MỞ ĐẦU Trong số các loại rong biển đƣợc nghiên cứu để phát triển thành các dạng phân bón, rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc đặc biệt quan tâm vì thành phần dinh dƣỡng vƣợt trội cùng mức tăng trƣởng, khả năng đáp ứng tốt của cây trồng. Hàng loạt các công bố trên thế giới đã khẳng định khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng, khả năng chống chịu bệnh và năng suất tăng cao khi sử dụng phân bón từ rong sụn so với các loại rong khác và so với đối chứng không sử dụng phân bón rong biển. Carrageenan đƣợc chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii là thành phần chủ yếu của thành tế bào rong, chiếm khoảng 40% trọng lƣợng khô, chúng bao gồm galactose sulfate và trong một số trƣờng hợp còn có cả anhydrogalactose. Carrageenan đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm với các tính chất nhƣ tạo gel, làm dày, ổn định.
Carrageenan biến tính (trọng lƣợng phân tử thấp hay ở dạng oligo) từ rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong mỹ phẩm, dƣợc phẩm và phân bón. Oligo carrageenan với vai trò là phân bón sinh học không chỉ bởi tác dụng của nó nhƣ một chất kích thích sinh trƣởng tự nhiên mà còn có khả năng tăng sức đề kháng cho cây trồng chống lại sâu bệnh, sự thay đổi của thời tiết. Cũng nhƣ một số polysacchride khác, carrageenan có thể thủy phân hay cắt mạch thành oligo bằng phƣơng pháp vật lý (chiếu xạ, dùng sóng siêu âm), phƣơng pháp hóa học (tác nhân axit, bazơ, tác nhân oxy hóa.) hay phƣơng pháp sinh học (enzyme) với những ƣu/nhƣợc điểm riêng. Một trong những hạn chế của phƣơng pháp hóa học là thƣờng tạo ra các sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân.
Tuy nhiên, thủy phân bằng axit lại có một số lợi thế về tốc độ phản ứng nhanh, giá thành rẻ và nguồn hóa chất dễ có hơn. Với mục tiêu xây dựng quy trình thủy phân phù hợp nhằm sử dụng rong sụn làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp, phƣơng pháp thủy phân bằng axit đƣợc xem là phƣơng pháp thích hợp để thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii. 12 Các oligosaccharide của carrageenan điều chế bằng việc thủy phân axit hoặc bẽ gãy mạch bằng enzyme là các chất sinh học kích thích sinh trƣởng, thụ tinh, các chất này có khả năng kích thích cho sự tích lũy dinh dƣỡng và tái tạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa và tạo quả tốt hơn. Các oligosaccharide sulphat đã đƣợc công nhận để kích thích cho cơ chế bảo vệ cây, do đó oligocarrageenan có thể sử dụng nhƣ một chất tăng trƣởng tự nhiên.
Đặc trƣng chất lƣợng của dịch sau thủy phân phụ thuộc nhiều vào các điều kiện thủy phân nhƣ nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian. Do đó, “Xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit” đƣợc chọn là đề tài luận văn nhằm đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích sử dụng sản phẩm từ rong sụn làm chất kích thích sinh trƣởng cho cây trồng. Mục tiêu của luận văn Xác định hiệu suất chiết, trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc của oligo carrageenan thu đƣợc bằng phƣơng pháp thủy phân rong sụn trong axit vô cơ (axit sulfuric) và axit hữu cơ (axit ascorbic) ở các điều kiện khác nhau (nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian), từ đó đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp. Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: - Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau.
- Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân với hiệu suất thủy phân tối ƣu. - Phân tích trọng lƣợng phân tử trung bình và đặc trƣng cấu trúc của dịch oligo carrageenan thu đƣợc sau quá trình thủy phân. - Thử nghiệm hiệu quả kích thích sinh trƣởng của dịch chiết oligo carrageenan trên cây ngô. Giới thiệu về rong sụn Rong sụn thuộc ngành Tảo hồng (Rhodophyta), phân lớp: Rhodophyceae, bộ: Gigartinales, họ: Solieriaceae, giống: Kappaphycus, loài: alvarezii, trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loài có sản lƣợng lớn nhất [1].
Macxxell Doty là ngƣời đầu tiên tìm thấy rong sụn ở vùng biển Philippines vào năm 1972. Ngƣời có công thu mẫu cùng với ông là Alvarezii, do vậy Macxxell Doty đã đặt tên rong này là Euchuma alvarezii Doty. Khi phân tích thành phần hóa học của rong này ông đã đổi tên Echuma alvarezii Doty thành Kappaphycus alvarezii. Sau đó ông cùng với các nhà nghiên cứu tại trƣờng đại học Hawaii bắt đầu nghiên cứu phát triển phƣơng pháp nuôi trồng rong sụn ở Hawaii.
Từ đó, rong sụn đƣợc nuôi trồng và phát triển rộng rãi ở nhiều nƣớc nhƣ Indonesia, Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam … Rong sụn đƣợc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang di nhập từ Philipines về Việt Nam vào tháng 3 năm 1993, và đƣợc nhân giống nghiên cứu các đặc tính sinh học, giải pháp kỹ thuật và mô hình trồng rong Sụn ở các loại thủy vực khác nhau của nƣớc ta. Thành phần hóa học của rong sụn Bảng 1. Thành phần hóa học của rong sụn [2] Tên thành phần hóa học % (khối lƣợng) Protein 2,4 Cellulose 4,0 Ẩm 19,4 Tro tổng 20,0 Carrageenan 40,0 Thành phần khác 14,2 14 Khi ở dạng tƣơi, rong sụn thƣờng có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll. Đây là loài đơn trụ bao gồm 2 phần: Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn.
Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thƣớc lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dƣỡng (car). Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố. Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lƣợng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong. Thành phần hóa học chính của rong sụn là carrageenan có thể chiếm đến 40% trọng lƣợng khô.
Trong đó, carrageenan tan chiếm khoảng 33%, carrageenan không tan chiếm 7%. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 1. Giới thiệu chung về carrageenan Carrageenan là một loại colloid thuộc nhóm phycocolloid cùng với agar và alginat. Carrageenan đƣợc chiết xuất từ rong biển đỏ có cấu trúc là một polysaccharite.
Carrageenan đã đƣợc biết đến từ rất lâu đời ở các nƣớc phƣơng Tây. Vào những năm 1842-1862, các nhà khoa học đã phát hiện ra carrageenan có trong một loài tảo đỏ có tên là Chondrus cripus và loài Irish moss thuộc họ Rhodophyceae, nhƣng những khám phá của họ còn thô sơ, chƣa xác định đƣợc những tính chất cũng nhƣ đặc điểm của nó. Mãi đến những năm khi chiến tranh thế giới thứ nhất bùng nổ, khi mà nhu cầu chiết xuất gelatin để phục vụ quân đội trở nên cấp thiết đòi hỏi cần phải có chất thay thế, rất nhiều các nghiên cứu đã đƣợc tiến hành và cuối cùng carrageenan đã đƣợc tìm ra [3]. Tên Carrageenan hay Carrageenan – irish moss là tên của một thị trấn ven biển Irish thuộc Carrageenan.
Cùng với sự tiến bộ về khoa học kỹ thuật 15 cũng nhƣ thiết bị hiện đại, ngày nay chúng ta đã khám phá ra những điều hữu ích mà carrageenan đã mang lại. Từ những loài tảo đỏ (Rhodophyceae) ngƣời ta đã phát hiện ra nhiều loại carrageenan khác nhau, bao gồm: kappa- carrageenan, lamda-carrageenan, iota-carrageenan [4]. Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan. Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfat đƣợc gắn vào carrageenan ở những vị trí và số lƣợng khác nhau.
Vì vậy, carrageenan không chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là các galactan sulfat. Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có ký hiệu riêng. Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [4] Hình 1. Cấu trúc hóa học của carrageenan [5] 1.
Phân loại Phần lớn các carrageenan có phân tử lƣợng từ 500 – 1000 kDa, nhƣng trong đó chúng có thể chứa tới 25% polysaccharide với phân tử lƣợng nhỏ dƣới 100 kDa. Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của β-D-galactopyranora qua liên kết 1,3 và α-D galactopyranora qua liên kết 1-4 [6]. Các công trình nghiên cứu bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân cho thấy carrageenan có nhiều cấu trúc hóa học khác nhau [7]. Do đó, phân loại theo cấu trúc hóa học có các loại carrageenan sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi.
Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sulphat hóa, vị trí sulphat hóa, mức độ dehydrat hóa của chuỗi polysacharide. Cấu trúc của chúng đều có những thành phần về số lƣợng sulphat của carrageenan chiếm 18 ÷ 40 % phân tử carrageenan. Cấu trúc Kappa-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn xen kẽ giữa D- galactose-4- sulphat (Gal S) và 3,6 – Anhydro-D-galactose (GalA). Cấu trúc phân tử kappa carrageenan là một vòng xoắn kép bậc 3 Hình 1.
Cấu trúc của kappa carrageenan Iota-carrageenan: cũng giống nhƣ kappa-carrageenan nhƣng gốc 3,6- Anhydrogalactose lại ở vị trí cacbon thứ 2. Iota –carrageenan là carrageenan có nhóm SO42- nhiều nhất trong mạch phân tử, cấu trúc là vòng xoắn kép bậc 2. Gel iota- carrageenan có tính đàn hồi. Cấu trúc của iota carrageenan Lamda-carrageenan: trong mạch phân tử, các đơn vị monomeric đƣợc xen kẽ với nhau: đơn vị D-galactose-2-sulphat (1,3) và D-galactose 2,6- disulphat Hình 1.
Cấu trúc của lamda carrageenan Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán nhƣng chúng khác nhau về thành phần ester sulphat và gốc quay quang. Lamda-carrageenan có khối 17 lƣợng phân tử cao và mạch dài hơn kappa-carrageenan. Thành phần của phân đoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết và loại nguyên liệu. Đặc trƣng hóa học của carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Đối với carrageenan có một quá trình lƣu ý là chuyển carrageenan từ nhóm cấu trúc không có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose thành nhóm cấu trúc có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose [8].
Ví dụ: µ-, ν- carrageenan đƣợc xem là tiền thân của κ- và ι- carrageenan, quá trình chuyển nhóm cấu trúc này đƣợc thực hiện trong môi trƣờng kiềm mạnh. Sự hình thành liên kết cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose trong tự nhiên đƣợc xúc tác bởi các enzyme sulphohydrolase [9]. Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan [8] 1. Oligo Carrageenan và ứng dụng 1.
Oligo carrageenan Oligo carrageenan là mạch carrageenan đã bị cắt ngắn mạch khi thủy phân carrageenan của các cấu trúc kappa, lamda và iota.