Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu

Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ.

• Tác giả: Trần Cao Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Thái Nguyễn Hùng Thu
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
• Đề tài: Nghiên Cứu Dư Lượng Hóa Chất Bảo Vệ Thực Vật Trong Dược Liệu Bằng Sắc Ký Khối Phổ
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Dược Học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
• 2.1. Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật
• 2.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật
• 2.2.1. Phân loại theo mối nguy
• 2.2.2. Phân loại theo công dụng
• 2.2.3. Phân loại theo cấu tạo hóa học
• 2.3. Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính
• 3. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
• 3.1. Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên thế giới
• 3.2. Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật ở Việt Nam
• 3.3. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả
• 4. DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU
• 4.1. Khái niệm về dư lượng và mức dư lượng tối đa
• 4.2. Quy định về mức dư lượng tối đa
• 4.3. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu
• 5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
• 5.1. Các phương pháp xử lý mẫu
• 5.2. Một số kỹ thuật dùng trong phân tích hóa chất bảo vệ thực vật
• 6. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 6.1.1. Hoá chất bảo vệ thực vật
• 6.1.2. Đối tượng phân tích
• 6.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
• 6.2.1. Hoá chất, thuốc thử
• 6.2.2. Thiết bị, dụng cụ
• 6.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.3.1. Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu
• 6.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
• 6.3.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ
• 6.3.4. Phương pháp thẩm định
• 6.3.5. Phân tích mẫu thực
• 6.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 7.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC
• 7.1.1. Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật
• 7.1.2. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số vùng lân cận
• 7.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU
• 7.2.1. Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ
• 7.2.2. Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản phẩm dược liệu
• 7.2.3. Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm dược liệu
• 7.3. DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU
• 7.3.1. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi
• 7.3.2. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô
• 7.3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược
• 7.3.4. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh
• 7.4. VỀ VIỆC SỬ DỤNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC VÀ CHẾ BIẾN DƯỢC LIỆU
• 7.4.1. Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh
• 7.4.2. Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc
• 7.5. VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM DƯỢC LIỆU
• 7.5.1. Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu
• 7.5.2. Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu
• 7.5.3. Về phương pháp xử lý mẫu
• 7.5.4. Về phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ
• 7.5.5. Về kết quả thẩm định phương pháp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) là những hợp chất được sử dụng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại trong nông nghiệp. Định nghĩa này không chỉ giới hạn ở thuốc trừ sâu mà còn bao gồm thuốc điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá và thuốc trừ cỏ. Theo Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO), HCBVTV có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là dược liệu. Việc sử dụng HCBVTV cần tuân thủ các quy định về mức dư lượng tối đa (MRL) để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Nếu không được sử dụng đúng cách, HCBVTV có thể gây ra các tác dụng không mong muốn cho sức khỏe con người.

1.1. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

HCBVTV có thể được phân loại theo nhiều tiêu chí khác nhau. Một trong những cách phân loại phổ biến là theo mối nguy độc hại, dựa trên giá trị LD50. HCBVTV được chia thành các nhóm từ cực độc đến không có mối nguy độc cấp. Ngoài ra, HCBVTV cũng được phân loại theo công dụng như hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại, hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật và hóa chất dùng trong bảo quản. Phân loại theo cấu tạo hóa học cũng rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp phân tích, vì các HCBVTV có cấu trúc tương tự thường có tính chất giống nhau.

II. Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật

Việc sử dụng HCBVTV trong nông nghiệp, đặc biệt là trong trồng dược liệu, đang gia tăng. Tại Việt Nam, nhiều loại HCBVTV được phép sử dụng để bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh. Tuy nhiên, việc lạm dụng HCBVTV có thể dẫn đến tình trạng dư lượng cao trong sản phẩm nông nghiệp. Theo các nghiên cứu, việc kiểm soát dư lượng HCBVTV trong dược liệu là rất cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm. Các quy định về mức dư lượng tối đa (MRL) cần được thực hiện nghiêm ngặt để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

2.1. Tình hình sử dụng HCBVTV ở Việt Nam

Tại Việt Nam, HCBVTV được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên, việc sử dụng không đúng cách có thể dẫn đến tình trạng dư lượng HCBVTV vượt mức cho phép. Các nghiên cứu cho thấy rằng nhiều nông dân vẫn chưa nắm rõ quy định về mức dư lượng tối đa (MRL) và cách sử dụng HCBVTV an toàn. Do đó, việc nâng cao nhận thức và đào tạo cho nông dân về an toàn thực phẩm và sử dụng HCBVTV là rất cần thiết.

III. Phương pháp phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật

Phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu thường được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khối phổ (MS) kết hợp với các kỹ thuật chiết khác nhau. Phương pháp QuEChERS đã được áp dụng rộng rãi trong phân tích HCBVTV nhờ vào tính hiệu quả và tiết kiệm thời gian. Phương pháp này cho phép xác định đồng thời nhiều loại HCBVTV trong một lần phân tích, giúp giảm thiểu chi phí và thời gian. Việc thẩm định các phương pháp phân tích cũng rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

3.1. Các phương pháp phân tích hiện đại

Các phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký khí khối phổ (GC-MS) và sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) đã được áp dụng để phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu. Những phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất HCBVTV trong mẫu. Việc sử dụng các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác mà còn giúp phát hiện các hợp chất mới, từ đó đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về dư lượng HCBVTV trong dược liệu đã chỉ ra rằng nhiều mẫu dược liệu có mức dư lượng vượt quá quy định. Điều này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng HCBVTV trong sản xuất dược liệu. Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị trong việc bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm dược liệu. Việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại sẽ giúp phát hiện kịp thời các sản phẩm không đạt tiêu chuẩn, từ đó bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

4.1. Ứng dụng kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc xây dựng các quy định về mức dư lượng tối đa (MRL) cho các loại dược liệu. Ngoài ra, nghiên cứu cũng có thể hỗ trợ các cơ quan chức năng trong việc kiểm tra và giám sát việc sử dụng HCBVTV trong sản xuất nông nghiệp. Việc nâng cao nhận thức của người tiêu dùng về an toàn thực phẩm cũng là một ứng dụng quan trọng của nghiên cứu này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Dược liệu và các sản phẩm chế biến từ dược liệu là nhóm sản phẩm nông nghiệp - y tế đặc thù, giữ vai trò quan trọng trong hệ thống chăm sóc sức khỏe. Tuy nhiên, trong quá trình canh tác, cây thuốc thường xuyên đối mặt với các nguy cơ dịch hại như sâu bệnh, nấm, cỏ dại và mối mọt. Việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) là biện pháp phổ biến nhằm duy trì năng suất và chất lượng mùa vụ. Khi sử dụng không đúng quy trình, lạm dụng hoặc không tuân thủ thời gian cách ly, dư lượng HCBVTV sẽ tồn lưu trong dược liệu, gây nguy cơ ngộ độc cấp tính hoặc mạn tính cho người sử dụng.

Khoảng trống nghiên cứu lớn tại thời điểm thực hiện đề tài là:

• Các quy định và phương pháp phân tích trong Dược điển Việt Nam IV cũng như Dược điển nhiều nước chủ yếu dựa trên kỹ thuật chiết dung môi truyền thống kết hợp làm sạch bằng sắc ký cột (SPE, GPC), vốn tiêu tốn lượng lớn dung môi hữu cơ, quy trình phức tạp và chỉ phân tích được các nhóm HCBVTV cổ điển (clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, pyrethroid).
• Chưa có quy trình phân tích đa dư lượng (Multiresidues multiclasses method - MMM) hiện đại, nhanh gọn và có khả năng xác định đồng thời nhiều nhóm hoạt chất mới (carbamat, neonicotinoid, macrocyclic lacton, triazin, azol...) trên các nền mẫu dược liệu phức tạp.
• Dữ liệu thực nghiệm về thực trạng sử dụng và mức độ tồn dư HCBVTV trên các vùng trồng cây thuốc trọng điểm ở miền Bắc còn hạn chế và phân tán.

Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Trần Cao Sơn, với đề tài "Nghiên cứu xác định dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ" (Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất, Mã số: 62 72 04 10; thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2015 dưới sự hướng dẫn của PGS. Thái Nguyễn Hùng Thu và TS. Lê Thị Hồng Hảo), được tiến hành nhằm giải quyết các khoảng trống trên.

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở phía Bắc.
2. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và một số sản phẩm từ dược liệu.
3. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng phân tích: Các hoạt chất HCBVTV thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau (clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, pyrethroid, carbamat, neonicotinoid, macrocyclic lacton, azol, triazin, strobin...); các nền mẫu thực vật gồm dược liệu tươi (mã đề, bồ công anh), dược liệu khô (dây thìa canh), thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược (trà mướp đắng, trà thảo dược) và trà xanh.
• Phạm vi không gian: Khảo sát thực địa nguồn cung và tập quán sử dụng tại Hà Nội và một số địa phương lân cận (Hưng Yên, Nam Định, Lào Cai, Hòa Bình, Thanh Hóa).
• Phạm vi thời gian: Thu thập mẫu, khảo sát và thực nghiệm phân tích trong giai đoạn hoàn thành luận án đến năm 2015.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến quản lý, sử dụng và kiểm nghiệm HCBVTV:

Tổng quan các nghiên cứu trong nước

• Trịnh Văn Quỳ và Trần Việt Hùng (2002–2005): Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV tại Sa Pa (Lào Cai), Thiết Trụ và Nghĩa Trai (Hưng Yên); ghi nhận tỷ lệ sử dụng thuốc BVTV trên cây thuốc từ 82,1% đến 95,6%; thống kê 99 loại thuốc BVTV thương phẩm với 64 dạng chế phẩm trừ sâu (27 hoạt chất). Nghiên cứu phát hiện việc sử dụng hoạt chất cấm methamidophos và các chất hạn chế như endosulfan, kẽm phosphid. Phân tích 33 mẫu dược liệu bằng GC phát hiện cypermethrin trên 4/16 mẫu cúc hoa và trichlorfon trên hoắc hương.
• Nguyễn Thị Bích Thu và cộng sự (2009): Khảo sát tại 5 xã thuộc 4 tỉnh (Thanh Trì, Thường Tín - Hà Nội; Khoái Châu - Hưng Yên; Hà Trung - Thanh Hóa), ghi nhận 102 sản phẩm HCBVTV, trong đó 77,45% là thuốc trừ sâu. Tỷ lệ phát hiện dư lượng nhóm phosphor hữu cơ chiếm 23%, pyrethroid chiếm 21%, clor hữu cơ chiếm 3%, đồng thời phát hiện 25,49% số thuốc sử dụng ngoài danh mục cho phép.
• Khảo sát của Viện Dược liệu: Ghi nhận 25/91 mẫu dược liệu có tồn dư HCBVTV, phổ biến ở các bộ phận dùng là lá và hoa (khổ sâm, ngải cứu, tía tô, húng quế, kinh giới, cúc hoa, mướp đắng, rau má) và rễ củ (đương quy, sâm, ngưu tất).

Tổng quan các nghiên cứu quốc tế

• Điểm lại lịch sử sử dụng HCBVTV thế giới qua 4 giai đoạn: Giai đoạn 1 (trước 1940: hợp chất vô cơ As, Cu, Hg, S); Giai đoạn 2 (1940–1960: kỷ nguyên DDT và clor hữu cơ); Giai đoạn 3 (1960–1980: xuất bản cuốn sách Silent Spring của Rachel Carson năm 1962, US FDA cấm hợp chất clor hữu cơ năm 1973, chuyển dịch sang phosphor hữu cơ và pyrethroid thế hệ II); Giai đoạn 4 (1980 đến nay: phát triển HCBVTV sinh học, neonicotinoid, macrocyclic lacton, triazin, azol có tính chọn lọc cao).
• Tổng thuật các kỹ thuật xử lý mẫu hiện đại: Chiết dung môi (SE, Soxhlet, MAE); Chiết siêu tới hạn (SFE) với CO2 lỏng siêu tới hạn (31 °C, 73 atm) theo Lehotay (1997), Ling (2007); Chiết pha rắn (SPE) với các chất hấp phụ C18, Florisil, than chì (Graphitized Carbon Black - GCB), polymer PS-DVB, Oasis HLB; Kỹ thuật phân tán pha rắn mẫu thử (MSPD) theo Chu (2005), Ferrer (2005); Vi chiết pha rắn (SPME) theo Pawliszyn (1989); Vi chiết pha lỏng (LPME) theo Lambropoulou (2007); Sắc ký lọc gel (GPC) theo Pang (2006).
• Phương pháp QuEChERS: Xuất phát từ công trình của Anastassiades và Lehotay (2003), được chuẩn hóa thành 3 phiên bản chính: phiên bản gốc không dùng đệm, phiên bản đệm acetat AOAC 2007.01 và phiên bản đệm citrat EN 15662 của Châu Âu.

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Hầu hết nghiên cứu kiểm nghiệm dược liệu trước đây tại Việt Nam chỉ dừng lại ở sắc ký khí (GC-ECD, GC-NPD) hoặc sắc ký khí khối phổ đơn (GC-MS) cho một số nhóm chất hẹp. Luận án định vị là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại Việt Nam áp dụng phương pháp chuẩn bị mẫu QuEChERS cải tiến kết hợp đồng thời hai kỹ thuật sắc ký khối phổ tiên tiến nhất: sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) và sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS), giải quyết bài toán phân tích đa dư lượng trên hàng chục hoạt chất thuộc nhiều nhóm phân loại khác nhau trong các nền mẫu dược liệu phức tạp.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân loại HCBVTV

Luận án áp dụng các định nghĩa và khung phân loại chuẩn quốc tế:

• Định nghĩa HCBVTV: Theo Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hiệp Quốc (FAO).
• Phân loại theo mức độ độc tính: Áp dụng bảng phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) dựa trên giá trị liều chết trung bình (LD50 trên chuột tính theo mg/kg thể trọng):

Nhóm WHO	Mức độ độc	LD50 đường uống (mg/kg)	LD50 đường ngoài da (mg/kg)
Ia	Cực độc	< 5	< 50
Ib	Độc tính cao	5 – 50	50 – 200
II	Độc trung bình	50 – 2000	200 – 2000
III	Độc nhẹ	> 2000	> 2000
U	Không có mối nguy độc cấp	> 5000	-

• Phân loại theo cấu tạo hóa học và cơ chế tác động:
  • Nhóm clor hữu cơ: DDT, aldrin, dieldrin, heptachlor, lindan, endosulfan... Cơ chế: ức chế kênh vận chuyển ion Na+ hoặc gắn vào vùng picrotoxinin của thụ thể GABA, gây kích thích thần kinh liên tục.
  • Nhóm phosphor hữu cơ: Trichlorfon, profenofos, edifenphos... Cơ chế: phosphoryl hóa enzym acetylcholinesterase (ChE), làm tích tụ acetylcholin tại synap thần kinh.
  • Nhóm pyrethroid: Gồm thế hệ I (tetramethrin, resmethrin) và thế hệ II (permethrin, cypermethrin, deltamethrin, cyfluthrin, $\lambda$-cyhalothrin). Cơ chế: giữ kênh Na+ luôn mở trên màng tế bào thần kinh.
  • Nhóm carbamat: Aldicarb, carbaryl, carbofuran, methomyl, fenobucarb, indoxacarb. Cơ chế: ức chế thuận nghịch enzym ChE.
  • Nhóm neonicotinoid: Imidacloprid, acetamiprid, thiamethoxam, dinotefuran, clothianidin. Cơ chế: liên kết cạnh tranh với thụ thể nicotinic acetylcholin ở thần kinh trung ương.
  • Nhóm macrocyclic lacton: Abamectin, emamectin, spinosad. Cơ chế: tăng giải phóng và gắn kết GABA, mở kênh ion Cl-.
  • Các nhóm khác: Triazin (atrazin), benzimidazol (carbendazim), chloroacetanilid (acetochlor), carboxamid (carboxin), azol (tebuconazol), strobin (azoxystrobin).

Cơ sở quy định pháp lý về dư lượng tối đa (MRL)

• Công thức tính MRL cho sản phẩm cuối theo Dược điển Việt Nam IV: $$\text{MRL} = \frac{\text{ADI} \times M}{B \times 100}$$ (Trong đó: ADI là lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được tính theo mg/kg thể trọng; M là khối lượng cơ thể người quy chuẩn 60 kg; B là liều dùng dược liệu hàng ngày tính theo kg).
• Quy chuẩn MRL mặc định (Default MRL): Tham chiếu mức giới hạn 0,01 mg/kg của Liên minh Châu Âu (EU), Nhật Bản, Nam Phi, Argentina, Malaysia; và mức 0,1 mg/kg của New Zealand, Canada.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

[Mẫu dược liệu / TPCN]
[Xử lý mẫu QuEChERS tối ưu]
  - Chiết Acetonitril (đệm/không đệm, muối tách pha MgSO4, NaCl)
  - Làm sạch d-SPE (PSA, C18, GCB, Chì acetat)
[Phân tích LC-MS/MS]            [Phân tích GC-MS/MS]
  - Nguồn ion hóa ESI/APCI        - Nguồn ion hóa EI
  - Chế độ MRM                    - Chế độ MRM
  - Chuẩn nội: TPP               - Đánh giá tỷ lệ ion xác nhận
           [Thẩm định phương pháp]
             - Tính chọn lọc, khoảng tuyến tính
             - LOD, LOQ, Hiệu ứng nền (Matrix effect)
             - Độ đúng (Độ thu hồi), Độ lặp lại (RSD)

1. Khảo sát thực địa và lấy mẫu: Điều tra phỏng vấn cán bộ kinh doanh, nông dân tại các vùng trồng chuyên canh; thu thập mẫu vỏ bao bì, mẫu dược liệu tươi, mẫu khô và thành phẩm thương mại.
2. Phương pháp xử lý mẫu (tối ưu hóa quy trình QuEChERS):
   • Chiết bằng acetonitril kết hợp kỹ thuật muối hóa tách pha (MgSO4, NaCl, NaOAc, Na-citrat).
   • Làm sạch dịch chiết bằng kỹ thuật chiết phân tán pha rắn (d-SPE) sử dụng các chất hấp phụ: PSA (Primary Secondary Amines - loại acid hữu cơ, đường), C18 (loại lipid, chất béo), GCB (Graphitized Carbon Black - loại sắc tố clorophyl) và dung dịch chì acetat (loại tannin, polyphenol).
3. Phương pháp phân tích sắc ký khối phổ hai lần:
   • LC-MS/MS: Tối ưu hóa thông số nguồn ion hóa phun điện tử (ESI), khảo sát gradient pha động hệ dung môi (A: nước chứa acid acetic 0,1%; B: methanol), lựa chọn các cặp ion chuyển tiếp (precursor ion $\rightarrow$ product ions) trong chế độ kiểm soát đa phản ứng (MRM).
   • GC-MS/MS: Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ cột sắc ký khí, chế độ va chạm điện tử (EI) và các chuyển dịch phân mảnh đặc trưng cho các hợp chất kém phân cực, dễ bay hơi (clor hữu cơ, pyrethroid).
   • Sử dụng triphenyl phosphat (TPP) làm chất chuẩn nội (IS) để kiểm soát và hiệu chỉnh ảnh hưởng của hiệu ứng nền mẫu (matrix effect).
4. Phương pháp thẩm định quy trình: Đánh giá đầy đủ theo hướng dẫn quốc tế (AOAC, SANCO, Codex) gồm: tính chọn lọc/đặc hiệu, tỷ lệ cường độ ion xác nhận/định lượng, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại ($n=6$), độ đúng (hiệu suất thu hồi trên mẫu trắng thêm chuẩn ở các dải nồng độ).
5. Xử lý số liệu: Phân tích thống kê tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), hệ số phân tán/độ lệch chuẩn tương đối (RSD%), phương trình hồi quy đường chuẩn $R^2$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật, tình hình sử dụng và phương pháp phân tích

• Trình bày toàn diện về lịch sử, định nghĩa, phân loại 9 nhóm HCBVTV chính kèm cơ chế gây độc trên hệ thần kinh và cơ quan sinh học.
• Đánh giá hiện trạng sử dụng thuốc BVTV tại Việt Nam: Theo Thông tư 21/2013/TT-BNNPTNT, Việt Nam có hơn 1500 hoạt chất được phép sử dụng, 2 hoạt chất trừ sâu hạn chế (carbofuran, methomyl) và 21 hoạt chất trừ sâu bị cấm (gồm 14 chất clor hữu cơ, 5 chất phosphor hữu cơ, 2 hợp chất kim loại vô cơ Cd, Pb). Hàng năm nhập khẩu trên 70.000 tấn thành phẩm (90% từ Trung Quốc).
• Hệ thống hóa các quy định GACP-WHO theo Thông tư 14/2009/TT-BYT và các mô hình đạt chuẩn (vùng dây thìa canh của Nam Dược tại Nam Định; đinh lăng, actiso, bìm bìm biếc, rau đắng đất của Traphaco).
• Đánh giá ưu nhược điểm của 8 kỹ thuật chuẩn bị mẫu: Chiết dung môi lỏng (SE), chiết Soxhlet, chiết vi sóng (MAE), chiết siêu tới hạn (SFE), chiết pha rắn (SPE), phân tán pha rắn mẫu thử (MSPD), vi chiết pha rắn (SPME), vi chiết pha lỏng (LPME), sắc ký lọc gel (GPC) và phương pháp QuEChERS (3 phiên bản: gốc, AOAC 2007.01, EN 15662).

Chương 2: Đối tượng, phương tiện và phương pháp nghiên cứu

• Cung cấp danh mục chi tiết các chất chuẩn HCBVTV, độ tinh khiết, dung môi pha loãng, chất chuẩn nội (TPP).
• Mô tả chi tiết danh mục thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS, GC-MS/MS, cột sắc ký, máy ly tâm lạnh, máy lắc xoáy, vật liệu d-SPE (PSA, C18, GCB, MgSO4 khan, muối đệm).
• Thiết lập quy trình chi tiết về lấy mẫu thực địa, điều tra bảng hỏi, các bước chiết xuất mẫu thử, thông số vận hành thiết bị khối phổ và các tiêu chí chấp nhận khi thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn phân tích dư lượng.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

1. Khảo sát thực trạng nguồn cung và sử dụng HCBVTV

• Khảo sát các cửa hàng kinh doanh và nông dân tại các vùng trồng cây thuốc ở Hà Nội và vùng phụ cận.
• Ghi nhận tình trạng kinh doanh một số thuốc ngoài danh mục, thuốc không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc nhãn mác tiếng nước ngoài; tình trạng người dân lạm dụng thuốc, tự ý tăng liều từ 1,5 đến 4 lần, phun định kỳ 4–8 lần/vụ và không tuân thủ thời gian cách ly (PHI).

2. Xây dựng và tối ưu hóa điều kiện sắc ký khối phổ

• LC-MS/MS: Tối ưu hóa điều kiện ion hóa ESI (+/-), xác định 2 mảnh ion sản phẩm đặc trưng cho mỗi hoạt chất (ví dụ: carbendazim, carboxin, carbaryl, dimethoat, atrazin), thiết lập chương trình gradient dung môi tối ưu thời gian phân tích và độ phân giải pic.
• GC-MS/MS: Thiết lập điều kiện phân tích cho các hợp chất như permethrin (2 đồng phân), cypermethrin (4 đồng phân), xác định thời gian lưu và năng lượng phân mảnh ion.
• Chứng minh độ lặp lại cao của hệ thống thiết bị trên cả hai hệ thống sắc ký khối phổ.

3. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu QuEChERS cho từng nền mẫu

• Nền dược liệu tươi (mã đề, bồ công anh): Khảo sát ảnh hưởng của lượng than đen hoạt tính (GCB) đến việc loại màu clorophyl và độ thu hồi; xác định lượng GCB tối ưu để vừa loại sạch sắc tố vừa không làm thất thoát các HCBVTV có cấu trúc phẳng.
• Nền dược liệu khô (dây thìa canh): Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung nước để hydrat hóa mẫu khô trước khi chiết bằng acetonitril; tối ưu hóa lượng muối tách pha NaCl và chất làm sạch d-SPE.
• Nền thực phẩm chức năng (trà mướp đắng, trà thảo dược) và Trà xanh: Đánh giá ảnh hưởng của lượng PSA, C18 và việc sử dụng muối chì acetat để loại bỏ tannin và các polyphenol phức tạp, giảm thiểu triệt để hiện tượng tắt/giảm tín hiệu ion do hiệu ứng nền.

4. Kết quả thẩm định phương pháp

• Phương pháp đạt độ chọn lọc cao, không có pic tạp gây nhiễu tại thời gian lưu của các chất phân tích trên mẫu trắng.
• Tỷ lệ ion xác nhận/ion định lượng nằm trong giới hạn sai lệch cho phép.
• Khoảng tuyến tính đạt hệ số tương quan cao ($R^2 > 0,99$).
• Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) trên các nền mẫu đều đạt mức rất thấp, đáp ứng tốt yêu cầu phân tích theo mức MRL mặc định (0,01 mg/kg).
• Độ thu hồi trên các nền mẫu thực nghiệm (mã đề tươi, dây thìa canh, trà thảo dược, trà xanh) đạt trong khoảng chấp nhận 70% – 120% với độ lặp lại $RSD < 20%$.

5. Kết quả phân tích trên mẫu thực tế

• Phân tích sàng lọc dư lượng HCBVTV trên các mẫu dược liệu tươi, dược liệu khô thu thập từ thị trường và vùng trồng.
• Phân tích các sản phẩm thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược và mẫu trà xanh thương phẩm; ghi nhận tần suất xuất hiện và hàm lượng của một số hoạt chất phổ biến, đối chiếu với các quy định MRL hiện hành.

Chương 4: Bàn luận

• Phân tích nguyên nhân sâu xa của việc lạm dụng HCBVTV trong canh tác dược liệu tự phát (thiếu kiến thức bảo hộ, chạy theo năng suất, thiếu sự giám sát chuỗi cung ứng).
• Đánh giá so sánh hiệu năng của quy trình QuEChERS cải tiến với các phương pháp Dược điển truyền thống: rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu từ nhiều giờ xuống dưới 30 phút, giảm 90% lượng dung môi độc hại tiêu thụ.
• Thảo luận cơ chế gây hiệu ứng nền (Matrix Effect) trên các hệ thống ESI trong LC-MS/MS và hiệu quả của việc bổ sung chuẩn nội triphenyl phosphat (TPP) kết hợp chì acetat trong việc triệt tiêu sai số định lượng.
• So sánh các thông số LOD, LOQ, độ đúng và độ lặp lại của luận án với các công trình quốc tế cùng thời điểm (như nghiên cứu của Raski, Pang, Lehotay), khẳng định phương pháp xây dựng có độ tin cậy tương đương các phòng thí nghiệm chuẩn quốc tế.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Hoàn thiện hệ thống phương pháp luận phân tích đa dư lượng trên dược liệu: Luận án là công trình nghiên cứu toàn diện đầu tiên tại Việt Nam thiết lập thành công quy trình phân tích đa dư lượng đồng thời nhiều nhóm HCBVTV (từ các nhóm cổ điển như clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, pyrethroid đến các nhóm hiện đại như carbamat, neonicotinoid, macrocyclic lacton, triazin, azol) trên các nền mẫu dược liệu phức tạp bằng việc kết hợp đồng bộ hai kỹ thuật LC-MS/MS và GC-MS/MS.
2. Cải tiến kỹ thuật chuẩn bị mẫu QuEChERS: Tối ưu hóa thành công các bước xử lý mẫu cho từng nhóm nền đặc thù (dược liệu tươi giàu diệp lục, dược liệu khô giàu xơ, TPCN và chè giàu polyphenol/tannin) thông qua việc phối hợp tỷ lệ chất hấp phụ d-SPE (PSA, C18, GCB) và kỹ thuật kết tủa làm sạch bằng chì acetat, giải quyết triệt để hiện tượng dập tắt ion trong nguồn ESI.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Cung cấp bức tranh thực trạng canh tác và kinh doanh HCBVTV: Luận án cung cấp bộ dữ liệu thực địa cập nhật về danh mục, nguồn gốc thuốc BVTV được buôn bán và sử dụng tại các vùng trồng cây thuốc trọng điểm phía Bắc, chỉ ra các hành vi nguy cơ (dùng thuốc cấm, thuốc ngoài danh mục, tăng liều, rút ngắn thời gian cách ly).
2. Quy trình kiểm nghiệm ứng dụng thực tế: Xây dựng quy trình phân tích hoàn chỉnh, có độ nhạy cao (LOQ đạt mức $\le 0,01\text{ mg/kg}$), đã được thẩm định đầy đủ, có thể chuyển giao trực tiếp cho các viện kiểm nghiệm, trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - thực phẩm trên toàn quốc để kiểm soát chất lượng dược liệu và thực phẩm chức năng.
3. Cơ sở dữ liệu dư lượng phục vụ xây dựng chính sách: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về mức độ tồn dư HCBVTV trên các mẫu thương phẩm, làm cơ sở khoa học để các cơ quan quản lý (Bộ Y tế, Cục Quản lý Dược) bổ sung, cập nhật quy chuẩn kỹ thuật và mức MRL trong Dược điển Việt Nam.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tăng cường thanh tra, kiểm soát chặt chẽ thị trường kinh doanh thuốc BVTV tại các vùng chuyên canh dược liệu; kiên quyết xử lý việc buôn bán thuốc nhập lậu, thuốc ngoài danh mục.
• Đẩy mạnh tập huấn cho người trồng cây thuốc về nguyên tắc "4 đúng", thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc theo tiêu chuẩn GACP-WHO.
• Đề xuất Bộ Y tế sớm ban hành quy định về mức giới hạn dư lượng tối đa mặc định (Default MRL = 0,01 mg/kg) đối với các HCBVTV chưa có quy định cụ thể trên dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:

  • Phạm vi khảo sát thực địa và thu thập mẫu thực tế chủ yếu tập trung tại một số tỉnh phía Bắc (Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Lào Cai, Hòa Bình, Thanh Hóa), chưa bao phủ toàn diện các vùng trồng dược liệu trọng điểm ở miền Trung và miền Nam.
  • Số lượng nền mẫu dược liệu thử nghiệm tập trung vào một số đại diện tiêu biểu (mã đề, bồ công anh, dây thìa canh, chè, mướp đắng); chưa thể bao quát hết toàn bộ các nhóm dược liệu chứa tinh dầu cao, chất nhựa hoặc các hợp chất tự nhiên đặc thù khác.

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng thư viện hoạt chất phân tích đa dư lượng trên hệ thống LC-MS/MS và GC-MS/MS lên hàng trăm hoạt chất nhằm bắt kịp xu hướng phát triển của các loại thuốc BVTV thế hệ mới.
  • Mở rộng nghiên cứu quy trình xử lý mẫu trên các nền mẫu dược liệu đặc thù khác (rễ củ giàu tinh bột, dược liệu giàu chất béo, dược liệu chứa tinh dầu nặng).
  • Nghiên cứu sâu hơn về sự chuyển hóa và động học phân hủy của dư lượng HCBVTV trong quá trình chế biến, sơ chế, chiết xuất và sản xuất cao định liều từ dược liệu.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cao cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên ngành Dược, Hóa phân tích, Độc chất học: Tham khảo phương pháp luận tối ưu hóa quy trình phân tích sắc ký khối phổ (MRM, thông số nguồn ion, gradient dung môi) và quy trình thẩm định phương pháp phân tích dư lượng vi lượng theo chuẩn quốc tế.
• Cán bộ kiểm nghiệm tại các Viện Kiểm nghiệm thuốc, Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm, Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh/thành phố: Sử dụng trực tiếp quy trình QuEChERS cải tiến kết hợp LC-MS/MS và GC-MS/MS để kiểm tra, giám sát chất lượng nguyên liệu dược liệu, trà thảo dược và thực phẩm chức năng lưu thông trên thị trường.
• Các nhà quản lý y tế và nông nghiệp: Sử dụng số liệu thực trạng làm căn cứ xây dựng chính sách quản lý chuỗi cung ứng cây thuốc, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia và cập nhật các chuyên luận trong Dược điển Việt Nam.
• Các doanh nghiệp sản xuất đông dược, thực phẩm chức năng: Tham khảo quy trình kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào nhằm đáp ứng tiêu chuẩn GACP-WHO và các tiêu chuẩn xuất khẩu quốc tế.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án lựa chọn kỹ thuật chuẩn bị mẫu nào làm trọng tâm và tại sao?

Luận án lựa chọn kỹ thuật QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) cải tiến. So với các phương pháp truyền thống như chiết Soxhlet hay chiết dung môi kết hợp SPE/GPC theo Dược điển, QuEChERS có ưu điểm vượt trội: thao tác nhanh, chi phí thấp, giảm thiểu lượng dung môi hữu cơ độc hại, và có khả năng chiết xuất đồng thời nhiều nhóm HCBVTV có độ phân cực khác nhau trong cùng một quy trình.

2. Hai kỹ thuật phân tích chính được sử dụng trên thiết bị là gì?

Hai kỹ thuật phân tích chính là sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) và sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) hoạt động ở chế độ kiểm soát đa phản ứng (MRM). Sự kết hợp này cho phép phân tích toàn diện cả nhóm chất phân cực, kém bền nhiệt (bằng LC-MS/MS) và nhóm chất kém phân cực, dễ bay hơi như clor hữu cơ, pyrethroid (bằng GC-MS/MS).

3. Phương pháp của luận án xử lý bài toán hiệu ứng nền (Matrix Effect) như thế nào?

Để khắc phục hiệu ứng nền gây dập tắt hoặc tăng cường tín hiệu ion (đặc biệt trên nguồn ESI của LC-MS/MS), luận án đã:

• Tối ưu hóa hỗn hợp chất hấp phụ d-SPE (PSA để loại acid hữu cơ/đường, C18 loại lipid, GCB loại sắc tố clorophyl).
• Sử dụng muối chì acetat để kết tủa và loại bỏ triệt để tannin, polyphenol trong các nền mẫu phức tạp (như chè, trà thảo dược).
• Sử dụng chất chuẩn nội Triphenyl phosphat (TPP) trong suốt quá trình phân tích để chuẩn hóa và bù trừ sai số do nền mẫu gây ra.

4. Mức giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp có đáp ứng được các tiêu chuẩn quốc tế không?

Có. Quy trình phân tích sau khi thẩm định đạt mức LOQ đáp ứng tốt giới hạn dư lượng tối đa theo Dược điển Việt Nam IV và đạt mức giới hạn mặc định 0,01 mg/kg theo quy định của Liên minh Châu Âu (EU) và Nhật Bản.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Trần Cao Sơn đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu đề ra thông qua việc kết hợp chặt chẽ giữa khảo sát thực địa và thực nghiệm phân tích hiện đại. Đề tài đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình phân tích đa dư lượng HCBVTV trên nhiều nền mẫu dược liệu phức tạp bằng kỹ thuật QuEChERS cải tiến kết hợp LC-MS/MS và GC-MS/MS. Công trình cung cấp bức tranh thực trạng về việc sử dụng và tồn dư HCBVTV trong canh tác cây thuốc tại miền Bắc, đóng góp luận cứ khoa học quan trọng cho công tác kiểm nghiệm và xây dựng chính sách quản lý chất lượng dược liệu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm… Dược liệu là một loại sản phẩm nông nghiệp đặc biệt, do đó cũng có nguy cơ mắc phải các dịch bệnh nói trên. Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng và loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng HCBVTV nhằm tăng năng suất và chất lượng dược liệu. Khi được sử dụng, HCBVTV có thể tồn dư trong sản phẩm.

Nếu HCBVTV được dùng đúng theo quy định, mức tồn dư này là an toàn cho người sử dụng. Theo quy định, mỗi loại HCBVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL). Tuy nhiên, việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại HCBVTV dẫn đến tồn dư HCBVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL. Khi đó, HCBVTV sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn cho người sử dụng.

Việc xác định mức dư lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ các sản phẩm không đáp ứng được sự an toàn cho người sử dụng. Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV được cho phép sử dụng trong nông nghiệp. Để có thể phân tích hết các HCBVTV, cần phải áp dụng rất nhiều kỹ thuật chiết và phân tích khác nhau, dẫn đến rất mất thời gian và tốn kém kinh phí. Do đó, việc xây dựng được các phương pháp có thể xác định đồng thời nhiều HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhau là nhu cầu cần thiết.

Trên thế giới, các phương pháp xác định HCBVTV đã được phát triển từ rất lâu và đã trải qua nhiều thành tựu… Hầu hết các phương pháp cố gắng hướng đến một phương pháp phân tích đồng thời nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích. Các phương pháp này được gọi là phương pháp đa dư lượng (MMM). Cục Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ đã ban hành và thay đổi khá nhiều phương pháp đa dư lượng. Trước đây, chiết lỏng lỏng kết hợp với làm sạch bằng sắc ký cột là phương pháp kinh điển trong phân tích dư lượng HCBVTV.

Năm 2003, Anastassiades và cộng sự lần đầu tiên giới thiệu một phương pháp chiết và làm sạch nhanh, dễ dàng mà sau này được gọi là QuEChERS (viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe) kết hợp với sắc ký khí khối phổ và sắc ký lỏng khối phổ để phân tích HCBVTV trên rau quả [32]. Phương pháp QuEChERS đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và được nhiều nước chấp nhận làm phương 1 pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV trong rau quả. Sau đó, QuEChERS đã được nhiều tác giả nghiên cứu và mở rộng áp dụng trên nhiều chỉ tiêu của nhiều đối tượng khác nhau, trong đó phân tích HCBVTV trong dược liệu là một hướng rất mới và có triển vọng. Hiện nay, theo quy định của Dược điển các nước, phương pháp chiết truyền thống với kỹ thuật chiết bằng dung môi sau đó làm sạch bằng SPE hoặc GPC vẫn là phương pháp được sử dụng để chiết HCBVTV trong dược liệu.

Phương pháp này có một số hạn chế như khả năng ứng dụng hạn chế trên một nhóm HCBVTV nhất định, sử dụng lượng dung môi hữu cơ rất lớn và trải qua rất nhiều bước nên chi phí rất tốn kém. Với những thực tế như vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ” được thực hiện với các mục tiêu như sau: 1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở phía Bắc. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và một số sản phẩm từ dược liệu.

Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 1. Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh “pesticide” có nghĩa là thuốc trừ côn trùng gây hại. Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này được mở rộng cho nhiều loại hóa chất được sử dụng trong trồng trọt bao gồm cả thuốc điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá, thuốc trừ cỏ… [7][108].

Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định nghĩa về HCBVTV như sau: “HCBVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. HCBVTV còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng HCBVTV cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển” [50]. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật Có nhiều cách phân loại HCBVTV khác nhau như phân loại theo mối nguy, theo công dụng hay theo cấu tạo hóa học.

Phân loại theo mối nguy Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phân loại HCBVTV dựa vào các nghiên cứu về nguy cơ độc hại, chủ yếu là độ độc cấp tính đường uống và đường ngoài da khi thử nghiệm trên chuột. Giá trị LD50 trên chuột theo đường uống và đường dùng ngoài da được sử dụng để phân loại. LD50 (Median lethal dose – Liều chết trung bình) là liều lượng chất độc gây chết cho một nửa (50%) số cá thể dùng trong nghiên cứu. Theo cách phân loại này, HCBVTV được chia thành 5 nhóm [133] (bảng 1.

Phân loại HCBVTV theo mối nguy LD50 trên chuột (mg/kg cân nặng) Nhóm Mức độ độc Đường uống Đường ngoài da Ia Cực độc <5 < 50 Ib Độc tính cao 5-50 50-200 II Độc trung bình 50-2000 200-2000 III Độc nhẹ > 2000 U Không có mối nguy độc cấp > 5000 1. Phân loại theo công dụng Dựa vào công dụng của HCBVTV, người ta có thể phân loại như sau [7]:  Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: được gọi theo nhóm sinh vật gây hại như: - Hóa chất trừ sâu (insecticides) - Hóa chất trừ nấm (fungicides) - Hóa chất trừ cỏ (herbicides) - Hóa chất trừ chuột (rodenticides) - Hóa chất trừ ốc sên (molluscicides) - Hóa chất trừ nhện (acaricides) - Hóa chất trừ vi khuẩn (bactericides)…  Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR – plant growth regulators) là các hóa chất sử dụng để kích thích, làm chậm hoặc ức chế sự phát triển của thực vật.  Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái. Trên cơ sở cách phân loại này, Alan Wood đã giới thiệu một trang điện tử trực tuyến giới thiệu bộ sưu tập đầy đủ các loại HCBVTV được sử dụng [134].

Phân loại theo cấu tạo hóa học Đây là cách phân loại được sử dụng phổ biến trong việc triển khai xây dựng các phương pháp phân tích, vì các HCBVTV có cấu tạo tương tự thường có tính chất giống nhau do đó phương pháp chiết và phân tích cũng giống nhau. Hơn nữa, từng nhóm HCBVTV tác động đến sinh vật và con người theo các nguyên lý tương tự nhau. Theo cách phân loại này một số nhóm HCBVTV chính như sau [7][108][130]: - HCBVTV nhóm clor hữu cơ; - HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ; - HCBVTV nhóm pyrethroid; 4 - HCBVTV nhóm carbamat; - HCBVTV nhóm neonicotinoid; - HCBVTV nhóm macrocyclic lacton; - HCBVTV vô cơ; - HCBVTV có nguồn gốc thực vật; - Các HCBVTV khác. Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính 1.

Nhóm clor hữu cơ (organochlorines) HCBVTV nhóm clor hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được hình thành khi thay thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocarbon và các dẫn xuất hydrocarbon bằng các nguyên tử clor. Trong phân tử các hợp chất này có thể tồn tại vòng benzen hoặc dị vòng (chứa dị tố O, N, hay S). Các chất này thường là các dẫn xuất clor của một số hợp chất hữu cơ như diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan… [7][13][108] Về mặt cấu tạo, HCBVTV nhóm clor hữu cơ được xếp vào 4 nhóm nhỏ [130]: - Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor… - Nhóm hợp chất benzen: lindan, hexaclorocyclohexan (HCH), pentaclorophenol… - Nhóm hợp chất cyclodien: endrin, dieldrin, heptachlor, aldrin, endosulfan sulfat… - Nhóm hợp chất polycloroterpen: toxaphen, polyclorocamphen… Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm clor hữu cơ: Aldrin Methoxychlor 4,4-DDT Lindan (-HCH) Endrin Endosulfan sulfat Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an toàn với cây trồng ở liều thông dụng nhưng lại độc với các loài động vật máu nóng. Các chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất bền trong môi trường, hiệu lực tồn dư lâu dài [23][68].

5 Cơ chế gây độc của HCBVTV nhóm clor hữu cơ phụ thuộc vào dạng cấu tạo của chúng. DDT và các HCBVTV có cấu trúc tương tự DDT là những chất rất độc trên hệ thần kinh. Chúng có tác dụng trên thần kinh ngoại biên thông qua ức chế các kênh vận chuyển Na+ qua màng tế bào thần kinh dẫn đến tê liệt và có thể dẫn đến tử vong. Còn một số loại HCBVTV có cấu trúc dị vòng hoặc vòng chứa nhiều clor như aldrin, dieldrin, heptachlor, endrin… tác động thông qua việc gắn với các vùng pícrotoxinin của acid γ-aminobutyric dẫn đến ức chế ion Cl- vào trong tế bào thần kinh.

Hậu quả là gây nên trạng thái kích thích thần kinh [27][44][60][71]. Mặc dù các HCBVTV clor hữu cơ có tác dụng diệt trừ mạnh đối với nhiều loại sâu hại nhưng do vấn đề ô nhiễm môi trường và dư lượng HCBVTV trong nông sản, sự tích lũy và tính độc cao đối con người và các loài động vật, mà ngày nay đa số các HCBVTV clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng. Nhóm phosphor hữu cơ (organophosphorus) HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ chủ yếu là các hợp chất của phospho hóa trị 5, chúng là các ester hoặc amid của acid phosphoric hoặc dẫn xuất của acid phosphoric.