Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Ung thư phổi (UTP) là bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu về tỷ lệ mắc mới và là nguyên nhân chính gây tử vong liên quan đến ung thư trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo số liệu Globocan năm 2020, Việt Nam ghi nhận tỷ lệ mắc UTP chiếm 14,5% tổng số ca ung thư mới, cao hơn mức trung bình 11% của thế giới. UTP là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng thứ nhất ở nam giới và đứng thứ hai ở nữ giới tại Việt Nam. Trong cơ cấu mô bệnh học, ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) chiếm từ 80% đến 85% tổng số trường hợp. Đa số người bệnh được chẩn đoán ở giai đoạn muộn (IIIB–IV), dẫn đến tiên lượng điều trị còn hạn chế với tỷ lệ sống sót sau 5 năm chỉ dao động trong khoảng 10% đến 15%.

Đối với UTPKTBN giai đoạn tiến xa, các liệu pháp điều trị toàn thân đóng vai trò trung tâm, trong đó liệu pháp nhắm trúng đích phụ thuộc vào việc phát hiện chính xác các đột biến gen sinh ung. Từ năm 2018, Hiệp hội Ung thư Lâm sàng Hoa Kỳ (ASCO) đã khuyến cáo xét nghiệm thường quy các gen EGFR, ALK, ROS1, BRAF, và KRAS nhằm xác định độ nhạy của khối u đối với các thuốc ức chế tyrosine kinase (TKI). Bên cạnh đó, các đột biến trên gen KRAS và NRAS cung cấp giá trị tiên lượng về nguy cơ tái phát và mức độ đáp ứng điều trị.

Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử truyền thống dựa trên mẫu sinh thiết mô gặp nhiều hạn chế do tính chất xâm lấn, nguy cơ tai biến thủ thuật, sự không đồng nhất về mặt di truyền giữa các vị trí u (nguyên phát và di căn), cũng như khó khăn khi khối u nằm ở vị trí bất khả tiếp cận hoặc người bệnh suy kiệt. Sinh thiết lỏng thông qua phân tích DNA tự do tuần hoàn nguồn gốc khối u (ctDNA) trong huyết tương là giải pháp khắc phục các trở ngại trên. Tuy nhiên, kỹ thuật giải trình tự Sanger truyền thống có độ nhạy thấp đối với các alen đột biến tần suất thấp (<20%) và chi phí cao khi khảo sát nhiều mục tiêu. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) cho phép phân tích đồng thời nhiều gen với độ sâu giải trình tự lớn trên cả mẫu mô u và mẫu sinh thiết lỏng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu công bố trước đây chủ yếu tập trung khảo sát đơn lẻ gen EGFR và KRAS, chưa có công trình nào đánh giá đồng thời bảng 6 gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) trên cả hai loại bệnh phẩm mô đúc khối paraffin (FFPE) và huyết tương sinh thiết lỏng bằng phương pháp NGS.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát: Khảo sát các đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới.

Mục tiêu chuyên biệt:

  1. Xác định tỉ lệ đột biến của 6 gen (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF) bằng giải trình tự gen thế hệ mới từ mô u và mối liên quan giữa các đột biến gen này với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.
  2. So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến EGFR giữa giải trình tự gen thế hệ mới từ mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2.
  3. So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa giải trình tự gen thế hệ mới sinh thiết lỏng với giải trình tự gen thế hệ mới mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2.

Câu hỏi nghiên cứu

  1. Phân bố các đột biến gen EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF trong quần thể bệnh nhân UTPKTBN ở Việt Nam như thế nào và mối liên quan giữa các đột biến gen này với đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ra sao?
  2. Áp dụng NGS trên mô u và sinh thiết lỏng tại Việt Nam có chính xác không trong phát hiện đột biến gen?
  3. Có thể phát hiện các gen đột biến (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF) từ sinh thiết lỏng bằng NGS tại Việt Nam không?

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân được chẩn đoán xác định UTPKTBN giai đoạn IIIB–IV theo phân loại TNM 7 của AJCC, chưa từng tiếp nhận điều trị đích, hóa trị hoặc xạ trị trước đó, từ 18 tuổi trở lên và tự nguyện tham gia nghiên cứu.
  • Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân không có mẫu bệnh phẩm mô đạt chuẩn.
  • Không gian nghiên cứu: Khoa Ung thư, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.
  • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 9/2018 đến tháng 9/2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu quốc tế

Các dữ liệu dịch tễ học và sinh học phân tử quốc tế đã chứng minh vai trò trọng yếu của các đột biến gen kích hoạt trong điều trị UTPKTBN:

  • Nghiên cứu IPASS (2011) ghi nhận tỷ lệ đột biến EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến là nữ giới đạt 76,7% và ở nhóm bệnh nhân không hút thuốc là 92,7%.
  • Nghiên cứu PIONEER (2014) trên quần thể bệnh nhân châu Á cho thấy tỷ lệ đột biến EGFR ở nữ giới cao hơn nam giới (61,1% so với 44%), đồng thời tỷ lệ này ở nhóm không hút thuốc cao hơn nhóm từng hút thuốc (60,7% so với 43,2%).
  • Nghiên cứu MSK-IMPACT (2017) thực hiện tại Trung tâm Ung thư Memorial Sloan Kettering (Hoa Kỳ) trên 1.668 bệnh nhân UTPKTBN bằng NGS đa gen ghi nhận tỷ lệ đột biến: EGFR (24,5%), KRAS (26,9%), BRAF (5,2%), ALK (4,4%), ROS1 (3,1%), và NRAS (1,2%).
  • Nghiên cứu của Papadopoulou E. (2019) thực hiện trên 50 mẫu sinh thiết lỏng ở bệnh nhân UTPKTBN tái phát sau điều trị EGFR-TKI cho thấy độ tương đồng giữa Cobas và NGS là 82% đối với các đột biến nhạy cảm (EGFR exon 18, 19, 21) và 94% đối với đột biến kháng thuốc T790M.
  • Nghiên cứu của Tan A.C. (2020) trên 173 bệnh nhân UTPKTBN xác định tỷ lệ đột biến gồm: EGFR (56%), KRAS (14%), ALK (6%), RET (3%), BRAF (2%), ERBB2 (1%), và ROS1 (1%).
  • Nghiên cứu của Stitz R. (2021) khi phân tích mẫu sinh thiết lỏng ghi nhận mức độ tương đồng 91% giữa NGS và ddPCR, với độ nhạy đạt 96% và độ đặc hiệu đạt 100%.
  • Nghiên cứu của Murakami S. (2022) trên 200 bệnh nhân UTPKTBN cho thấy tỷ lệ phù hợp giữa NGS và EGFR Cobas V2 đạt 97,5% với hệ số tương đồng Kappa $\kappa = 0,93$.

Các hướng nghiên cứu tại Việt Nam

  • Hoàng Anh Vũ (2011) khảo sát 71 bệnh nhân UTPKTBN bằng phương pháp giải trình tự Sanger, ghi nhận tỷ lệ đột biến EGFR là 42%, KRAS là 46,5%, và có 12/71 trường hợp mang đồng thời cả hai đột biến.
  • Nghiên cứu đa trung tâm PIONEER tại Việt Nam (2014) trên 1.482 bệnh nhân thể biểu mô tuyến bằng kỹ thuật Scorpion ARMS công bố tỷ lệ đột biến EGFR là 64,2% (mất đoạn exon 19 chiếm 27,5%, L858R exon 21 chiếm 12,5%, và các đột biến kháng thuốc/khác chiếm 8,3%).
  • Nguyễn Minh Hà (2014) sử dụng giải trình tự Sanger kết hợp Scorpion ARMS, xác định tỷ lệ đột biến EGFR là 58,6% và KRAS là 15,5% (đột biến tại codon 12 chiếm 82,2%, codon 13 chiếm 17,8%).
  • Nguyễn Thị Băng Sương (2020) phân tích 319 mẫu mô đúc paraffin bằng Real-time PCR (therascreen EGFR RGQ và EGFR Cobas V2), ghi nhận 43,3% mang đột biến EGFR, trong đó mất đoạn exon 19 chiếm 51,4% và L858R chiếm 38,4%.
  • Phạm Thị Mai (2021) nghiên cứu 149 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến tại Bệnh viện Quân Y 103 và Bệnh viện K3, ghi nhận tỷ lệ đột biến EGFR là 39,6% (exon 19 chiếm 50,8%, exon 21 chiếm 35,6%, đột biến kép chiếm 5,1%).
  • Nguyễn Thị Thái Hòa (2021) đánh giá các đột biến EGFR hiếm và đột biến kép ở bệnh nhân giai đoạn IV, ghi nhận đột biến kép chiếm 24%.
  • Trần Huy Thịnh (2022) kết hợp Real-time PCR và lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trên 35 bệnh nhân UTPKTBN, ghi nhận đột biến EGFR chiếm 51,1%, dung hợp gen EML4-ALK chiếm 6,7%, và dung hợp ROS1 chiếm 2,2%.

Vị trí và khoảng trống nghiên cứu của luận án

Các nghiên cứu trong nước trước đây chủ yếu sử dụng kỹ thuật PCR đơn lẻ (Real-time PCR, Scorpion ARMS) hoặc Sanger với giới hạn về số lượng gen khảo sát và độ nhạy trên mẫu nồng độ DNA thấp. Luận án giải quyết khoảng trống dữ liệu bằng cách ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) nhằm:

  1. Xác định đồng thời phổ đột biến của 6 gen đích (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF) trên cùng một quy trình kỹ thuật.
  2. Đánh giá khả năng thay thế hoặc bổ trợ của kỹ thuật sinh thiết lỏng (ctDNA huyết tương) so với sinh thiết mô chuẩn.
  3. Đối chiếu độ chính xác của NGS với hai kỹ thuật chuẩn được quốc tế công nhận là PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) và Real-time PCR tự động hóa (EGFR Cobas V2).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và thụ thể sinh học phân tử

Luận án dựa trên cơ sở sinh bệnh học phân tử của thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (EGFR) và các thụ thể tyrosine kinase màng liên quan (ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS):

  • Gen EGFR: Nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 7 (7p12), kích thước 110 kb gồm 28 exon. Đột biến hoạt hóa chủ yếu tập trung từ exon 18 đến exon 21, mã hóa vùng tyrosine kinase nội bào. Khi bị đột biến, thụ thể tự phosphoryl hóa liên tục không phụ thuộc phối tử (EGF), kích hoạt các con đường truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng gồm: PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPK và JAK/STAT. Các đột biến nhạy thuốc phổ biến gồm mất đoạn exon 19 (del19, đặc biệt là E746-A750del) và đột biến điểm L858R tại exon 21. Đột biến kháng TKI thế hệ 1 và 2 phổ biến nhất là T790M tại exon 20.
  • Gen dung hợp ALK và ROS1: Đột biến tái sắp xếp EML4-ALK (phổ biến dạng biến thể V1 và V3a/b) và dung hợp ROS1 (như CD74-ROS1, SLC34A2-ROS1) tạo ra các kinase dung hợp liên tục hoạt hóa dòng tín hiệu sinh tồn và tăng sinh tế bào.
  • Gen KRAS, NRAS, BRAF: Hoạt động như các mắt xích dẫn truyền tín hiệu xuôi dòng thuộc trục RAS-RAF-MEK-ERK. Đột biến KRAS thường xảy ra ở codon 12, 13; đột biến BRAF tập trung trên 90% tại codon 600 (V600E); đột biến NRAS thường gặp ở codon 61.
  • Cơ sở sinh thiết lỏng: Tế bào u giải phóng các đoạn DNA tự do (cfDNA) có kích thước trung bình 166 bp vào dòng tuần hoàn qua cơ chế chết tế bào hoặc hoại tử. Phân đoạn mang đột biến đặc hiệu của khối u (ctDNA) phản ánh tính không đồng nhất di truyền của toàn bộ khối u nguyên phát và di căn. Tần suất alen đột biến (Mutant Allele Fraction - MAF) trong huyết tương thường ở mức $\le 1%$, đòi hỏi công nghệ giải trình tự sâu.

Bảng tóm tắt các thuốc nhắm trúng đích và thụ thể phân tử trong UTPKTBN

STT Đích trên tế bào ung thư Thuốc nhắm trúng đích Tác dụng
1 VEGF Bevacizumab (Avastin) Ức chế tăng sinh mạch máu
2 VEGF Receptor Ramucirumab (Cyramza) Ức chế tăng sinh mạch máu
3 EGFR Erlotinib (Tarceva), Afatinib (Gilotrif), Gefitinib (Iressa), Osimertinib (Tagrisso), Cetuximab, Nimotuzumab Ức chế sự phát triển, tăng sinh của tế bào ung thư, ức chế tăng sinh mạch, chống di căn; kích hoạt apoptosis
4 EGFR có đột biến T790M Osimertinib (Tagrisso) Ức chế chọn lọc thụ thể mang đột biến kháng thuốc T790M
5 EGFR đột biến / ung thư dạng vảy Necitumumab (Portrazza) Kháng thể đơn dòng gắn kết thụ thể EGFR
6 Đột biến gen ALK Crizotinib (Xalkori), Ceritinib (Zykadia), Alectinib (Alecensa), Brigatinib (Alunbrig) Ngăn chặn tế bào ung thư phát triển và phân chia
7 Đột biến gen BRAF Dabrafenib (Tafinlar), Trametinib (Mekinist) Ngăn chặn hoạt động của MEK, ức chế phát triển và di căn

Phương pháp nghiên cứu

  • Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả.
  • Phương pháp tính cỡ mẫu: Áp dụng công thức ước lượng một tỷ lệ trong quần thể: $$n = Z_{1-\alpha/2}^2 \frac{p(1-p)}{d^2}$$ Trong đó: $Z_{1-\alpha/2} = 1,96$ (với mức ý nghĩa thống kê $\alpha = 0,05$); sai số tuyệt đối $d = 0,1$.
    • Cỡ mẫu cho Mục tiêu 1 và 2 (Mô u): Dựa trên các tỷ lệ đột biến tham khảo ($p = 42%$ đối với EGFR, $p = 6,7%$ đối với ALK, $p = 3,4%$ đối với ROS1, $p = 3%$ đối với BRAF, $p = 15,5%$ đối với KRAS, và tỷ lệ tương đồng giữa NGS mô u và Cobas $p = 97,5%$). Cỡ mẫu tối thiểu được xác định là 94 bệnh nhân có mẫu mô đạt chuẩn.
    • Cỡ mẫu cho Mục tiêu 3 (Sinh thiết lỏng): Dựa trên tỷ lệ tương đồng tham khảo giữa NGS sinh thiết lỏng và các kỹ thuật ($p = 95%$ so với NGS mô u, $p = 91%$ so với ddPCR, $p = 82%$ so với Cobas V2). Cỡ mẫu tối thiểu được xác định là 57 bệnh nhân có mẫu máu.

Hệ thống biến số nghiên cứu

Tên biến số Loại biến số Giá trị / Phân loại đo lường
Tuổi Liên tục Số năm dương lịch tính tại thời điểm thu nhận vào nghiên cứu
Giới tính Nhị giá Nam, Nữ
Hút thuốc lá Nhị giá Có, Không
Giai đoạn bệnh Định danh Giai đoạn IIIB, Giai đoạn IV (theo AJCC VII)
Phân loại mô bệnh học Định danh UTBM tuyến, UTBM vảy, UTBM tế bào lớn, UTBM tuyến vảy
Đột biến gen EGFR Định danh L858R, Del19, Ins20, H773A, L768C, G719A/S/C/D/R, L861P/Q/R...
Đột biến gen KRAS Định danh G12A/C/D/R/S/V, G13C/R/S/A/D/V, Q61K/L/P/R/H, K117N, Q22K...
Đột biến gen ALK Định danh Biến thể dung hợp EML4-ALK
Đột biến gen ROS1 Định danh Dung hợp với CD74, SLC34A2, SDC4, EZR, TPM3, FIG, LRIG3
Đột biến gen BRAF Định danh V600E, G499...
Đột biến gen NRAS Định danh G12C/S/A/D/V, G13S/C, Q61K/R...

Trang thiết bị, vật tư và quy trình kỹ thuật

  • Thiết bị giải trình tự: Hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới NextSeq 550 (hãng Illumina, Hoa Kỳ), sử dụng công nghệ giải trình tự bằng cơ chế tổng hợp (Sequencing by Synthesis - SBS) kết hợp 4 loại dNTP khóa đầu 3'-OH đánh dấu huỳnh quang.
  • Kỹ thuật đối chứng ddPCR: Hệ thống PCR vi giọt kỹ thuật số QX200 (Bio-Rad), phân tách thể tích phản ứng 20 $\mu$L thành 20.000 vi giọt kích thước 1 nL qua Droplet Generator, đọc tín hiệu huỳnh quang phân bố theo mô hình Poisson.
  • Kỹ thuật đối chứng EGFR Cobas V2: Hệ thống Cobas 4800 (Roche Diagnostics), phân tích định tính 42 đột biến trên các exon 18, 19, 20, 21 bằng phương pháp Real-time PCR tự động.
  • Hóa chất tách chiết cfDNA: Bộ sinh phẩm MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit.
  • Mẫu nội kiểm / chứng dương: Mẫu chuẩn Tru-Q1 chứa các đột biến đã biết ở nồng độ xác định.
  • Thiết bị phụ trợ: Máy cô đặc Micro-cenvac (N-Biotek), máy ly tâm lạnh Centrifuge 5702R, 5415R, 5424 (Eppendorf), máy luân nhiệt Mastercycler Nexus X2 (Eppendorf).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dịch tễ học, lâm sàng, giải phẫu bệnh và sinh học phân tử của UTPKTBN:

  • Dịch tễ và yếu tố nguy cơ: Tổng hợp tác động gây ung thư của khói thuốc lá (chứa nicotine và các hydrocacbon thơm đa vòng ức chế apoptosis và kích hoạt tăng sinh mạch), phơi nhiễm bụi amiăng, khí phóng xạ radon (chiếm 10% nguyên nhân UTP), ô nhiễm môi trường (1–2%), và bệnh phổi mạn tính mắc trước (COPD, xơ phổi, lao phổi). Độ tuổi trung bình mắc bệnh là khoảng 70 tuổi.
  • Phân loại mô bệnh học theo WHO 2015: Khái quát đặc điểm 7 phân nhóm UTPKTBN: ung thư biểu mô tuyến (chiếm 40%, phổ biến ở nữ và người không hút thuốc, vị trí ngoại vi), ung thư biểu mô vảy (25–30%, liên quan chặt chẽ với hút thuốc, vị trí trung tâm), ung thư biểu mô tế bào lớn (5–10%), ung thư biểu mô tuyến vảy, ung thư biểu mô dạng sarcoma, u carcinoid, và ung thư biểu mô týp tuyến nước bọt.
  • Phân loại giai đoạn TNM 7 (theo AJCC VII):
Giai đoạn Tiêu chuẩn phân loại TNM
Giai đoạn 0 Tis N0 M0
Giai đoạn IA T1 N0 M0 (T1a $\le 2$ cm; T1b $> 2$ cm đến $\le 3$ cm)
Giai đoạn IB T2a N0 M0 ($> 3$ cm đến $\le 5$ cm)
Giai đoạn IIA T1 N1 M0; T2a N1 M0; T2b N0 M0 ($> 5$ cm đến $\le 7$ cm)
Giai đoạn IIB T2b N1 M0; T3 N0 M0 ($> 7$ cm hoặc xâm lấn thành ngực, cơ hoành...)
Giai đoạn IIIA T1-2 N2 M0; T3 N1-2 M0; T4 N0-1 M0 (xâm lấn trung thất, tim, mạch lớn...)
Giai đoạn IIIB T4 N2-3 M0; T1-3 N3 M0 (di căn hạch đối bên / thượng đòn)
Giai đoạn IV Bất kỳ T, Bất kỳ N, M1 (M1a: tràn dịch/nốt đối bên; M1b: di căn xa)
  • Cơ chế phân tử và các kỹ thuật xét nghiệm: So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp: Hóa mô miễn dịch (IHC - dòng 6B6 cho del19, 43B2 cho L858R, 5A4 cho ALK, D4D6 cho ROS1), Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), Real-time PCR (EGFR Cobas V2 phát hiện 42 đột biến với ngưỡng LOD 5%), PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR), giải trình tự Sanger và NGS (công nghệ tổng hợp SBS của Illumina). Phân tích đặc tính sinh học của cfDNA/ctDNA huyết tương và hiện tượng không đồng nhất khối u dẫn đến 63–69% đột biến sinh dưỡng không phân bố đồng đều tại mọi vị trí mô u.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết phương pháp luận và quy trình thực nghiệm:

  • Thiết kế nghiên cứu: Cắt ngang mô tả.
  • Địa điểm và thời gian: Khoa Ung thư, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch từ tháng 9/2018 đến tháng 9/2020.
  • Tiêu chuẩn chọn và loại bệnh phẩm: Thu thập mẫu sinh thiết mô u đúc khối paraffin (FFPE) và mẫu máu ngoại vi (ly tâm tách huyết tương chứa cfDNA) của bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB–IV chưa tiếp nhận điều trị toàn thân.
  • Quy trình kỹ thuật phân tích:
    1. Xử lý mẫu: Tách chiết DNA từ mô u và tách chiết cfDNA từ huyết tương bằng kit MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation.
    2. Tạo thư viện và giải trình tự: Chuẩn bị thư viện giải trình tự mục tiêu cho 6 gen (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF), kiểm tra chất lượng thư viện, chạy giải trình tự trên hệ thống NextSeq 550 (Illumina).
    3. Xét nghiệm đối chứng song song: Thực hiện ddPCR định lượng các đột biến phổ biến (L858R, del19, T790M) trên hệ thống Bio-Rad và xét nghiệm EGFR Cobas V2 trên hệ thống Cobas 4800.
  • Đạo đức nghiên cứu: Đề tài là nhánh thuộc công trình “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen từ mẫu sinh thiết lỏng bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới với ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư” theo Quyết định số 1276/QĐ-SKHCN ngày 25/12/2017 của Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả định lượng thu được theo cấu trúc mục tiêu (dựa trên cấu trúc danh mục bảng và mục lục văn bản):

  • Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng: Phân tích đặc điểm nhóm tuổi, phân bố giới tính, tỷ lệ tiền sử hút thuốc lá, phân loại giai đoạn bệnh (IIIB và IV) và tỷ lệ mô bệnh học khối u (ung thư biểu mô tuyến chiếm ưu thế).
  • Tỷ lệ các đột biến gen khảo sát bằng NGS mô u:
    • Xác định tỷ lệ phân bố đột biến trên từng gen: EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, và các biến thể dung hợp ALK, ROS1.
    • Tỷ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen EGFR (tập trung tại exon 19 và exon 21) và chi tiết các biến thể (del19, L858R, ins20, G719X, L861Q, T790M).
    • Tỷ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen KRAS (chủ yếu codon 12 và 13) và gen BRAF (V600E và các dạng khác).
    • Tỷ lệ xuất hiện đồng thời đột biến của gen EGFR và KRAS.
  • Mối liên quan giữa đột biến gen và đặc điểm bệnh nhân: Phân tích mối liên hệ có ý nghĩa thống kê giữa sự hiện diện của đột biến (EGFR, KRAS...) với giới tính, nhóm tuổi, tiền sử hút thuốc lá và phân loại giải phẫu bệnh.
  • So sánh độ tương đồng giữa các phương pháp trên mẫu mô u:
    • Kết quả đối chiếu giữa NGS mô u và ddPCR trong phát hiện đột biến L858R, T790M, del19 trên 30 mẫu sinh thiết mô.
    • Kết quả so sánh giữa NGS mô u và xét nghiệm EGFR Cobas V2.
  • So sánh độ tương đồng của sinh thiết lỏng (NGS ctDNA):
    • So sánh kết quả NGS sinh thiết lỏng với ddPCR trên 34 mẫu máu.
    • So sánh kết quả NGS sinh thiết lỏng với xét nghiệm EGFR Cobas V2.
    • So sánh trực tiếp giữa kết quả NGS sinh thiết lỏng và NGS mô u.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương 4 biện giải các kết quả nghiên cứu trong tương quan với y văn:

  • Đặc điểm lâm sàng và dịch tễ: Bàn luận về tính tương đồng của đặc điểm tuổi, giới tính và tiền sử hút thuốc của bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam so với các công bố quốc tế tại khu vực Đông Á.
  • Phổ đột biến gen và ý nghĩa lâm sàng: Phân tích tỷ lệ đột biến EGFR, KRAS, ALK, ROS1, BRAF, NRAS phát hiện qua NGS mô u; giải thích cơ chế và tần suất của các đột biến kép (đồng đột biến giữa EGFR và KRAS); đối chiếu tính nhạy thuốc của các đột biến mất đoạn exon 19 và đột biến điểm L858R đối với các thuốc EGFR TKI thế hệ 1, 2, 3.
  • Phân tích các trường hợp không tương đồng kỹ thuật:
    • Biện giải các nguyên nhân gây sai lệch giữa NGS mô u và EGFR Cobas V2 (do giới hạn phát hiện LOD, số lượng đột biến trong danh mục thiết kế kit Cobas so với độ phủ đa gen của NGS).
    • Biện luận các ca không tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas V2.
    • Phân tích sự sai khác giữa NGS sinh thiết lỏng và NGS mô u (do mức độ phóng thích ctDNA phụ thuộc kích thước khối u, giai đoạn di căn và hiện tượng không đồng nhất di truyền không gian của khối u).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học

  1. Thiết lập dữ liệu đa gen trên bệnh nhân Việt Nam: Luận án cung cấp dữ liệu sinh học phân tử đồng thời của 6 gen đích can thiệp điều trị (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) trên bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam bằng kỹ thuật NGS, mở rộng vượt ra ngoài các khảo sát đơn gen truyền thống.
  2. Làm sáng tỏ tính khả thi của sinh thiết lỏng bằng NGS: Chứng minh khả năng phát hiện các biến thể điểm, mất đoạn và chuyển đoạn dung hợp từ ctDNA huyết tương với độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi đối chiếu với các phương pháp tiêu chuẩn.
  3. Đánh giá giá trị thực nghiệm của các nền tảng kỹ thuật: Xác lập mức độ tương đồng giữa NGS với ddPCR và Real-time PCR (Cobas V2), làm rõ giới hạn phát hiện và khả năng ứng dụng của từng kỹ thuật trong điều kiện thực hành xét nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Hỗ trợ định hướng điều trị đích cá thể hóa: Việc xác định toàn diện các đột biến nhạy thuốc (EGFR exon 19 del, L858R; ALK/ROS1 fusions; BRAF V600E) và đột biến đề kháng (EGFR T790M, KRAS) giúp bác sĩ lâm sàng lựa chọn chính xác các phác đồ TKI thế hệ mới (như Osimertinib, Alectinib, Dabrafenib/Trametinib, Sotorasib).
  2. Cung cấp giải pháp thay thế sinh thiết mô: Quy trình phân tích ctDNA từ sinh thiết lỏng bằng NGS là giải pháp chẩn đoán cho các trường hợp bệnh nhân không thể sinh thiết mô xâm lấn, mẫu mô không đủ tế bào u, hoặc cần theo dõi diễn tiến kháng thuốc không xâm lấn trong quá trình điều trị.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi không gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại một trung tâm chuyên khoa duy nhất (Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch), tập trung vào nhóm bệnh nhân giai đoạn tiến xa (IIIB–IV).
  • Cỡ mẫu phân tích đối chứng: Cỡ mẫu thực hiện phân tích đối chuẩn trực tiếp giữa các phương pháp trên mẫu mô ($n=30$) và mẫu máu ($n=34$) còn ở mức khiêm tốn.
  • Thời gian theo dõi: Thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả chưa tích hợp theo dõi dọc dài hạn về thời gian sống thêm không tiến triển (PFS) và thời gian sống toàn bộ (OS) của bệnh nhân sau khi tiếp nhận điều trị đích tương ứng với từng kiểu đột biến phát hiện được.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô nghiên cứu đa trung tâm trên các quần thể bệnh nhân UTPKTBN ở các giai đoạn bệnh sớm hơn (giai đoạn I–IIIA).
  • Triển khai các nghiên cứu theo dõi dọc (longitudinal monitoring) sử dụng sinh thiết lỏng bằng NGS để theo dõi động học ctDNA, đánh giá đáp ứng điều trị và phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc thứ phát trước khi có tiến triển trên chẩn đoán hình ảnh.

Giá trị tham khảo

  • Đối với bác sĩ Ung bướu và Nội hô hấp: Cung cấp cơ sở dữ liệu về tần suất đột biến gen và độ tin cậy của xét nghiệm sinh thiết lỏng để đưa ra chỉ định điều trị đích hợp lý và an toàn cho người bệnh.
  • Đối với chuyên viên Hóa sinh Y học và Di truyền học phân tử: Cung cấp quy trình kỹ thuật chuẩn hóa về giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) trên mẫu mô FFPE và mẫu cfDNA huyết tương, cùng các thông số đối chiếu với ddPCR và Cobas V2.
  • Đối với học viên sau đại học và nghiên cứu sinh: Cung cấp tài liệu tham khảo có cấu trúc thực nghiệm rõ ràng về phương pháp tính cỡ mẫu cho nghiên cứu độ tương đồng kỹ thuật và các bảng biến số sinh học phân tử trong UTPKTBN.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án khảo sát đột biến trên những gen mục tiêu nào?

Luận án thực hiện khảo sát đồng thời 6 gen mục tiêu bao gồm: EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, và NRAS.

2. Kỹ thuật chính và các kỹ thuật đối chứng được sử dụng trong luận án là gì?

  • Kỹ thuật chính: Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) trên hệ thống NextSeq 550 (Illumina) sử dụng công nghệ SBS.
  • Kỹ thuật đối chứng: PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) trên hệ thống Bio-Rad và Real-time PCR tự động hóa trên hệ thống EGFR Cobas V2 (Roche 4800).

3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân tham gia nghiên cứu gồm những điểm nào?

Bệnh nhân được chẩn đoán xác định UTPKTBN giai đoạn IIIB–IV theo AJCC VII, từ 18 tuổi trở lên, chưa tiếp nhận các phương pháp điều trị đích, hóa trị hay xạ trị trước đó, có đầy đủ mẫu mô bệnh phẩm và tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu.

4. Cỡ mẫu tối thiểu được tính toán cho nghiên cứu là bao nhiêu?

  • Đối với khảo sát đột biến trên mẫu mô u (Mục tiêu 1 và 2): Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là 94 bệnh nhân.
  • Đối với khảo sát và so sánh trên mẫu sinh thiết lỏng (Mục tiêu 3): Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là 57 bệnh nhân.

5. Sinh thiết lỏng mang lại lợi thế gì so với sinh thiết mô truyền thống trong nghiên cứu này?

Sinh thiết lỏng giúp thu thập ctDNA giải phóng từ toàn bộ các vị trí u (nguyên phát và di căn), khắc phục tính không đồng nhất di truyền của khối u, giảm thiểu tai biến thủ thuật xâm lấn, và cho phép thực hiện xét nghiệm trên những bệnh nhân không thể lấy mẫu mô.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đặng Huỳnh Anh Thư đã hoàn thiện quy trình khảo sát đồng thời 6 gen đích (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) ở bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến xa bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS). Công trình đã xác định mối liên quan giữa các đột biến phân tử với đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, đồng thời chứng minh mức độ tương đồng cao giữa NGS với các kỹ thuật tiêu chuẩn (ddPCR, EGFR Cobas V2) trên cả mẫu mô đúc paraffin và mẫu huyết tương sinh thiết lỏng. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực chứng có giá trị cho việc triển khai xét nghiệm gen đa mục tiêu và ứng dụng sinh thiết lỏng trong cá thể hóa điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Việt Nam.