Nghiên cứu đột biến điểm gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể

LỜI CẢM ƠN

MỞ ĐẦU

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể người

1.1.1. Cấu trúc của ty thể

1.1.2. Chức năng của ty thể

1.2. Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể

1.2.1. Hệ gen ty thể

1.2.2. Cơ chế di truyền theo dòng mẹ của các gen ty thể

1.2.3. Heteroplasmy và homoplasmy

1.3. Đột biến gen ty thể và các bệnh liên quan

1.3.1. Đột biến gen ty thể

1.3.2. Một số hội chứng phổ biến do đột biến gen ty thể gây ra

1.3.2.1. Hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy – hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền Leber)

1.3.2.2. Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers – bệnh động kinh co giật cơ với các sợi cơ đỏ rải rác)

1.3.2.3. Hội chứng MELAS (Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like episodes – bệnh viêm não giật cơ có tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch)

1.3.2.4. Hội chứng Leigh (Leigh syndrome – bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)

1.3.3. Gen MT-TK và các đột biến A8344G, T8356C, G8363A

1.3.3.1. Gen MT-TK

1.3.3.2. Gen ND6 và đột biến T14484C

1.4. Một số phương pháp tạo đột biến điểm định hướng

1.4.1. Phương pháp Kunkel

1.4.2. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp

1.4.3. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp PCR

1.4.3.1. Sử dụng PCR truyền thống

1.4.3.2. Sử dụng Primer extention

1.4.3.3. Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR)

1.5. Một số phương pháp phát hiện đột biến điểm

1.5.1. Phát hiện đột biến điểm ADN ty thể bằng PCR-RFLP

1.5.2. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng xác định trình tự gen

1.5.3. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng phương pháp SSCP (Single-stranded conformational polymorphism)

1.6. Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể ở Việt Nam

1.7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

1.7.1. Nội dung nghiên cứu

2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu. Mẫu bệnh phẩm

2.2. Hóa chất, dụng cụ và địa điểm nghiên cứu

2.3. Phương pháp nghiên cứu. Tách chiết ADN tổng số

2.3.1. Quy trình tách chiết

2.3.2. Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết

2.4. Nhân bản các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 bằng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction)

2.5. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism)

2.6. Nhân dòng sản phẩm PCR từ khuôn là ADN bình thường (không chứa các đột biến quan tâm)

2.7. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli và các bước biến nạp, tách chiết plasmid

2.8. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc

2.9. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm

2.9.1. Điện di trên gel agarose

2.9.2. Điện di trên gel polyacrylamide

2.9.3. Giải trình tự

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kiểm tra ADN tổng số của mẫu bệnh phẩm

3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582

3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T

3.4. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp

3.5. Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dòng

3.6. Giải trình tự các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 đã được nhân dòng

3.6.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578

3.6.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366

3.6.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 và ngẫu nhiên phát hiện đột biến mất 9bp trên gen MT-TK

3.6.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582

3.7. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C

3.7.1. PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng

3.7.2. Đóng vòng plasmid dạng thẳng và kiểm tra kết quả biến nạp

3.7.3. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

3.7.4. Tách và kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến

3.7.5. Giải trình tự các plasmid chứa đoạn gen mang đột biến

3.7.5.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C

3.7.5.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G

3.7.5.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C

3.7.5.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A

3.8. Khẳng định sự có mặt của các đột biến A8344G, T8356C, G8363A, T14484C bằng PCR-RFLP

3.8.1. Sàng lọc đột biến T14484C

3.8.2. Sàng lọc đột biến A8344G

3.8.3. Sàng lọc đột biến T8356C

3.8.4. Sàng lọc đột biến G8363A

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về đột biến gen ND6 và MT TK liên quan đến bệnh ty thể

Đột biến gen ND6 và MT-TK là hai yếu tố quan trọng trong nghiên cứu bệnh ty thể. Ty thể đóng vai trò thiết yếu trong việc sản xuất năng lượng cho tế bào. Các đột biến này có thể dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nghiên cứu về chúng giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền và các bệnh liên quan.

1.1. Đột biến gen ND6 và vai trò của nó trong bệnh lý

Gen ND6 được biết đến như một điểm nóng trong các đột biến liên quan đến hội chứng LHON. Đột biến này có thể gây ra các vấn đề về thị giác và ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

1.2. Đột biến gen MT TK và các hội chứng liên quan

Gen MT-TK có liên quan đến nhiều hội chứng như MERRF và MELAS. Những đột biến trong gen này có thể dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng, bao gồm động kinh và rối loạn chức năng thần kinh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu đột biến gen ty thể gặp nhiều thách thức, bao gồm việc phát hiện và phân tích các đột biến. Các phương pháp hiện tại có thể tốn kém và phức tạp, gây khó khăn trong việc sàng lọc nhanh chóng các mẫu bệnh phẩm.

2.1. Khó khăn trong việc phát hiện đột biến

Việc phát hiện các đột biến gen ND6 và MT-TK thường yêu cầu các kỹ thuật phức tạp như RFLP-PCR. Điều này có thể làm tăng chi phí và thời gian nghiên cứu.

2.2. Thách thức trong việc xác định mối liên hệ giữa đột biến và bệnh

Mối liên hệ giữa các đột biến gen và bệnh lý chưa được hiểu rõ. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định chính xác các cơ chế gây bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến gen ND6 và MT TK hiệu quả

Để nghiên cứu đột biến gen ND6 và MT-TK, các phương pháp như PCR và RFLP-PCR được sử dụng rộng rãi. Những phương pháp này giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến trong mẫu bệnh phẩm.

3.1. Phương pháp PCR trong nghiên cứu đột biến

PCR là một kỹ thuật quan trọng giúp nhân bản các đoạn gen cần thiết để phân tích. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các đột biến một cách nhanh chóng và hiệu quả.

3.2. RFLP PCR và ứng dụng của nó

RFLP-PCR là một phương pháp đơn giản và chi phí thấp, giúp sàng lọc nhanh các đột biến gen ND6 và MT-TK mà không cần thiết bị phức tạp.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu về đột biến gen ND6 và MT-TK không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn có thể ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc phát hiện sớm các đột biến có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.1. Chẩn đoán sớm bệnh lý liên quan đến ty thể

Việc phát hiện sớm các đột biến gen có thể giúp chẩn đoán các bệnh lý liên quan đến ty thể, từ đó có phương pháp điều trị kịp thời.

4.2. Hướng tới các phương pháp điều trị mới

Nghiên cứu về đột biến gen có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh lý di truyền.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đột biến gen ty thể

Nghiên cứu về đột biến gen ND6 và MT-TK là một lĩnh vực quan trọng trong di truyền học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc hiểu và điều trị các bệnh lý liên quan đến ty thể.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ hơn về mối liên hệ giữa các đột biến gen và bệnh lý, từ đó phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu di truyền học

Nghiên cứu về đột biến gen ty thể có thể mở ra nhiều hướng đi mới trong lĩnh vực di truyền học, giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng.

Nghiên cứu chế tạo đột biến điểm ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể