MỞ ĐẦU Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus, ký sinh ở phổi người và động vật, gây nên bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người và động vật. Nguyên nhân nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng cảm nhiễm metacercaria từ vật chủ trung gian thứ hai (chủ yếu là cua suối) hoặc sán non từ vật chủ chứa [1]. Người bị nhiễm sán lá phổi có biểu hiện gầy yếu, khó thở, ho từng cơn, khạc ra đờm có máu màu gỉ sắt, dễ bị chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh khác ở phổi, gây khó khăn cho công tác chẩn đoán và trị bệnh [1, 2]. Hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô tả [1], trong số đó có 7 loài gây bệnh cho người: bao gồm 2 loài gây bệnh ở châu Mỹ, 2 loài ở châu Phi và 3 loài ở châu Á [1, 2].
Tại châu Á, loài P. heterotremus gây bệnh cho người ở khu vực Nam Á (Ấn Độ và Sri Lanka), Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Việt Nam) và 3 tỉnh phía Nam Trung Quốc; loài P. westermani gây bệnh ở các nước Bắc Á (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan) và Philippines; ngoài ra loài P. skrjabini gây bệnh cho người tại Nhật Bản và Trung Quốc [1].
Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong hơn 20 năm qua ở các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ [3-24]. Cho đến nay, 7 loài SLP đã được phát hiện, bao gồm P. Trong số đó gồm cả 3 loài có khả năng gây bệnh cho người tại châu Á là P. Tuy nhiên, loài P.
skrjabini hiếm gặp, mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa với tỷ lệ nhiễm thấp; loài P. heterotremus phân bố phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và loài P. westermani phổ biến ở các tỉnh Bắc Trung Bộ với tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua suối rất cao [22]. Vì vậy, hai loài P.
westermani cần được quan tâm nghiên cứu. heterotremus đã được nghiên cứu về dịch tễ, bệnh học và vòng đời phát triển [3-14], loài P. westermani mới chỉ dừng ở mức độ phát hiện metacercaria ở cua suối tại Bắc Trung Bộ (19). Nhiều vấn đề về hai loài SLP này chưa được nghiên cứu: loài P.
heterotremus có phân bố ở miền Trung và P. westermani có phân bố ở miền Bắc hay không? Tính đa dạng về hình thái metacercaria, đa dạng di truyền phân tử và đặc điểm 2 sinh học (như sức sống của metacercaria, vật chủ tự nhiên, vai trò vật chủ chứa trong vòng đời phát triển…). Hơn nữa, các ca bệnh SLP vẫn được phát hiện [20]. Bệnh SLP chủ yếu xuất hiện ở các tỉnh miền núi, vì vậy việc nghiên cứu kỹ thuật chẩn đoán nhanh bệnh SLP tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng là cần thiết.
Từ các cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học và chẩn đoán miễn dịch”. Mục tiêu chung của đề tài: Hiểu biết về hai loài SLP P. westermani, cung cấp cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán và phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Mục tiêu cụ thể: 1.
Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị. Xác định được sự đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai loài P. Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài P. Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Nội dung nghiên cứu: Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu phương pháp xét nghiệm cua suối để thu metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị. Nghiên cứu tính đa dạng hình thái metacercaria và đa dạng di truyền phân tử của hai loài SLP P. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học hai loài P.
westermani, gồm: - Xác định vật chủ trung gian thứ nhất và vật chủ chính ngoài tự nhiên. - Xác định sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chính và vai trò vật chủ chứa trong vòng đời phát triển của P. - Nghiên cứu sức sống của metacercaria. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP.
- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP. - Xác định nồng độ kháng nguyên của phản ứng. - Xác định thời gian phản ứng ở các điều kiện nhiệt độ 37oC, 20oC, 10oC và 4oC, tương ứng với nhiệt độ các mùa trong năm ở miền Bắc. Khái quát chung về sán lá phổi 1.
Lịch sử phát hiện, hình thái, cấu tạo và phân loại sán lá phổi Trường hợp nhiễm SLP của động vật có vú đầu tiên trên thế giới được phát hiện bởi Diesing từ một con rái cá (Pteronura brasiliensis) ở Brazin năm 1828. Hai mươi năm sau, ông đã đặt tên cho loài ký sinh là Distomum rude. Năm 1878, Ker ert mô tả một loài SLP từ phổi của con hổ đã chết tại vườn bách thú Amsterdam với tên là Distoma westermani. Năm 1899, Braun đã thành lập giống Paragonimus gồm các loài ký sinh ở phổi, với loài chuẩn là P.
Giống sán lá phổi an đầu được đặt trong họ Fasciolidae, sau đó được chuyển sang họ Troglotrematidae. Năm 1939, Dollfus thành lập họ Paragonimidae chỉ gồm một giống Paragonimus [1]. Phân loại truyền thống của các loài SLP dựa vào đặc điểm hình thái của sán trưởng thành và metacercaria (giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ hai), nhưng ít khi dựa vào trứng và cercaria (giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ nhất). Sá trưởng thành SLP trưởng thành có hình hạt cà phê (hình 1.
Cơ thể dài 7-15 mm, rộng 3-8 mm và dày 3-5 mm. Các đặc điểm hình thái quan trọng được sử dụng trong phân loại SLP bao gồm: hình dạng cơ thể, tỷ lệ chiều dài/rộng cơ thể, kích thước và tỷ lệ của giác miệng/giác bụng, mức độ phân nhánh của tinh hoàn và buồng trứng, gai cơ thể [25]. Hình dạng chung của sán lá phổi Paragonimus [25] 5 Tỷ lệ chiều dài/rộng cơ thể khác nhau giữa các loài SLP. Một số loài (như P.
amazonicus) có dạng thon dài, các loài khác có chiều rộng gần b ng chiều dài cơ thể. Kích thước của giác miệng và giác bụng, cũng như tỷ lệ của chúng đã được sử dụng để phân biệt các loài SLP. heterotremus có giác miệng lớn gấp đôi giác bụng, nhưng ở những loài khác kích thước giác miệng và giác bụng gần như ng nhau, trong khi loài P. proliferus có giác bụng hơi lớn hơn giác miệng.
Buồng trứng và tinh hoàn của P. westermani điển hình có 5-6 thùy, trong khi các loài khác phân chia thành nhiều nhánh. Tinh hoàn có kích thước lớn ở P. macrorchis, nhưng tương đối nhỏ ở P.
Ở hầu hết các loài SLP, gai trên bề mặt cơ thể xếp đơn lẻ, nhưng một số loài (như P. siamensis) có gai xếp thành nhóm [25]. Metacercaria Metacercaria là giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở vật chủ trung gian thứ hai. Đặc điểm đặc trưng của metacercaria SLP là ruột uốn lượn và túi bài tiết lớn chứa đầy hạt glycogen (hình 1.
Các đặc điểm hình dạng, kích thước metacercaria và độ dày lớp vỏ được sử dụng để phân biệt giữa các loài [1, 25]. Metacercaria của hầu hết các loài đều có một hoặc hai lớp vỏ có độ dày khác nhau, nhưng số ít loài như P. proliferus không có vỏ nang. westermani có nhiều lớp vỏ hơn các loài khác.
Hình dạng chung của metacercaria sán lá phổi Paragonimus [25] 6 Về kích thước, metacercaria của SLP được chia thành 3 nhóm: nhóm có kích thước lớn (như P. harinasutai…), nhóm có kích thước trung bình (P. bangkokensis…) và nhóm có kích thước nhỏ (P. Tuy nhiên, hình thái và kích thước metacercaria của cùng một loài SLP dao động đáng kể, điển hình là sự đa dạng của loài P.
Trái lại, metacercaria của một số loài SLP lại giống nhau về hình dạng và kích thước; ví dụ sự giống nhau giữa metacercaria của loài P. harinasutai; giữa loài P. skrjabini đã được ghi nhận [22]. Trong những trường hợp này, các đặc điểm hình thái của metacercaria thoát khỏi nang có ích trong việc phân biệt giữa các loài SLP [1, 22, 25].
Cercaria Cercaria là giai đoạn ấu trùng ở vật chủ trung gian thứ nhất. Cercaria của các loài SLP thuộc nhóm Microcercaria, với đặc trưng có stylet ở phần đầu và đuôi ngắn (hình 1. Cercaria của các loài trong giống SLP rất giống nhau về hình thái và kích thước, nên khó có thể phân biệt chúng ở cấp độ loài. Hiện nay chưa có nhiều số liệu về ấu trùng cercaria của các loài SLP [1].
Hình dạng chung cercaria của sán lá phổi Paragonimus [25] 7 1. Trứng Trứng SLP có hình dạng không đối xứng, một đầu to và một đầu nhỏ, đầu to có nắp (hình 1. Mặc dù có sự khác nhau về kích thước trứng giữa các loài, nhưng rất khó để phân biệt trứng giữa các loài SLP b ng hình thái [1, 25]. Hiện nay, trứng SLP được định loại đến loài b ng kỹ thuật phân tử [22].
Hình dạng trứng sán lá phổi Paragonimus [25] 1. Phân loại sán lá phổi Đến nay hơn 50 loài sán lá phổi thuộc giống Paragonimus đã được mô tả, phần lớn các loài phân bố ở châu Á [1]. Phân loại truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái sán của trưởng thành và metacercaria. Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái để phân biệt các loài SLP tương đối ít so với số lượng lớn loài trong giống Paragonimus, vì vậy đôi khi gặp khó khăn trong việc phân biệt giữa những loài có quan hệ gần [26].
Sự ra đời của phân loại phân tử đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu ở mức độ phân tử của giống Paragonimus. Các trình tự Deoxyribonucleic acid (DNA) của hệ gen nhân (bao gồm các gen và các đoạn chèn) và hệ gen ty thể từ lâu đã được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ phân tử và phân loại giun sán. Đối với sán lá phổi, trình tự đoạn chèn thứ hai the second internal transcribed spacer (ITS2) của hệ gen nhân là chỉ thị tốt để phân biệt giữa các loài và trình tự gen Cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của hệ gen ty thể là chỉ thị hữu ích để nghiên cứu các quần thể trong loài [27]. Hiện nay có hàng trăm trình tự CO1 và ITS2 của các loài SLP trên GenBank và một số ít trình tự NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) và 28S [29].