MỞ ĐẦU Kháng sinh là những chất kháng khuẩn đƣợc chiết xuất từ các chủng vi sinh vật, nấm, đƣợc tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng ức chế vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác một cách đặc hiệu. Nhờ có thuốc kháng sinh đã giúp kiểm soát đƣợc nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra. Kháng sinh là nhóm thuốc thiết yếu trong y học, quan trọng nhất là nhóm β-lactam gồm các kháng sinh có cấu trúc hóa học chứa vòng β-lactam. Sự liên kết của vòng này với các cấu trúc khác sẽ hình thành các phân nhóm khác nhau nhƣ: penicilin, cephalosporin và các β-lactam khác.
Lƣợng kháng sinh β-lactam đang sử dụng trong y học là rất lớn và phổ biến với nhiều chế phẩm khác nhau trên thị trƣờng. Trên thế giới, nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt ở các nƣớc đang phát triển, vì nhiễm khuẩn n m trong số những bệnh lý hàng đầu cả về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong. Theo tổ chức y tế Thế giới (WHO), Việt Nam đƣợc xếp vào nhóm các nƣớc có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất và thuộc nhóm sử dụng nhiều kháng sinh nhất [3,8,20]. Yếu tố chính quyết định đến chất lƣợng thuốc kháng sinh là hàm lƣợng các hoạt chất chính có trong thuốc.
Nếu hàm lƣợng vƣợt quá mức cho phép sẽ gây ra tình trạng nhờn thuốc, kháng thuốc và làm mất tác dụng của thuốc. Nếu hàm lƣợng hoạt chất chính bị thiếu so với quy định sẽ không đủ hiệu lực để có thể kháng lại các vi khuẩn gây bệnh và cũng làm giảm hoặc mất tác dụng của thuốc. Do đó, việc kiểm nghiệm hàm lƣợng các hoạt chất trong mẫu thuốc đóng vai trò rất quan trọng. Một số phƣơng pháp đƣợc dùng để phân tích riêng rẽ hoặc đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong mẫu thuốc nhƣ: Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), phƣơng pháp điện hóa, phƣơng pháp sắc ký (HPLC), phƣơng pháp điện di mao quản (CE).
Để giảm chi phí và tiết kiệm thời gian phân tích thì việc xây dựng các phƣơng pháp định lƣợng đồng thời nhiều kháng sinh nhóm β-lactam là rất cần thiết. Nhận thấy phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) có tiềm năng trong việc kiểm nghiệm thuốc, nguyên liệu và bán thành phẩm thuốc, cũng nhƣ các hoạt chất kháng sinh trong thuốc. Do có nhiều ƣu điểm nhƣ thời gian phân tích nhanh, chính xác, xử lý mẫu đơn giản, thiết bị nhỏ gọn phù hợp để phân tích ngay tại hiện trƣờng. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh β-lactam bằng phương pháp diện di mao quản sử dụng detector (CE-C4D)” đƣợc lựa chọn, với hi vọng sẽ góp một phần nhỏ vào việc xây dựng quy trình kiểm nghiệm các hoạt chất kháng sinh trong một số mẫu thuốc đang lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay.
1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ngoài ra, cũng hƣớng đến mục tiêu áp dụng một cách linh hoạt, hiệu quả quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm và/ hoặc ở các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh, gồm các thuốc đơn hoạt chất và thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về kháng sinh Kháng sinh từ khi ra đời đã trở thành một loại thuốc thiết yếu, một công cụ hỗ trợ cho sức khỏe con ngƣời, góp phần đẩy lùi nhiều loại bệnh tật và cứu sống hàng trăm triệu ngƣời trên khắp thế giới. Sự kiện Alexander Fleming phát hiện ra penicillin (1928) đƣợc đánh giá là một trong những thành tựu vĩ đại nhất trong lịch sử y học hiện đại và mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [22].
Waksman năm 1942 đã phát hiện ra streptomycin và đƣa ra định nghĩa: “Một chất kháng sinh hay một chất có tính kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác”. Baron năm 1950 đã bổ sung nhƣ sau: “Kháng sinh là những chất đƣợc tạo ra bởi những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự phát triển hay tồn tại của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”. Hiện nay quan niệm về kháng sinh đã mở rộng hơn: “Kháng sinh là các chất có nguồn gốc tự nhiên từ vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổng hợp, ở liều điều trị có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật ở nồng độ thấp”. Kháng sinh đƣợc chia làm ba loại: Kháng sinh phổ rộng (có hoạt tính trên nhiều loại vi khuẩn khác nhau), kháng sinh phổ hẹp (có hoạt tính trên một số ít vi khuẩn), kháng sinh đặc hiệu (chỉ tác dụng trên một loại hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định).
Chia theo nhóm gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ: β-lactam, Aminosid, Macrolid, Tetracyclin, Peptid … Trong số các nhóm chính đƣợc chia ra các phân nhóm nhỏ hơn nhƣ: β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem, monobactam), Peptid (glycopeptid, lipopeptid,…), … Trong đó nhóm quan trọng nhất là β-lactam. Tổng quan về các kháng sinh nhóm β-lactam Kháng sinh nhóm β-lactam là các kháng sinh mà phân tử chứa các dạng vòng β-lactam. Gồm các phân nhóm: Vòng có 5 cạnh bão hòa gồm các penicillin, vòng có 6 cạnh không bão hòa gồm các cephalosporin, vòng có 5 cạnh không bão hòa gồm các imipenem và ertapene, các monobactam không có vòng. Trong đó hai phân nhóm đƣợc sử dụng nhiều và phổ biến nhất là phân nhóm penicillin và cephalosporin.
+ Phân nhóm penicillin (penicillin G, procaine penicillin, benzathine penicillin, penicillin V), đƣợc Fleming tìm ra từ năm 1928 thu đƣợc từ nấm Penicillium hay đƣợc điều chế bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Phân nhóm cephalosporin đƣợc chiết xuất từ nấm Cephalosporium acremonium hoặc bán tổng hợp, đều là dẫn xuất của axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) có mang vòng β-lactam, tùy theo tác dụng kháng khuẩn chia thành 4 thế hệ [1,2,12]. Các kháng sinh này là các hoạt chất chính trong trong các mẫu dƣợc phẩm, có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, nhờ đó mà ta điều trị và loại bỏ đƣợc nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra, các hoạt chất chính này đƣợc công bố trên nhãn sản phẩm. Vì vậy, cần thiết phải định lƣợng các hoạt chất này nh m kiểm chứng chất lƣợng của sản phẩm kháng sinh, làm căn cứ cho việc điều trị.
Phân loại, cấu trúc của các kháng sinh nhóm β-lactam a) Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: Vòng β-lactam gắn kết với vòng thiazolidin và quyết định hoạt tính của kháng sinh, có 5 nhóm khác nhau. Sự kết hợp này làm cho vòng β-lactam hoạt động hơn so với từng vòng β-lactam riêng biệt. S R CO N 4 CH3 H 6 5 3 7 1 N 2 CH3 O COOM Hình 1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung của các penicillin khi chƣa có gốc R là: (2S,5R,6R3)3-dimethyl-7- oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế gốc R b ng các gốc khác nhau, thƣờng là các cation (K, Na, H), thì thu đƣợc các penicilin khác nhau có độ bền, dƣợc động học và phổ kháng khuẩn khác nhau [1,2].
Dựa vào nguần gốc có thể sắp xếp các penicillin thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau và đƣợc trình bày ở Bảng 1. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phân loại, cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính Gồm các Penicillin nguồn gốc tự nhiên, Nhóm penicillin tự CH 2- nhiên (nhóm I) Penicillin G không kháng (PENG) Penicillinase. Phổ hẹp: Benzathin Vi khuẩn gram (+), đại Benzyl diện Penicillin G và Penicillin V CH3 Nhóm penicillin kháng penicilliiase (nhóm II) C- Oxacillin Gồm các Penicillin bán N O (OXA) tổng hợp.
Phổ kháng 6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4- khuẩn hẹp hơn carbonyl)amino] Penicillin G, nhƣng có O khả năng kháng Cl N C- Penicilliiase, không tác động vào vòng Cloxacillin CH3 (CLO) β-lactam. 6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl- oxazole-4-carbonyl]amino} NH2 NH2 Gồm các Penicillin bán Nhóm penicillin phổ rộng (nhóm III) CH- tổng hợp phổ rộng, tác Ampicillin dụng cả khuẩn gram (+) (AMP) và (-) mà các Penicillin 6-([(2R)-2-amino-2- nhóm II ít tác dụng. phenylacetyl]amino) Không kháng 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NH2 NH2 β-lactamase và CH- penicilliiase Amoxicillin HO (AMO) 6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)- acetyl]amino} b) Các cephalosporin Cephalosporin đƣợc Abraham và các cộng sự (1948) đã phân lập ra từ Cephalosporium acremonium, các Cephalosporin hiện nay đƣợc chia thành 4 thế hệ do sự thay đổi các nhóm thế khác nhau đã thu đƣợc các kháng sinh mới có hoạt tính tốt hơn. Tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram (+) nhƣng tác dụng yếu trên vi khuẩn gram (-), đồng thời là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều nhất trên lâm sàng hiện nay và có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng 1 dị vòng 6 cạnh và vòng β-lactam 4 cạnh.
R2 S R1 CO N 1 7 6 2 H 8 3 N5 4 R3 O COOM Hình 1. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chƣa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia- 1-azabicyclo[4.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Từ công thức ta thấy khi thay đổi các gốc R thì thu đƣợc các cephalosporin mới có đồ bền, dƣợc động học và tính kháng khuẩn khác nhau [1,2]. Tính chất, cơ chế, độc tính và phạm vi điều trị của các kháng sinh β-lactam a) Tính chất: Các kháng sinh β-lactam thƣờng kết tinh ở dạng bột màu trắng hoặc màu vàng (Cefixime), đa phần chứa đồng thời hai nhóm (–COOH) và (–NH2), do đó dễ tan trong dung dịch axit và kiềm loãng, dạng axit ít tan trong nƣớc, ở dạng muối natri và kali dễ tan, tan đƣợc cả trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Các kháng sinh β-lactam nhóm axit (–COOH) có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân tử.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác nhau làm cho dạng phổ thay đổi khác nhau. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com b) Cơ chế: Các penicillin diệt khuẩn b ng cách can thiệp vào sự phát triển của vi khuẩn, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không đƣợc thực hiện. Khi vi khuẩn phân chia phát triển, chúng phải tạo ra màng tế bào nhờ một enzym xúc tác đặc biệt. Enzym này là một chuỗi amino axit và penicillin cắt đứt tiến trình hình thành, sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại.
Do đó, penicillin đã tranh mất các vị trí phản ứng của tiền chất tạo enzym nên enzym sẽ không hình thành, có nghĩa là màng tế bào không đƣợc tái tạo, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.