MỞ ĐẦU Con người biết đến chất thơm và sử dụng chúng từ hàng nghìn năm nay. Nó làm tăng chất lượng của nhiều sản phẩm, đặc biệt là thực phẩm. Khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và phong phú về cả số lượng lẫn chất lượng. Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu rất lớn về các chất phụ gia tạo hương.
Hương tạo nên giá trị cảm quan và hương vi đặc trưng cho thực phẩm. Trong quá trình chế biến thực phẩm, cấu tử hương trong nguyên liệu ban đầu sẽ dần mất đi, điều đó bắt buộc các nhà công nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia tạo hương. Mặt khác, trong các sản phẩm thực phẩm pha chế (nước ngọt, rượu mùi, sữa chua .) luôn cần sự có mặt của các chất tạo hương. Ngoài công nghiệp thực phẩm ra, những ngành khác cũng có nhu cầu sử dụng các chất phụ gia tạo hương, đó là: công nghiệp mỹ phẩm, chất phụ gia để sản xuất nước hoa, phấn son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm các chất tạo hương vào thuốc, đặc biệt là các loại thuốc cho trẻ em để làm át đi hương vị khó chịu của thuốc và làm cho thuốc dễ uống hơn; việc sản xuất các hàng tiêu dùng như kem đánh răng, xà phòng thơm, nước gội đầu, vv.
cũng cần bổ xung chất phụ gia tạo hương. Trong số các cấu tử tạo hương như este, andehyde, lactone, alcohol. thì lactone là hợp chất khá phổ biến và là cấu tử hương thơm chính trong một số loại hoa quả, thảo mộc như đào, mận, dừa, dâu tây. Trong các lactone thì γ-decalactone (C10H18O2) là có giá trị nhất, được nghiên cứu nhiều nhất.
Chất này tồn tại trong tự nhiên ở mức độ vi lượng, song là thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều loại quả. γ- decalacton có thể được tổng hợp bằng con đường sinh tổng hợp từ dầu thực vật nhờ quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), là một loại nguyên liệu phù hợp cho quá trình tổng hợp γ-decalactone. Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu sẽ tạo ra axit ricinoleic, đây là “cơ chất” để một số nấm men chuyển hóa thành chất thơm, nhờ quá trình β-oxi hóa.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Khóa 2011-2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Một số nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeasts) như Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp. có khả năng sử dụng, chuyển hóa axít béo và các hợp chất kị nước. Trong số đó nấm men Yarrowia lipolytica là loài được nghiên cứu nhiều nhất. Vấn đề nâng cao sự chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất.
Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta sẵn có, rẻ tiền nhưng việc sử dụng nó cho việc nghiên cứu sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì những lẽ trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica”. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Khóa 2011-2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Mục tiêu của đề tài Chứng minh dầu thầu dầu Việt Nam như một nguyên liệu tiềm năng trong việc sản xuất chất thơm –decalactone nhờ nấm men, cũng như nấm men Yarrowia lipolytica VTP5 như một chủng tiềm năng cho việc sản xuất này. Nội dung nghiên cứu 1.
Lựa chọn điều kiện thích hợp để lên men chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành chất thơm –decalactone bằng nấm men Yarrowia lipolytica VTP5, quy mô trên máy lắc. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình lên men đó trong các nồi lên men dung tích 5L và 50L. Tìm các điều kiện tách chiết và thu nhận chất thơm –decalactone từ dịch lên men. Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Khóa 2011-2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt CHƢƠNG I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm men Yarrowia lipolytica Nấm men Yarrowia lipolytica thuộc về nhóm các loài nấm men có khả năng chuyển hóa chất béo, hay còn gọi là nấm men ưa béo (oleaginous yeasts). Trong đó còn có các loài khác như Rhodotorula sp. Chúng có khả năng chuyển hóa chất béo, dầu và các hợp chất hydrocacbon kị nước [11].
Yarrowia là chi nấm men duy nhất thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), chi này cũng chỉ có một loài. Nấm men này được phân lập lần đầu tiên từ bơ thực vật ở Hà Lan năm 1928, lúc đầu có tên gọi là Torula lipolytica, sau đó được đổi thành Candida lipolytica và đến nay là Yarrowia lipolytica. Nó thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, có khả tạo rất nhiều sản phẩm khác nhau, và đã được đánh giá là nhóm nấm men không có khả năng gây bệnh. Nhiều quy trình sản xuất cơ bản nhờ nấm men này được cấp phép ứng dụng bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA).
Hơn nữa, Yarrowia lipolytica cũng được sử dụng làm công cụ trong các nghiên cứu về sự bài tiết protein, sự hình thành của peroxisome, về tính lưỡng hình của nấm men, về sự phân hủy các hợp chất kỵ nước, cũng như trong nhiều các lĩnh vực khác [16][18]. Đặc điểm hình thái, di truyền Yarrowia lipolytica là loại nấm men lưỡng hình chuyển hóa chất béo, thường được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau, từ môi trường tự nhiên như nước thải của nhà máy ép dầu, xưởng sản xuất thực phẩm có dầu, hay từ môi trường ô nhiễm dầu. Hầu hết các tế bào phân lập được ở trạng thái đơn bội, nhưng một số ít ở trạng thái lưỡng bội để hình thành bào tử túi chứa bốn bào tử. Các tế bào có thể biệt hóa thành dạng đơn bào, dạng hệ sợi giả, hay dạng sợi, tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng.
Bộ gen trong nhân của Y. lipolytica có sáu nhiễm sắc thể, với kích thước khoảng 20Mb. Nhiều trong số các gen xuất hiện tương tự như gen của nấm sợi hơn là của nấm men truyền thống Saccharomyces cerevisiae. Việc giải mã trình tự bộ gen của Y.
lipolytica gần đây đã cho biết nhiều thông tin quan trọng về tích lũy và Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Khóa 2011-2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt phân giải lipit, về sự tương tác của cơ chất kỵ nước với các tế bào nấm men, sự hấp phụ và vận chuyển của chúng, các quá trình oxy hóa các cơ chất này và các enzyme khác nhau tham gia vào những quá trình đó. Một số enzyme liên quan đến sử dụng cơ chất kỵ nước thuộc các loại multigene (đa gen). Ví dụ: lipases/esterase (LIP genes), cytochromes P450 (ALK genes) và peroxisomal acyl-CoA oxidases (POX genes) được mã hóa bởi một họ 5 gen có tên POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, những gen này mã hóa tổng hợp năm enzyme acyl-coenzyme A oxidases (Aox) là Aox1, Aox2, Aox3, Aox4, Aox5. Các enzyme ở thể peroxi có vai trò quan trọng trong sản xuất - decalactone từ methyl ricinoleate, một phần chuỗi ngắn riêng Aox (Aox3) có liên quan đến quá trình tái tiêu thụ - decalactone.
Khi những gen này bị đột biến, tế bào không chết nhưng sự phân giải, sử dụng các cơ chất kỵ nước của Yarrowia lipolytica bị ức chế [21][25][27]. Đặc điểm sinh lý học Về nguồn cacbon Ngoài việc sử dụng các cơ chất thông thường như các đường hexose, pentose, thì Yarrowia lipolytica còn có thể sử dụng hiệu quả các cơ chất kỵ nước như ankan, hydrocacbon thơm, chất béo… Việc sử dụng các cơ chất đặc biệt này có liên quan đến cơ chế bám dính của cơ chất kỵ nước vào màng tế bào và cơ chế vận chuyển các chất qua màng tế bào bằng các chất mang. Khi đó, những giọt nhỏ cơ chất kỵ nước bám dính lên bề mặt tế bào (hình 1.1), tế bào tự thay đổi bề mặt như tạo bề mặt gồ gề lồi lõm, và giảm độ dày thành tế bào. Sau đó chúng được vận chuyển chủ động thông qua các kênh vận chuyển điện tử dày đặc trên màng tế bào [16].
Dưới đây (hình 1.1) là ảnh hiển vi của tế bào Yarrowia lipolytica trong môi trường methy ricinoleate, minh họa cho hiện tượng vừa trình bày. Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Khóa 2011-2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng trong môi trường chứa methy ricinoleate [16]. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, nếu là chất béo, trước hết chúng sẽ chịu tác động của enzyme lipotic (lipase) để bị thủy phân thành glycerol và axít béo; tiếp đó các cơ chất kỵ nước này sẽ được hydroxy hóa nhờ hệ ezyme có tên là cytochrome P450 monoxidase khu trú trong lưới nội chất, rồi tiếp tục chịu tác động của hệ enzyme oxidase chuyển thành andehyde béo; tiếp đó là quá trình oxi hóa andehyde béo được xúc tác bởi aldehyde dehydrogenase [10]. Ngoài nguồn cacbon kể trên, Yarrowia lipolytica cũng có thể sử dụng ancol (ankan, glycerin…), axit hữu cơ (axit axetic, axit xitric, axit succinic…) hay các muối của các axit hữu cơ đó như những nguồn cacbon duy nhất để sinh trưởng, và chuyển hóa các chất theo những hướng khác nhau [16].
Nhu cầu oxy Nấm men Yarrowia lipolytica sống hiếu khí bắt buộc, sự sinh trưởng và trao đổi chất của nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, đặc biệt là lượng oxy trong môi trường nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, nhu cầu oxy cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men này phụ thuộc vào nồng độ ion sắt có trong môi trường [12]. Ngoài việc khuấy lắc, có nhiều phương pháp được áp dụng nhằm tăng hàm lượng Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Khóa 2011-2013 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt oxy trong môi trường nuôi cấy như sục khí nén, đặc biệt là bổ sung chất mang perfluorocarbons (PFC) đã hòa tan oxy vào bình lên men trong giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy khi mà lượng oxy ban đầu đã được sử dụng đáng kể. Theo các nghiên cứu, khi tăng nồng độ oxy trong môi trường lên men từ 10 đến 20% thì sản lượng chất đã chuyển hóa tăng rõ rệt (từ 10-80%); việc tăng nồng độ oxy lên trên 20% không làm tăng thêm lượng sản phẩm [12].
Chất thơm từ lipit 1.