và vòng đời, nhưng loài P. westermani tại thời điểm nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện ấu trùng metacercaria trong cua suối tại Bắc Trung Bộ.
  • Chưa có dữ liệu khẳng định liệu P. heterotremus có phân bố ở miền Trung hay P. westermani có hiện diện ở miền Bắc hay không.
  • Đặc điểm đa dạng hình thái metacercaria, cấu trúc di truyền phân tử, đặc điểm sinh học (vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên, vật chủ chính ngoài tự nhiên, vai trò của vật chủ chứa, sức sống của metacercaria trong các điều kiện môi trường) của hai loài này tại Việt Nam chưa được làm sáng tỏ.
  • Phương pháp xét nghiệm cua thu metacercaria chưa được chuẩn hóa về thời gian lắng cặn và chưa có thực nghiệm so sánh định lượng giữa phương pháp ép kính và phương pháp giã-lọc.
  • Bệnh nhân sán lá phổi chủ yếu tập trung tại các vùng núi khó khăn, kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học ELISA thông thường đòi hỏi thiết bị quang phổ kế tại các bệnh viện tuyến trung ương, gây khó khăn cho việc phát hiện và điều trị sớm tại thực địa.

Mục tiêu chung của luận án là cung cấp cơ sở khoa học về hình thái, phân tử, sinh học của hai loài P. heterotremus và P. westermani, từ đó ứng dụng vào việc thiết lập kỹ thuật chẩn đoán nhanh phục vụ phòng chống bệnh sán lá phổi. Mục tiêu cụ thể được đánh số theo văn bản gồm:

  1. Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị.
  2. Xác định được sự đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai loài P. heterotremus và P. westermani.
  3. Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài P. heterotremus và P. westermani.
  4. Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Sán lá phổi loài Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani. Các vật liệu sinh học liên quan gồm: vật chủ trung gian thứ nhất (ốc nước ngọt), vật chủ trung gian thứ hai (cua suối), vật chủ chính (chó nhà, mèo nhà, phân động vật ăn thịt hoang dã), và vật chủ chứa (chuột nhắt trắng dòng BALB/c).
  • Phạm vi không gian: Thực địa khảo sát tại 6 xã thuộc 3 tỉnh gồm Lào Cai (xã Lương Sơn, huyện Bảo Yên), Yên Bái (xã An Lạc, huyện Lục Yên) và Quảng Trị (4 xã: Hướng Sơn, Tân Thành thuộc huyện Hướng Hóa; Đa Krông, Tà Long thuộc huyện Đa Krông). Các nội dung phân tích hình thái, sinh học phân tử và phản ứng miễn dịch được thực hiện tại Phòng Ký sinh trùng học và Phòng Hệ thống học phân tử và di truyền bảo tồn thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Hà Nội).
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 10 năm 2014 đến tháng 10 năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng hợp lịch sử phát hiện và phân loại sán lá phổi từ các công trình quốc tế kinh điển: Diesing (1828) phát hiện loài sán lá phổi đầu tiên ở rái cá (Pteronura brasiliensis) tại Brazil (Distomum rude); Kerbert (1878) mô tả Distoma westermani từ phổi hổ chết ở vườn thú Amsterdam; Braun (1899) xác lập giống Paragonimus; Dollfus (1939) thành lập họ Paragonimidae. Các công trình của Miyazaki (1981), Blair et al. (1997, 1999, 2001) đã phân tích sâu về đặc điểm hình thái sán trưởng thành, metacercaria và phân loại phân tử của giống Paragonimus. Tài liệu cũng ghi nhận các nghiên cứu phân biệt dạng lưỡng bội (diploid 2n) và tam bội (triploid 3n) của P. westermani dựa vào số lượng thể hạt tinh trùng trong túi nhận tinh và sai khác ở 2 vị trí nucleotide trên đoạn gen 16S rDNA ty thể (Terasaki et al., 1995; Bowles et al., 1995).

Về dịch tễ và vòng đời, các công trình quốc tế ghi nhận vai trò vật chủ trung gian thứ nhất của ốc thuộc các giống Oncomelania, Tricula, Semisulcospira, Brotia; vật chủ trung gian thứ hai gồm hơn 40 loài cua nước ngọt và 8 loài tôm; vật chủ chứa tự nhiên như lợn rừng, hươu hoang dã (Cervus nippon) tại Nhật Bản (Miyazaki, 1981; Shibahara et al., 1992; Nagayasu et al., 2015). Về kỹ thuật chẩn đoán, Itoh và Sato (1990) thiết lập kỹ thuật dot-ELISA trên màng nitrocellulose; Qiu et al. (2016) phát triển ELISA phát hiện IgG4 trong nước tiểu.

Tại Việt Nam, Monzel (1906) lần đầu tiên ghi nhận bệnh nhân sán lá phổi. Giai đoạn 1994–1997, sau khi ổ bệnh sán lá phổi tại Sìn Hồ (Lai Châu) được phát hiện, các nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng được triển khai bởi Viện Y học Lâm sàng các Bệnh Nhiệt đới và Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương (Nguyễn Văn Đề et al., Đỗ Dương Kon et al.), xác định tỷ lệ nhiễm ở người từ 0,2–15%, chó nhà 18,2–33,3%, cua suối 52,5–98,1%. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Phạm Ngọc Doanh et al., 2007–2014) khảo sát 56 điểm thuộc 3 tỉnh Tây Bắc, phát hiện metacercaria ở 3 loài cua (Potamiscus mieni, P. tannanti, P. kimboiensis) và cercaria ở ốc Oncomelania. Năm 2009, ấu trùng P. westermani lần đầu tiên được ghi nhận ở cua suối tỉnh Quảng Trị, sau đó mở rộng ra một số tỉnh miền Trung. Đến trước thời điểm luận án, tổng số 7 loài sán lá phổi đã được công bố ở Việt Nam.

Bảng tổng hợp các vấn đề đã giải quyết và khoảng trống tồn tại trước khi luận án thực hiện (được trích dẫn theo Bảng 1 trong văn bản luận án):

Vấn đề nghiên cứu Loài P. heterotremus Loài P. westermani
Phân bố
- Miền Bắc Đã xác định (+) Chưa xác định (?)
- Miền Trung Chưa xác định (?) Đã xác định (+)
Vật chủ trung gian thứ nhất
- Ngoài tự nhiên Chưa xác định (-) Chưa xác định (-)
- Trong thí nghiệm Đã xác định (+) Chưa xác định (-)
Vật chủ trung gian thứ hai ngoài tự nhiên Đã xác định (+) Đã xác định (+)
Vật chủ chính
- Ngoài tự nhiên Đã xác định (+) Chưa xác định (-)
- Trong thí nghiệm Đã xác định (+) Đã xác định (+)
Vật chủ chứa trong thí nghiệm Đã xác định (+) Chưa xác định (-)
Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền Đã nghiên cứu (+) Chưa nghiên cứu (-)
Sức sống metacercaria Chưa nghiên cứu (-) Chưa nghiên cứu (-)
Chẩn đoán nhiễm bệnh nhanh ở thực địa Chưa nghiên cứu (-) Chưa nghiên cứu (-)

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết bao gồm 7 điểm: (1) xác định ranh giới phân bố địa lý chéo giữa hai loài tại miền Bắc và miền Trung; (2) định loại vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên bằng hình thái kết hợp phân tử; (3) xác định vật chủ chính ngoài tự nhiên của P. westermani từ mẫu phân thú hoang; (4) xác định vai trò vật chủ chứa của động vật gặm nhấm đối với P. westermani; (5) phân tích đa dạng hình thái metacercaria và quan hệ di truyền phân tử; (6) theo dõi thực nghiệm sức sống của metacercaria trong các điều kiện nhiệt độ và mật độ khác nhau; (7) chuẩn hóa quy trình xét nghiệm cua suối và phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết phân loại học ký sinh trùng tích hợp (integrative taxonomy), kết hợp các chỉ số sai khác hình thái học (morphometrics) với phân tích phát sinh chủng loại phân tử (molecular phylogenetics), dịch tễ học thực địa và miễn dịch học thực nghiệm. Các chỉ thị di truyền được lựa chọn gồm:

  • Đoạn chèn thứ hai của hệ gen nhân (ITS2) dùng để phân định ranh giới giữa các loài sán lá phổi và cercaria.
  • Gen Cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của hệ gen ty thể dùng để đánh giá mức độ đa dạng giữa các quần thể trong loài và định loại ốc nước ngọt.
  • Đoạn gen 16S rDNA ty thể dùng để phân biệt dạng lưỡng bội (diploid) và tam bội (triploid) của loài P. westermani.
  • Vùng D-Loop của hệ gen ty thể để xác định loài vật chủ ăn thịt hoang dã từ mẫu phân.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  1. Phương pháp xét nghiệm cua suối thu metacercaria: So sánh hai phương pháp: phương pháp giã-lọc (nghiền nhuyễn cua, lọc qua lưới kim loại mắt lưới 1 x 1 mm, lắng cặn và gạn dịch) và phương pháp ép giữa hai tấm kính từng bộ phận (mang, gan tụy, cơ thân, cơ chân). Thử nghiệm chuẩn hóa thời gian lắng cặn giữa các lần lọc ở các mốc 3 phút, 2 phút và 1 phút trên cua suối nhân tạo chứa 50 metacercaria nhằm xác định thời gian ngắn nhất thu hồi tối đa 100% ấu trùng. So sánh hiệu quả thu hồi ấu trùng và thời gian thao tác trên 10 cá thể cua thu tại Yên Bái. Định loại cua suối dựa vào cấu tạo giáp đầu ngực, yếm cua và chân giao cấu con đực.

  2. Phương pháp nghiên cứu hình thái: Metacercaria được quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus gắn trắc vi thị kính để đo đường kính nang, chiều dài, chiều rộng, độ dày các lớp vỏ, nhận diện đặc trưng ruột uốn lượn và túi bài tiết chứa hạt glycogen màu đen theo khóa định loại của Doanh et al. Sán trưởng thành thu từ động vật thí nghiệm được ép giữa hai lam kính, cố định bằng cồn ethanol 70%, nhuộm màu carmine và làm tiêu bản cố định; đo kích thước cơ thể, giác miệng, giác bụng, nhánh buồng trứng, tinh hoàn và trứng sán; vẽ sơ đồ hình thái bằng phần mềm Adobe Illustrator.

  3. Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA stool MiniKit (Qiagen, Đức). Khuếch đại các đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide, soi dưới đèn UV và tinh khiết bằng QIAquick PCR purification kit. Đọc trình tự chuỗi nucleotide bằng máy tự động ABI Prism 3130 Genetic Analyser sử dụng hóa chất BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit. Trình tự được căn chỉnh, đối chiếu trên GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI) và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Likelihood với mô hình tiến hóa phù hợp nhất trên phần mềm MEGA 6.

Danh mục các cặp mồi PCR sử dụng trong luận án (trích xuất từ Bảng 2 trong văn bản):

Trình tự đích Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ - 3’) Tài liệu tham khảo
ITS2 3S
A28		 5’-AGCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’
5’-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCGC-3’		 Bowles et al. (1995) [92]
CO1 JB3
JB4.5		 5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’
5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’		 Bowles et al. (1992) [93]
16S T7-1
SP6-1		 5’-ATTTACATCAGTGGGCCGTC-3’
5’-GATCCAAAAGCATGTGAAAC-3’		 Terasaki et al. (1995) [28]
CO1 (ốc) LCO1490
HCO2198		 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
5’-TAAACTTCGGGTGACCAAAAAATYA-3’		 Folmer et al. (1994) [101]
D-Loop (thú) prL
prH		 5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’
5’-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3’		 Nonaka et al. (2009) [31]
  1. Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm xác định vòng đời và vật chủ chứa:
  • Vật chủ chính: Gây nhiễm cho 4 chó nhà và 8 mèo nhà (đã tẩy giun sán trước thí nghiệm) bằng đường tiêu hóa với liều 30–50 metacercaria/con (nhỏ ấu trùng vào phổi lợn cho chó hoặc cá cho mèo). Sau 45 ngày gây nhiễm, định kỳ xét nghiệm phân bằng kỹ thuật lắng cặn tìm trứng sán. Mổ khám động vật sau khi thải trứng 30 ngày để thu thập sán trưởng thành và điều chế kháng nguyên chất tiết.
  • Vật chủ chứa: Gây nhiễm cho 10 chuột nhắt trắng BALB/c/loài với liều 50 metacercaria/chuột qua đường miệng dưới gây mê bằng Diethyl Ether. Sau 1–2 tháng, mổ khám, tiêu cơ và phủ tạng bằng dung dịch nước muối sinh lý kết hợp pepsin 1% để thu sán non. Sán non thu được dùng để đo kích thước và gây nhiễm chuyển tiếp cho mèo nhà nhằm kiểm chứng khả năng phát triển thành sán trưởng thành.
  1. Phương pháp xác định vật chủ ngoài tự nhiên:
  • Ốc nước ngọt: Thu thập tại các dòng suối có tỷ lệ cua nhiễm sán cao. Với loài phổ biến, xét nghiệm trên 1.000 cá thể; với loài ít gặp, thu liên tục trong 5 ngày. Đập vỡ vỏ, ép gan tụy giữa hai tấm kính soi dưới kính hiển vi soi nổi tìm microcercaria có stylet. Đo kích thước cercaria và redia; tách chiết DNA cercaria để giải trình tự ITS2; tách chiết DNA mẫu ốc nhiễm để giải trình tự CO1 định danh loài ốc.
  • Vật chủ chính ngoài tự nhiên: Thu 30 mẫu phân chó nhà tại huyện Hướng Hóa và Đa Krông (Quảng Trị). Thu thập các mẫu phân động vật ăn thịt hoang dã dọc các bờ suối trong rừng tự nhiên tại khu vực có cua nhiễm sán cao. Chia mẫu phân làm hai phần bảo quản trong cồn 100%: một phần lắng cặn thu trứng sán để giải trình tự ITS2; một phần tách chiết DNA tế bào niêm mạc ruột bong tróc trong phân, khuếch đại và giải trình tự đoạn gen ty thể D-Loop để định loại loài thú hoang dã.

  1. Phương pháp nghiên cứu sức sống của metacercaria: Theo dõi metacercaria trong môi trường nước muối sinh lý đẳng trương (NaCl 9‰) ở hai chế độ nhiệt độ: nhiệt độ phòng (25–30°C) và tủ lạnh (4°C), tại 4 mật độ nuôi: 5, 50, 100 và 200 metacercaria/2 ml. Thay dịch định kỳ (hàng ngày với nhiệt độ phòng, hàng tháng với 4°C). Đánh giá sức sống dựa trên tính toàn vẹn cấu trúc và khả năng co bóp cử động trong nang sán.

  2. Phương pháp thiết lập phản ứng dot-ELISA:

  • Kháng nguyên: Sử dụng kháng nguyên chất tiết (excretory-secretory antigen) điều chế từ 10 cá thể sán trưởng thành nuôi trong 10 ml dung dịch đệm PBS ở tủ ấm trong 12 giờ, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút lấy dịch nổi trong, đo nồng độ và bảo quản ở -20°C.
  • Mẫu huyết thanh kiểm định: 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm P. heterotremus (10 mẫu có trứng trong đờm/phân, 20 mẫu không có trứng đã được khẳng định bằng ELISA thông thường với giá trị OD 0,7–1,6). Huyết thanh kiểm tra phản ứng chéo gồm: 8 mẫu sán lá gan lớn (Fasciola sp.), 8 mẫu sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis), 8 mẫu lao phổi và 6 mẫu người khỏe mạnh đối chứng.
  • Giá thể phản ứng: Màng nitrocellulose HAWG 304 FO (Millipore, Nhật Bản) kẻ ô kích thước 3 x 3 mm. Kháng thể thứ cấp liên kết enzyme: Peroxidase-labeled goat-anti-human IgG (DAKO). Hóa chất hiện màu: 4-chloro-1-naphthol kết hợp 30% H2O2. Khóa màng bằng casein 1%.
  • Khảo sát các điều kiện kỹ thuật: Thử nghiệm 3 nồng độ kháng nguyên (1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml); thời gian ủ huyết thanh và kháng thể thứ cấp (10, 20, 30 phút); thời gian hiện màu (1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 phút); và dải nhiệt độ phản ứng tương ứng các mùa: 37°C, 20°C, 10°C và 4°C.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học về hình thái học, phân loại học, vòng đời sinh học, đặc điểm bệnh học lâm sàng, dịch tễ học và các kỹ thuật chẩn đoán bệnh sán lá phổi trên thế giới và tại Việt Nam. Tác giả nhấn mạnh sự phức tạp trong phân loại học giống Paragonimus, sự hình thành khái niệm "loài phức" (complex species) do biến dị địa lý lớn về hình thái metacercaria và đặc tính phân tử. Nội dung chương chứng minh sự tồn tại của 3 loài gây bệnh chính ở châu Á (P. heterotremus, P. westermani, P. skrjabini), chỉ ra rằng nhận thức lâm sàng trước đây quy kết mọi ca bệnh sán lá phổi ở người tại Việt Nam cho P. westermani là chưa chuẩn xác, đồng thời phân tích cơ sở miễn dịch học và sinh học phân tử phục vụ việc xây dựng công cụ chẩn đoán thực địa.

Chương 2: Đối tượng, địa điểm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa điểm thu mẫu thực địa tại 6 xã thuộc 3 tỉnh Lào Cai, Yên Bái và Quảng Trị; thiết kế quy trình thực nghiệm đồng bộ kết hợp hình thái học, sinh học phân tử, gây nhiễm động vật và thử nghiệm phản ứng miễn dịch dot-ELISA. Chương này trình bày chi tiết các thông số kỹ thuật, bao gồm nồng độ hóa chất, chủng động vật thí nghiệm, các cặp mồi khuếch đại gen và các công thức toán học dùng để tính toán tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm, độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương tính và giá trị tiên đoán âm tính của phản ứng chẩn đoán.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Nội dung kết quả nghiên cứu và thảo luận của luận án được cấu trúc thành 4 phần chính:

1. Phương pháp xét nghiệm cua và điều tra tình hình nhiễm metacercaria ở cua suối

  • Chuẩn hóa thời gian lắng cặn và phương pháp xét nghiệm: Thực nghiệm xác định thời gian lắng cặn trong phương pháp giã-lọc cho thấy ở thời gian lắng 1 và 2 phút, tỷ lệ thu hồi đạt đủ 50/50 metacercaria (100%), trong khi nước dịch gạn nhanh chóng đạt độ trong để soi kính. Ngược lại, để lắng 5–15 phút khiến các cặn nhỏ lắng xuống đáy làm đục dịch quan sát. So sánh giữa hai phương pháp trên 10 cá thể cua cho thấy phương pháp giã-lọc rút ngắn đáng kể thời gian thao tác và thu hồi được số lượng metacercaria cao hơn phương pháp ép kính (đặc biệt là ấu trùng khu trú sâu trong các thớ cơ thân và cơ chân cua).
  • Thành phần loài cua và tình hình nhiễm ấu trùng: Xác định các loài cua suối bắt gặp tại các điểm nghiên cứu thuộc giống Potamiscus và các giống cua suối họ Potamidae. Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria tại các điểm nghiên cứu được thống kê chi tiết theo từng loài sán lá phổi. Đáng chú ý, phát hiện metacercaria P. westermani ở cua suối tại Yên Bái (khẳng định loài này phân bố ở miền Bắc) và phát hiện metacercaria P. heterotremus tại Quảng Trị (khẳng định loài này phân bố ở miền Trung).

2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử của sán lá phổi

  • Đa dạng hình thái: Mô tả kích thước, hình dạng, độ dày thành vỏ của các dạng metacercaria thu được. Nang sán P. heterotremus có kích thước nhỏ (đường kính dao động 200–300 µm), dạng hình tròn hoặc oval, giác miệng lớn hơn giác bụng. Metacercaria P. westermani có kích thước lớn hơn, dạng hình cầu với lớp vỏ ngoài dày đặc trưng, ghi nhận nhiều biến dị kích thước giữa các cá thể thu thập tại Yên Bái và Quảng Trị.
  • Phát sinh chủng loại phân tử: Phân tích trình tự đoạn chèn ITS2 và gen CO1 của P. heterotremus cho thấy sự tương đồng cao với các chủng tại Thái Lan, Lào và Trung Quốc. Đối với P. westermani, phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA ty thể đã xác định được các sai khác nucleotide đặc trưng, làm rõ sự hiện diện của các cá thể thuộc dạng lưỡng bội (diploid) tại khu vực nghiên cứu. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood trên phần mềm MEGA 6 phản ánh rõ mối quan hệ phát sinh giữa các quần thể địa lý.

3. Một số đặc điểm sinh học của sán lá phổi P. heterotremus và P. westermani

  • Xác định vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên: Qua xét nghiệm hàng nghìn cá thể ốc suối tại các điểm nghiên cứu, phát hiện ấu trùng microcercaria có stylet ở đầu và đuôi ngắn trong gan tụy ốc họ Pomatiopsidae. Phân tích phân tử trình tự ITS2 của cercaria cho thấy độ tương đồng 100% với trình tự của sán lá phổi tương ứng. Phân tích đoạn gen CO1 của vật chủ ốc xác định được các loài ốc thuộc phân họ Triculinae (gồm Gammatricula sp. và các loài ốc nhỏ tương đồng cao với chi Tricula, cùng loài S. quangtriensis tại Quảng Trị). Tỷ lệ nhiễm tự nhiên ở ốc rất thấp (dưới 1%).
  • Xác định vật chủ chính ngoài tự nhiên của P. westermani: Trong 30 mẫu phân chó xét nghiệm tại Quảng Trị, không phát hiện thấy mẫu nào dương tính. Ngược lại, xét nghiệm các mẫu phân động vật hoang dã thu dọc bờ suối rừng Quảng Trị phát hiện trứng sán lá phổi có nắp. Khuếch đại và đọc trình tự ITS2 từ trứng sán xác định chính xác là loài P. westermani. Đồng thời, tách chiết DNA từ mẫu phân đó và khuếch đại đoạn gen ty thể D-Loop bằng cặp mồi prL/prH, giải trình tự nucleotide cho kết quả tương đồng cao với loài mèo rừng (Prionailurus bengalensis). Đây là bằng chứng phân tử khẳng định mèo rừng là vật chủ chính tự nhiên của P. westermani tại khu vực miền Trung.
  • Sự phát triển ở vật chủ chứa và vật chủ chính: Thực nghiệm gây nhiễm chuột BALB/c chứng minh sau 1 tháng ấu trùng metacercaria P. westermani thoát nang, di chuyển vào định vị dưới dạng sán non ở cơ và gan, không phát triển thành sán trưởng thành. Khi sử dụng sán non này gây nhiễm chuyển tiếp cho mèo nhà, sán tiếp tục phát triển hoàn chỉnh, tạo nang áp xe ở phổi và thải trứng ra ngoài sau 120–180 ngày.
  • Sức sống của metacercaria: Metacercaria nuôi trong nước cất bị thoát nang nhanh do hiện tượng nhược trương. Trong môi trường nước muối sinh lý 9‰, ấu trùng duy trì sức sống ổn định. Ở nhiệt độ phòng (25–30°C), metacercaria sống được từ vài ngày đến dưới 2 tuần tùy mật độ. Ở nhiệt độ 4°C, ấu trùng có thể duy trì sức sống kéo dài hàng tháng; tuy nhiên ở mật độ cao (200 metacercaria/2 ml), hiện tượng tự thoát nang xảy ra sau 2 tháng bảo quản.

4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi

  • Độ nhạy và độ đặc hiệu: Phản ứng dot-ELISA sử dụng kháng nguyên chất tiết từ sán trưởng thành cho kết quả dương tính rõ rệt với 30/30 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm sán lá phổi (đạt độ nhạy 100%). Phản ứng hoàn toàn âm tính với các mẫu huyết thanh nhiễm sán lá gan lớn (Fasciola), sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis), lao phổi và người khỏe mạnh đối chứng (đạt độ đặc hiệu 100%).
  • Tối ưu hóa nồng độ và thời gian phản ứng: Xác định nồng độ kháng nguyên thích hợp là 0,5–1 mg/ml. Ở nhiệt độ 37°C, thời gian ủ huyết thanh và kháng thể thứ cấp tối ưu là 20–30 phút, thời gian hiện màu đạt độ rõ nét từ 3–5 phút. Khảo sát tại các mức nhiệt độ thấp hơn (20°C, 10°C và 4°C) cho thấy phản ứng vẫn diễn ra ổn định nhưng đòi hỏi kéo dài thời gian ủ và thời gian hiện màu tương ứng với mức giảm nhiệt độ môi trường, cung cấp quy chuẩn thực hiện xét nghiệm phù hợp với các mùa trong năm tại miền núi.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự nêu các đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và thực tiễn (đối chiếu trang 97 văn bản):

  1. Về phương pháp luận và kỹ thuật xét nghiệm:
  • Luận án đã chuẩn hóa thời gian lắng cặn tối ưu của phương pháp giã-lọc cua suối là 1–2 phút giữa các lần lọc, khắc phục nhược điểm lắng cặn quá lâu của các quy trình trước đó.
  • Chứng minh thực nghiệm phương pháp giã-lọc có hiệu quả thu hồi metacercaria cao hơn và tiết kiệm thời gian hơn so với phương pháp ép kính truyền thống, cung cấp quy trình chuẩn cho các nghiên cứu dịch tễ học thực địa.
  1. Về phân bố địa lý và cấu trúc di truyền:
  • Lần đầu tiên phát hiện và khẳng định sự phân bố của loài Paragonimus westermani tại Yên Bái (khu vực miền Bắc) và loài Paragonimus heterotremus tại Quảng Trị (khu vực miền Trung), làm thay đổi quan điểm trước đây cho rằng hai loài này có vùng phân bố địa lý cách biệt hoàn toàn.
  • Xác định đặc điểm biến dị hình thái và cung cấp dữ liệu trình tự nucleotide các gen chỉ thị (ITS2, CO1, 16S rDNA) của các quần thể sán lá phổi tại Việt Nam; xác định vị trí nucleotide sai khác trên gen 16S rDNA chứng minh sự hiện diện của dạng lưỡng bội (diploid) của loài P. westermani.
  1. Về đặc điểm sinh học và vòng đời:
  • Lần đầu tiên tại Việt Nam phát hiện và xác định được vật chủ trung gian thứ nhất ngoài tự nhiên của sán lá phổi là các loài ốc nước ngọt thuộc phân họ Triculinae (họ Pomatiopsidae) thông qua phân tích kết hợp hình thái cercaria và sinh học phân tử (ITS2 của ấu trùng và CO1 của vật chủ ốc).
  • Lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp phân tích DNA từ mẫu phân động vật hoang dã (kết hợp khuếch đại gen ITS2 của trứng sán và vùng D-Loop ty thể của vật chủ), qua đó xác định mèo rừng (Prionailurus bengalensis) là vật chủ chính tự nhiên của P. westermani tại miền Trung mà không cần mổ khám động vật hoang dã.
  • Chứng minh thực nghiệm vai trò vật chủ chứa của chuột nhắt trắng đối với loài P. westermani và khả năng truyền tiếp gây nhiễm thành công sang mèo nhà.
  • Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về giới hạn sức sống của metacercaria trong môi trường nước muối sinh lý ở các điều kiện nhiệt độ (nhiệt độ phòng và 4°C) và mật độ nuôi cấy khác nhau.
  1. Về chẩn đoán miễn dịch học thực địa:
  • Thiết lập thành công quy trình kỹ thuật dot-ELISA sử dụng kháng nguyên chất tiết để chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi với độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 100%, không xảy ra phản ứng chéo với sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ hay vi khuẩn lao.
  • Xác lập bảng thông số kỹ thuật tối ưu về nồng độ kháng nguyên, thời gian ủ và thời gian hiện màu ở các dải nhiệt độ thực địa (37°C, 20°C, 10°C, 4°C), tạo cơ sở ứng dụng xét nghiệm đọc kết quả bằng mắt thường mà không phụ thuộc vào máy đọc quang phổ kế.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất của luận án:

  • Triển khai ứng dụng quy trình dot-ELISA tại các trạm y tế xã, trung tâm y tế huyện miền núi thuộc vùng dịch tễ để sàng lọc nhanh người nghi nhiễm sán lá phổi, hỗ trợ phân biệt với lao phổi.
  • Đẩy mạnh truyền thông giáo dục sức khỏe cộng đồng tại các địa phương vùng cao nhằm loại bỏ tập quán ăn cua suối sống, cua nướng chưa chín, ăn gỏi tôm hoặc tiêu thụ thịt động vật hoang dã chưa qua nấu chín.
  • Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích DNA từ phân để tiếp tục điều tra, giám sát ổ bệnh sán lá phổi trên các loài thú hoang dã tại các khu bảo tồn và vườn quốc gia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên các dữ kiện được tác giả trình bày trong văn bản:

  • Về nguồn mẫu huyết thanh chẩn đoán: Nghiên cứu mới chỉ đánh giá phản ứng dot-ELISA trên huyết thanh bệnh nhân nhiễm P. heterotremus. Do tại thời điểm nghiên cứu chưa ghi nhận được ca bệnh người nhiễm P. westermani tại Việt Nam, luận án chưa có mẫu huyết thanh bệnh nhân P. westermani để kiểm tra phản ứng miễn dịch chéo giữa hai loài sán lá phổi này.
  • Về định danh vật chủ ốc: Do tỷ lệ nhiễm tự nhiên ở vật chủ trung gian thứ nhất rất thấp (dưới 1%), số lượng cá thể ốc nhiễm thu thập được còn ít. Một số chủng ốc họ Pomatiopsidae mới chỉ được giám định đến cấp phân họ hoặc chi (Triculinae gen sp.1, Triculinae gen sp.2, Gammatricula sp.) dựa trên cây phát sinh chủng loại CO1 mà chưa thể định danh chính xác đến tên loài cụ thể do cơ sở dữ liệu phân tử ốc nước ngọt bản địa còn thiếu hụt.
  • Về phạm vi điều tra: Địa bàn khảo sát thực địa tập trung tại 6 xã thuộc 3 tỉnh (Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị). Cần mở rộng điều tra dịch tễ tại các tỉnh miền Trung khác và khu vực Tây Nguyên nhằm xác định đầy đủ bản đồ phân bố của hai loài sán lá phổi này trên phạm vi cả nước.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Ký sinh trùng học, Động vật học không xương sống, Sinh học tiến hóa: Phần tổng quan tài liệu, khóa phân loại hình thái và hệ thống cặp mồi phân tử (ITS2, CO1, 16S rDNA, D-Loop) cùng sơ đồ thiết kế thí nghiệm vòng đời cung cấp phương pháp luận mẫu mực trong nghiên cứu ký sinh trùng truyền qua thực phẩm.
  • Bác sĩ chuyên khoa truyền nhiễm, lao và bệnh phổi tại các bệnh viện: Nội dung chẩn đoán phân biệt lâm sàng, cận lâm sàng và hình ảnh học giữa bệnh sán lá phổi và bệnh lao phổi, u phổi giúp tránh chẩn đoán nhầm lẫn trong thực hành lâm sàng.
  • Cán bộ y tế dự phòng và chuyên viên kiểm soát dịch bệnh tuyến cơ sở: Quy trình chuẩn hóa xét nghiệm cua suối bằng phương pháp giã-lọc và kỹ thuật dot-ELISA trên giấy nitrocellulose là những công cụ kỹ thuật có tính ứng dụng trực tiếp tại thực địa mà không đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao bệnh sán lá phổi ở người thường bị chẩn đoán nhầm với bệnh lao phổi trên lâm sàng? Trong cơ thể người, sán lá phổi trưởng thành ký sinh thành từng đôi trong nhu mô phổi, kích thích hình thành các ổ áp xe kích thước 1–4 cm tương tự các hang lao. Bệnh nhân có biểu hiện ho kéo dài, đau ngực, khó thở và khạc đờm đặc lẫn máu màu rỉ sắt. Khi chụp X-quang hoặc cắt lớp vi tính vùng ngực, hình ảnh các tổn thương dạng nang, nốt mờ đục và tràn dịch màng phổi rất giống với tổn thương do vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis). Nếu chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng mà không xét nghiệm tìm trứng sán trong đờm/phân hoặc không làm xét nghiệm huyết thanh miễn dịch đặc hiệu, thầy thuốc rất dễ chẩn đoán nhầm thành lao phổi.

2. Điểm cải tiến cốt lõi của phương pháp giã-lọc cua suối trong luận án so với các công bố trước đây là gì? Các công bố trước đây (như Sohn et al., 2009) chỉ định thời gian lắng cặn kéo dài tới 15 phút hoặc chỉ dẫn chung chung vài phút, dẫn đến việc các hạt cặn mịn lắng xuống đáy làm đục dịch lọc, gây khó khăn cho việc phát hiện ấu trùng dưới kính hiển vi soi nổi. Thực nghiệm của luận án chứng minh rằng rút ngắn thời gian để lắng xuống còn 1–2 phút là tối ưu: thời gian này vừa đủ để toàn bộ metacercaria (vốn có tỷ trọng lớn) lắng xuống đáy cốc, đồng thời cho phép gạn bỏ dịch cặn lơ lửng, giúp dịch soi đạt độ trong suốt nhanh chóng mà không làm thất thoát ấu trùng (thu hồi đủ 100% số lượng metacercaria thử nghiệm).

3. Làm thế nào tác giả xác định được mèo rừng là vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi mà không cần bắt hoặc mổ khám động vật? Tác giả áp dụng phương pháp sinh học phân tử không xâm lấn (non-invasive molecular method) trên các mẫu phân thú ăn thịt hoang dã thu thập dọc bờ suối trong rừng tự nhiên tại Quảng Trị. Mẫu phân được chia làm hai phần: một phần lọc lắng thu trứng sán có nắp và giải trình tự gen nhân ITS2 để định danh chính xác loài sán (P. westermani); phần còn lại tách chiết DNA từ các tế bào niêm mạc ruột của con thú bị bong tróc theo phân, sau đó dùng cặp mồi prL/prH để khuếch đại và đọc trình tự vùng D-Loop của hệ gen ty thể. So sánh trình tự D-Loop trên GenBank cho kết quả tương đồng cao với loài mèo rừng (Prionailurus bengalensis).

4. Kỹ thuật dot-ELISA được thiết lập trong luận án có những ưu thế gì khi triển khai tại các trạm y tế vùng cao? Kỹ thuật dot-ELISA sử dụng giá thể là màng nitrocellulose đã được gắn sẵn kháng nguyên chất tiết của sán lá phổi và bảo quản khô ở 4°C. Phản ứng cho phép quan sát và đánh giá kết quả trực tiếp bằng mắt thường thông qua phản ứng tạo màu của cơ chất 4-chloro-1-naphthol (vết chấm màu nâu sẫm so với đối chứng dương), hoàn toàn không cần đến máy đọc quang phổ kế (ELISA plate reader) hay nguồn điện ổn định. Hơn nữa, luận án đã chuẩn hóa thời gian phản ứng ở các dải nhiệt độ thấp (20°C, 10°C, 4°C), giúp cán bộ y tế thực địa có thể thực hiện xét nghiệm chính xác vào mùa đông tại các tỉnh miền núi phía Bắc.

5. Căn cứ vào chỉ thị di truyền nào để luận án khẳng định các mẫu P. westermani thu được thuộc dạng lưỡng bội (diploid)? Luận án sử dụng cặp mồi T7-1 và SP6-1 để khuếch đại và phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA ty thể. Theo các nghiên cứu phân tử quốc tế đã công bố (Bowles et al., 1995; Terasaki et al., 1995), dạng lưỡng bội (diploid 2n) và tam bội (triploid 3n) của loài P. westermani sai khác nhau cố định ở 2 vị trí nucleotide trên đoạn gen này. Kết quả gióng hàng chuỗi nucleotide của các mẫu thu thập tại Việt Nam cho thấy chúng mang các nucleotide đặc trưng của dạng lưỡng bội.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lưu Anh Tú đã giải quyết một cách có hệ thống các khoảng trống khoa học về phân bố địa lý, đa dạng hình thái, cấu trúc di truyền và chu trình sinh học của hai loài sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani tại Việt Nam. Nghiên cứu đã chứng minh sự hiện diện đồng thời của cả hai loài tại miền Bắc và miền Trung, lần đầu tiên xác định được vật chủ trung gian thứ nhất (ốc họ Pomatiopsidae) và vật chủ chính tự nhiên (mèo rừng Prionailurus bengalensis) bằng các bằng chứng sinh học phân tử tin cậy. Đồng thời, việc chuẩn hóa quy trình xét nghiệm cua suối và thiết lập thành công phản ứng dot-ELISA với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% đã cung cấp những công cụ kỹ thuật có giá trị thực tiễn cao phục vụ công tác giám sát dịch tễ và chẩn đoán nhanh bệnh sán lá phổi tại y tế cơ sở.