Nghiên cứu chế tạo đột biến điểm ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu chế tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen nd6 và mt tk liên quan đến bệnh, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Võ Thị Phương
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Hồng Vân
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQGHN
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể người
• 1.1.1. Cấu trúc của ty thể
• 1.1.2. Chức năng của ty thể
• 1.2. Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể
• 1.2.1. Hệ gen ty thể
• 1.2.2. Cơ chế di truyền theo dòng mẹ của các gen ty thể
• 1.2.3. Heteroplasmy và homoplasmy
• 1.3. Đột biến gen ty thể và các bệnh liên quan
• 1.3.1. Đột biến gen ty thể
• 1.3.2. Một số hội chứng phổ biến do đột biến gen ty thể gây ra
• 1.3.2.1. Hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy – hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền Leber)
• 1.3.2.2. Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers – bệnh động kinh co giật cơ với các sợi cơ đỏ rải rác)
• 1.3.2.3. Hội chứng MELAS (Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like episodes – bệnh viêm não giật cơ có tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch)
• 1.3.2.4. Hội chứng Leigh (Leigh syndrome – bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)
• 1.3.3. Gen MT-TK và các đột biến A8344G, T8356C, G8363A
• 1.3.3.1. Gen MT-TK
• 1.3.3.2. Gen ND6 và đột biến T14484C
• 1.4. Một số phương pháp tạo đột biến điểm định hướng
• 1.4.1. Phương pháp Kunkel
• 1.4.2. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp
• 1.4.3. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp PCR
• 1.4.3.1. Sử dụng PCR truyền thống
• 1.4.3.2. Sử dụng Primer extention
• 1.4.3.3. Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR)
• 1.5. Một số phương pháp phát hiện đột biến điểm
• 1.5.1. Phát hiện đột biến điểm ADN ty thể bằng PCR-RFLP
• 1.5.2. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng xác định trình tự gen
• 1.5.3. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng phương pháp SSCP (Single-stranded conformational polymorphism)
• 1.6. Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể ở Việt Nam
• 1.7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
• 1.7.1. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu. Mẫu bệnh phẩm
• 2.2. Hóa chất, dụng cụ và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu. Tách chiết ADN tổng số
• 2.3.1. Quy trình tách chiết
• 2.3.2. Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết
• 2.4. Nhân bản các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 bằng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction)
• 2.5. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism)
• 2.6. Nhân dòng sản phẩm PCR từ khuôn là ADN bình thường (không chứa các đột biến quan tâm)
• 2.7. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli và các bước biến nạp, tách chiết plasmid
• 2.8. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc
• 2.9. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm
• 2.9.1. Điện di trên gel agarose
• 2.9.2. Điện di trên gel polyacrylamide
• 2.9.3. Giải trình tự
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kiểm tra ADN tổng số của mẫu bệnh phẩm
• 3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582
• 3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T
• 3.4. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp
• 3.5. Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dòng
• 3.6. Giải trình tự các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 đã được nhân dòng
• 3.6.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578
• 3.6.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366
• 3.6.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 và ngẫu nhiên phát hiện đột biến mất 9bp trên gen MT-TK
• 3.6.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582
• 3.7. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C
• 3.7.1. PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng
• 3.7.2. Đóng vòng plasmid dạng thẳng và kiểm tra kết quả biến nạp
• 3.7.3. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
• 3.7.4. Tách và kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến
• 3.7.5. Giải trình tự các plasmid chứa đoạn gen mang đột biến
• 3.7.5.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C
• 3.7.5.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G
• 3.7.5.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C
• 3.7.5.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A
• 3.8. Khẳng định sự có mặt của các đột biến A8344G, T8356C, G8363A, T14484C bằng PCR-RFLP
• 3.8.1. Sàng lọc đột biến T14484C
• 3.8.2. Sàng lọc đột biến A8344G
• 3.8.3. Sàng lọc đột biến T8356C
• 3.8.4. Sàng lọc đột biến G8363A
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đột biến gen ND6 và MT TK liên quan đến bệnh ty thể

Đột biến gen ND6 và MT-TK là hai yếu tố quan trọng trong nghiên cứu bệnh ty thể. Ty thể đóng vai trò thiết yếu trong việc sản xuất năng lượng cho tế bào. Các đột biến này có thể dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nghiên cứu về chúng giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền và các bệnh liên quan.

1.1. Đột biến gen ND6 và vai trò của nó trong bệnh lý

Gen ND6 được biết đến như một điểm nóng trong các đột biến liên quan đến hội chứng LHON. Đột biến này có thể gây ra các vấn đề về thị giác và ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

1.2. Đột biến gen MT TK và các hội chứng liên quan

Gen MT-TK có liên quan đến nhiều hội chứng như MERRF và MELAS. Những đột biến trong gen này có thể dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng, bao gồm động kinh và rối loạn chức năng thần kinh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu đột biến gen ty thể gặp nhiều thách thức, bao gồm việc phát hiện và phân tích các đột biến. Các phương pháp hiện tại có thể tốn kém và phức tạp, gây khó khăn trong việc sàng lọc nhanh chóng các mẫu bệnh phẩm.

2.1. Khó khăn trong việc phát hiện đột biến

Việc phát hiện các đột biến gen ND6 và MT-TK thường yêu cầu các kỹ thuật phức tạp như RFLP-PCR. Điều này có thể làm tăng chi phí và thời gian nghiên cứu.

2.2. Thách thức trong việc xác định mối liên hệ giữa đột biến và bệnh

Mối liên hệ giữa các đột biến gen và bệnh lý chưa được hiểu rõ. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định chính xác các cơ chế gây bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến gen ND6 và MT TK hiệu quả

Để nghiên cứu đột biến gen ND6 và MT-TK, các phương pháp như PCR và RFLP-PCR được sử dụng rộng rãi. Những phương pháp này giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến trong mẫu bệnh phẩm.

3.1. Phương pháp PCR trong nghiên cứu đột biến

PCR là một kỹ thuật quan trọng giúp nhân bản các đoạn gen cần thiết để phân tích. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các đột biến một cách nhanh chóng và hiệu quả.

3.2. RFLP PCR và ứng dụng của nó

RFLP-PCR là một phương pháp đơn giản và chi phí thấp, giúp sàng lọc nhanh các đột biến gen ND6 và MT-TK mà không cần thiết bị phức tạp.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu về đột biến gen ND6 và MT-TK không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn có thể ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc phát hiện sớm các đột biến có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.1. Chẩn đoán sớm bệnh lý liên quan đến ty thể

Việc phát hiện sớm các đột biến gen có thể giúp chẩn đoán các bệnh lý liên quan đến ty thể, từ đó có phương pháp điều trị kịp thời.

4.2. Hướng tới các phương pháp điều trị mới

Nghiên cứu về đột biến gen có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh lý di truyền.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu về đột biến gen ND6 và MT-TK là một lĩnh vực quan trọng trong di truyền học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc hiểu và điều trị các bệnh lý liên quan đến ty thể.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ hơn về mối liên hệ giữa các đột biến gen và bệnh lý, từ đó phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu di truyền học

Nghiên cứu về đột biến gen ty thể có thể mở ra nhiều hướng đi mới trong lĩnh vực di truyền học, giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào nhân thực. Vai trò chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP. Ngoài ra, ty thể còn có vai trò trong quá trình tạo hemoglobin, tổng hợp các purine và pyrimidine, viên gạch cấu trúc giúp xây dựng ADN và ARN, tham gia vào quá trình chết theo lập trình (Apoptosis - Programmed cell death) của tế bào và nhiều quá trình trao đổi chất khác. Để thực hiện hết được các vai trò của mình và đảm bảo về nhu cầu năng lượng nhằm duy trì sự sống và hỗ trợ sự tăng trưởng, ty thể phải thực hiện các quá trình trao đổi chất với tần suất cao.

Các phản ứng trao đổi chất này giải phóng nhiều sản phẩm có tính ứng ôxy hóa, đồng thời với sự tác động thêm của một số yếu tố khác là nguyên nhân gây ra sự tổn thương cho ty thể, đặc biệt là ADN ty thể. Các đột biến trong hệ gen ty thể là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là bệnh cơ não ở người, các bệnh này có thể là nguyên nhân kéo theo nhiều bệnh khác nghiêm trọng hơn, ảnh hưởng rất nhiều tới đời sống con người. Trong số các gen ty thể, gen MT-TK và ND6 được quan tâm nghiên cứu bởi sự đột biến gen MT-TK được khẳng định liên quan đến nhiều bệnh ty thể khác nhau, với các hội chứng bao gồm tiểu đường và điếc di truyền theo dòng mẹ (mateARNlly inherited diabetes and deafness – MIDD), hội chứng động kinh giật cơ với các sợi cơ đỏ rách nham nhở (myoclonic epilepsy with ragged-red fibers – MERRF), hội chứng não giật cơ, tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes -MELAS). Còn gen ND6 được coi là “điểm nóng” đột biến của hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy).

Các đột biến trên hai gen này phần lớn là các đột biến điểm thay thế đồng hoán hay dị hoán. Các đột biến thay thế nucleotit có thể được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật phân tích ADN khác nhau, trong đó RFLP-PCR là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp, giúp sàng lọc nhanh đột biến ở các mẫu bệnh phẩm mà không cần quá nhiều thiết bị phức tạp. Để thiết lập quy trình sàng lọc đột biến điểm là thay thế nucleotit bằng RFLP-PCR, các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột biến là cần thiết được tạo ra. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể” nhằm tạo ra một số đối chứng dương mang đột biến cần xác định cho các phản ứng sàng lọc các đột biến trên gen ND6 và trên gen MT-TK.

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học – Khoa Sinh học và phòng Genomic - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu trúc và chức năng của ty thể ngƣời 1. Cấu trúc của ty thể Cơ thể con người là một thể thống nhất, bao gồm rất nhiều cơ quan, hệ cơ quan khác nhau.

Mỗi cơ quan đảm nhận một nhiệm vụ riêng, nhưng tất cả đều được cấu tạo bằng các tế bào, nên tế bào được coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Ty thểlàmột trong những bào quan có mặt trong tất cả các tế bào nhân thực. Vai trò chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào. Ty thể bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX.

Năm 1857, nhà giải phẫu học người Thụy Sĩ, Kolliker lần đầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế bào cơ. Năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard Altmann, bằng phương pháp nhuộm fuchsine đã quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi quang học[13]. Hình dạng đặc trưng của ty thể là thon dài với đường kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có hình dạng và kích thước khác nhau.

Ty thể có khả năng thay đổi kích thước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý trong tế bào [13]. Trong tế bào, ty thể nằm rải rác ở nguyên sinh chất nhưng cũng có thể nằm tập trung ở khu vực cần nhiều năng lượng như đuôi của tinh trùng. Số lượng của ty thể ở một tế bào cũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của tế bào đó, có thể từ vài ty thể ở tế bào da cho đến vài nghìn ty thể ở tế bào cơ [13].

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc của ty thể [61] Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, tương tự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai màng được gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền tạo thành các mào răng lược [8; 19].

Màng ngoài ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và lipid chiếm khoảng 40%. Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các chất với khối lượng phân tử lớn đến 10 kDa và các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngược lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [8]. Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lượng nhỏ cholesterol.

Tỷ lệ giữa cholesterol và phospholipid là 1/53. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cường vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+.

Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc màng trong của ty thể [33] Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện tử cơ động cho chuỗi hô hấp. Sự giải phóng Cyt c vào bào tương sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình tự chết của tế bào (apoptosis).

Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể. Như vậy, ở tế bào động vật, thực vật và người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể [8; 19]. Khi đạt kích thước lớn tối đa, ty thể tiến hành phân đôi tạo ra hai ty thể mới. Trước tiên, hệ gen ty thể được sao chép để tăng số lượng bản sao.

Sau đó, màng trong thắt lại rồi đến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào [13]. Chức năng của ty thể Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng cho tế bào bằng cách oxy hóa các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2, H2O và giải phóng toàn bộ năng lượng dưới dạng ATP 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Các phản ứng này được xúc tác bởi các phức hợp của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở màng trong của ty thể [17; 23]. Nguồn tạo ra năng lượng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein được lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất này được oxy hóa để tạo ra các chất khử giàu năng lượng, sau đó các đương lượng khử được chuyển thành năng lượng dự trữ ở dạng liên kết phosphate cao năng trong ATP thông qua con đường hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme.

Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [62] ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào [18; 33]. Do đó, khi ty thể bị tổn thương, quá trình sản sinh ra năng lượng để cung cấp cho tế bào và cơ thể bị chậm lại, thậm chí bị ngừng lại hoàn toàn. Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó sự tổn thương của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và cơ quan. Triệu chứng của bệnh ty thể không giống nhau, bởi vì người bệnh có thể có một hỗn hợp ty thể bình thường lẫn ty thể đột biến với sự phân bố riêng trong cơ thể.

Đôi khi, số ty thể bình thường đủ để bù đắp cho những ty thể bị đột biến [19]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể 1. Hệ gen ty thể Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân.

Hệ gen của ty thể người được Clayton mô tả lần đầu tiên vào năm 1976. Đến năm 1981, Anderson đã công bố trình tự và cấu trúc của hệ gen ty thể người [5; 8]. ADN ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đôi, có kích thước 16.569 bp, bao gồm 37 gen (bảng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rARN, 22 phân tử tARN và 13 phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp.