Luận án đặc điểm dịch tễ lâm sàng yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do clostridium difficile tại người lớn tại bệnh viện bạch mai 2013 2017

Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ lâm sàng và yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do Clostridium difficile tại Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2013-2017.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hương Giang
• Trường học: Bệnh viện Bạch Mai
• Đề tài: Nghiên cứu dịch tễ và yếu tố nguy cơ tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai (2013-2017)
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Một số điểm đại cương về tiêu chảy do Clostridium difficile
• 1.2. Vi khuẩn Clostridium difficile
• 1.3. Tiêu chảy do Clostridium difficile
• 1.4. Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.
• 1.5. Dịch tễ bệnh tiêu chảy do Clostridium difficile
• 1.6. Lâm sàng bệnh do Clostridium difficile
• 1.7. Yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.
• 1.7.1. Yếu tố vật chủ
• 1.7.2. Yếu tố bên ngoài
• 1.8. Đặc điểm phân bố kiểu gen của Clostridium difficile
• 1.9. Cấu trúc phân tử của Clostridium difficile
• 1.10. Sự phân bố một số kiểu gen của C.
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu và chọn mẫu
• 2.6. Thu thập đối tượng nghiên cứu
• 2.7. Vật liệu nghiên cứu
• 2.8. Thu thập mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật xét nghiệm
• 2.9. Các biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.10. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.11. Khống chế sai số
• 2.12. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017
• 3.2. Đặc điểm dịch tễ tiêu chảy do C.
• 3.3. Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy do C.
• 3.4. Một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 3.4.1. Các yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile qua phân tích đơn biến
• 3.4.2. Yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn trong phân tích đa biến
• 3.5. Một số đặc điểm phân bố kiểu gen của C.difficile gây tiêu chảy ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 3.5.1. Các gen sinh độc tố của C.
• 3.5.2. Đặc điểm về kiểu gen ribotype của C.
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017
• 4.1.1. Đặc điểm dịch tễ tiêu chảy do C.
• 4.1.2. Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy do C.
• 4.1.3. Một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 4.2. Một số đặc điểm phân bố kiểu gen của C.difficile gây tiêu chảy ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 4.2.1. Đặc điểm về loại gen sinh độc tố của C.
• 4.2.2. Đặc điểm về kiểu gen ribotype của C.
• MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghiên cứu dịch tễ và yếu tố nguy cơ tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai từ năm 2013 đến 2017 đã chỉ ra rằng tiêu chảy do C.difficile là một vấn đề nghiêm trọng trong y tế công cộng. Clostridium difficile là một vi khuẩn kỵ khí, có khả năng gây ra các triệu chứng từ nhẹ đến nặng, bao gồm viêm đại tràng giả mạc. Tình hình dịch tễ cho thấy tỷ lệ mắc bệnh tăng cao, đặc biệt ở người cao tuổi và những người có bệnh lý nền. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu mô tả các đặc điểm dịch tễ, lâm sàng và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh. Việc hiểu rõ về tình trạng bệnh nhân và các yếu tố nguy cơ sẽ giúp cải thiện công tác chẩn đoán và điều trị, đồng thời nâng cao nhận thức về bệnh lý này trong cộng đồng.

II. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHẢY DO CLOSTRIDIUM DIFFICILE

Tiêu chảy do Clostridium difficile đã trở thành một vấn đề y tế nghiêm trọng trong những năm gần đây. Vi khuẩn này có khả năng sinh độc tố, gây ra các triệu chứng tiêu chảy nặng nề. Theo các nghiên cứu, yếu tố nguy cơ chính bao gồm việc sử dụng kháng sinh, tuổi tác và tình trạng sức khỏe tổng quát của bệnh nhân. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng nhiễm trùng Clostridium thường xảy ra ở những bệnh nhân nằm viện, đặc biệt là những người có bệnh lý mạn tính. Việc xác định các yếu tố nguy cơ này là rất quan trọng để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Bạch Mai với thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu là những bệnh nhân người lớn mắc tiêu chảy do C.difficile trong khoảng thời gian từ 2013 đến 2017. Dữ liệu được thu thập từ hồ sơ bệnh án và các xét nghiệm vi sinh. Các biến số được phân tích bao gồm tuổi, giới tính, tiền sử bệnh lý và sử dụng kháng sinh. Phân tích thống kê được thực hiện để xác định mối liên hệ giữa các yếu tố nguy cơ và tình trạng bệnh. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc về tình hình dịch tễ của bệnh tại Việt Nam.

IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự gia tăng đáng kể số ca mắc tiêu chảy do C.difficile trong giai đoạn nghiên cứu. Các yếu tố như tuổi tác, tình trạng sức khỏe và tiền sử sử dụng kháng sinh có mối liên hệ chặt chẽ với nguy cơ mắc bệnh. Đặc biệt, bệnh nhân trên 65 tuổi có tỷ lệ mắc cao hơn so với nhóm tuổi trẻ hơn. Phân tích gen cho thấy sự phân bố kiểu gen của C.difficile cũng có sự khác biệt rõ rệt giữa các bệnh nhân. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về dịch tễ học của bệnh mà còn giúp định hướng cho các biện pháp can thiệp y tế.

V. BÀN LUẬN

Bàn luận về các kết quả nghiên cứu cho thấy Clostridium difficile là một tác nhân gây bệnh quan trọng trong môi trường bệnh viện. Các yếu tố như tuổi tác, bệnh lý nền và sử dụng kháng sinh là những yếu tố chính làm tăng nguy cơ mắc bệnh. Việc nhận diện và quản lý các yếu tố này có thể giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cần có các chương trình giám sát và phòng ngừa hiệu quả hơn để kiểm soát sự lây lan của C.difficile trong cộng đồng và bệnh viện.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nhiễm trùng do vi khuẩn kỵ khí sinh nha bào Clostridium difficile (hiện được định danh là Clostridioides difficile) đã trở thành một trong những thách thức y tế công cộng nghiêm trọng nhất đầu thế kỷ 21, đặc biệt tại các cơ sở điều trị nội trú tuyến cuối. Trong khi các hệ thống y tế tại Bắc Mỹ và Châu Âu ghi nhận hàng trăm nghìn ca mắc, hàng chục nghìn ca tử vong mỗi năm cùng sự bùng phát của các chủng siêu độc lực như NAP1/027/BI hay Ribotype 078 (Bartlett, 1978; Loo et al., 2005; Kuijper et al., 2006), bức tranh dịch tễ học và sinh học phân tử của tác nhân này tại Việt Nam trong một thời gian dài vẫn tồn tại khoảng trống nghiên cứu mang tính hệ thống.

Khoảng trống khoa học (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực trạng: "Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh liên quan đến C.difficile, do hầu hết các bệnh viện chưa thực hiện được xét nghiệm. C.difficile chỉ nuôi cấy được ở môi trường kỵ khí tuyệt đối, và phải tìm thấy độc tố mới có thể khẳng định chẩn đoán nó là nguyên nhân gây tiêu chảy". Khó khăn về hạ tầng nuôi cấy kỵ khí và kỹ thuật sinh học phân tử đã dẫn đến tình trạng bỏ sót chẩn đoán, thiếu hụt dữ liệu dịch tễ học lâm sàng và chưa nhận diện được cấu trúc kiểu gen của các chủng vi khuẩn đang lưu hành tại các bệnh viện đa khoa tuyến cuối ở Việt Nam.

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Hương Giang (2020) được xây dựng nhằm giải quyết 3 câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu trọng tâm:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Tỷ lệ hiện mắc, đặc điểm dịch tễ học theo thời gian/không gian và biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của tiêu chảy do C. difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2013–2017 có đặc trưng gì?
   • Giả thuyết 1 (H1): C. difficile là tác nhân phổ biến gây tiêu chảy nhiễm trùng bệnh viện (HO-HCFA), liên quan mật thiết đến tình trạng nặng, sốt cao, tăng bạch cầu, giảm albumin máu và tổn thương viêm đại tràng giả mạc.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Những yếu tố phơi nhiễm iatrogenic (y sinh) và bệnh lý nền nào đóng vai trò là yếu tố nguy cơ độc lập làm gia tăng khả năng mắc tiêu chảy do C. difficile?
   • Giả thuyết 2 (H2): Tiền sử sử dụng kháng sinh phổ rộng (Cephalosporins, Quinolones, Carbapenems), tiền sử nằm viện trong vòng 8 tuần trước đó, tuổi cao ($\ge 60$ tuổi) và các bệnh mạn tính (suy thận, đái tháo đường, suy giảm miễn dịch) làm tăng nguy cơ mắc bệnh với tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$).
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Đặc điểm cấu trúc vùng gen gây bệnh PaLoc (tcdA, tcdB, tcdC, tcdD, tcdE) và các kiểu gen PCR ribotype của các chủng C. difficile phân lập tại miền Bắc Việt Nam có tương đồng với các chủng dịch tễ học phân tử ở Châu Á và thế giới hay không?
   • Giả thuyết 3 (H3): Các chủng lưu hành mang kiểu gen đột biến mất đoạn gen sinh độc tố A ($A^-B^+$) và các ribotype đặc trưng khu vực Châu Á (như Ribotype 017) chiếm ưu thế so với chủng ribotype 027 của phương Tây.

Khung lý thuyết của nghiên cứu được định vị trên nền tảng Thuyết Phá vỡ Hàng rào Đề kháng Cư trú Đường ruột (Disruption of Colonization Resistance Theory) kết hợp với Thuyết Độc lực Phân tử Locus Gây bệnh PaLoc (Pathogenicity Locus Virulence Theory). Quy mô nghiên cứu được tiến hành trên 101 bệnh nhân tiêu chảy do C. difficile khẳng định vi sinh/sinh học phân tử và 273 bệnh nhân nhóm chứng trong khung thời gian 5 năm (2013–2017) tại Bệnh viện Bạch Mai và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, tạo lập cơ sở dữ liệu dịch tễ học - phân tử có giá trị khoa học và thực tiễn lâm sàng đột phá tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về C. difficile trong y văn quốc tế trải qua ba dòng chảy học thuật chính. Dòng chảy kinh điển khởi đầu từ công trình đột phá của Bartlett et al. (1978), xác lập mối liên hệ nhân quả giữa độc tố ruột của C. difficile với bệnh cảnh viêm đại tràng giả mạc sau điều trị clindamycin. Dòng chảy dịch tễ học phân tử bùng nổ từ đầu thập niên 2000 khi Loo et al. (2005) tại Quebec (Canada) và Kuijper et al. (2006) tại Châu Âu chứng minh sự lây lan toàn cầu của chủng BI/NAP1/027 mang độc tố kép (binary toxin CDT) và đột biến mất đoạn 18-bp trên gen điều hòa âm tcdC, dẫn đến việc tăng sản xuất độc tố A và B gấp nhiều lần, gây tỷ lệ tử vong từ 11% đến 22%. Dòng chảy thứ ba tập trung vào khu vực Đông Á và Đông Nam Á (Kim et al., 2008; Collins et al., 2013; Fatima, 2019), chỉ ra sự thống trị của chủng đột biến $A^-B^+$ (chủ yếu là Ribotype 017) chiếm 23%–48% các chủng gây bệnh, thách thức quan điểm cho rằng chỉ có độc tố A mới là yếu tố độc lực khởi phát tổn thương niêm mạc ruột.

Cuộc tranh luận học thuật sâu sắc nhất trong y văn tập trung vào vai trò tương đối của Toxin A (tcdA) và Toxin B (tcdB). Trường phái nghiên cứu ban đầu khẳng định độc tố A là yếu tố mở đường bắt buộc gây tổn thương biểu mô để độc tố B xâm nhập (Lyras et al., 2009). Tuy nhiên, các nghiên cứu thực nghiệm sau đó của Kuehne et al. (2010) cùng các quan sát lâm sàng tại Châu Á đối với chủng Ribotype 017 đã chứng minh độc tố B mới là yếu tố độc lực thiết yếu gây hoại tử tế bào, phá vỡ khung xương tế bào actin và gây viêm đại tràng giả mạc nặng dù hoàn toàn thiếu vắng độc tố A nguyên vẹn.

                  +-------------------------------------------------------------+
                  |           DÒNG CHẢY HỌC THUẬT QUỐC TẾ & VỊ THẾ            |
                  +-------------------------------------------------------------+
                                                 |
         +---------------------------------------+---------------------------------------+
         |                                       |                                       |
+------------------+                   +--------------------+                  +--------------------+
|  Phương Tây      |                   |  Châu Á (Đông Á /  |                  |  Việt Nam          |
|  (Bắc Mỹ, Âu)    |                   |  Đông Nam Á)       |                  |  (Luận án)         |
|  - NAP1/027/BI   |                   |  - Ribotype 017    |                  |  - Đột biến A-B+   |
|  - Ribotype 078  |                   |  - Chủng A-B+      |                  |  - Ribotype trf,   |
|  - Độc tố kép    |                   |  - Tỷ lệ: 23%-48%  |                  |    017, 001        |
|    (CDT)         |                   |                    |                  |  - 101 ca khẳng    |
+------------------+                   +--------------------+                  |    định vi sinh    |
                                                                               +--------------------+

Trong bức tranh tổng thể đó, luận án xác lập vị thế tiên phong khi đặt nghiên cứu trong sự so sánh trực tiếp với hai bối cảnh dịch tễ quốc tế:

1. Mô hình dịch bệnh tại Bắc Mỹ/Châu Âu (Pépin et al., 2005; Warny et al., 2005): Nơi dịch bệnh gắn liền với chủng NAP1/027 đề kháng fluoroquinolones thế hệ mới và tỷ lệ tử vong 30 ngày lên tới 13,2%.
2. Mô hình dịch tễ Đông Á tại Hàn Quốc và Nhật Bản (Kim et al., 2008; Kato et al., 2007): Nơi tỷ lệ chủng $A^-B^+$ tăng từ dưới 5% lên 50% trong giai đoạn 2000–2004 và chủng smz/018, 017 chiếm đa số.

Công trình của Nguyễn Thị Hương Giang đã chứng minh cấu trúc sinh thái phân tử tại Việt Nam mang đặc tính tương đồng với dịch tễ học Đông Á, cung cấp bằng chứng thực nghiệm giải mã cơ chế gây bệnh của các biến chủng thiếu hụt tcdA trong điều kiện lạm dụng kháng sinh tại các bệnh viện đa khoa tuyến cuối miền Bắc.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc ba lý thuyết sinh học y học quan trọng:

1. Thuyết Cấu trúc Vùng gen Gây bệnh PaLoc (Pathogenicity Locus Theory): Vùng gen PaLoc dài 19,6 kb gồm 5 gen: tcdA (8.130 bp), tcdB (7.098 bp), tcdC (696 bp - điều hòa âm), tcdD (552 bp - điều hòa dương), và tcdE (498 bp - protein tạo lỗ giải phóng độc tố). Luận án bổ sung bằng chứng thực nghiệm xác nhận sự tồn tại của đột biến mất đoạn 1,8 kb ở đầu 3' vùng lặp lại của gen tcdA trên các chủng phân lập tại Việt Nam, tạo ra sản phẩm khuếch đại 110 bp thay vì 369 bp ở chủng hoang dại $A^+B^+$. Điều này củng cố luận điểm lý thuyết rằng việc mất đoạn chức năng ở tcdA không làm triệt tiêu khả năng gây tổn thương mô học nghiêm trọng nếu gen tcdB vẫn được bảo tồn và biểu hiện mạnh mẽ.

2. Thuyết Rối loạn Cân bằng Vi sinh Đường ruột (Gut Microbiota Dysbiosis Theory): Mở rộng mô hình của Buffie & Pamer (2013) về động học muối mật. Kháng sinh phổ rộng tiêu diệt vi khuẩn kỵ khí bản địa có khả năng chuyển hóa muối mật nguyên phát (cholate - chất kích thích nha bào nảy mầm) thành muối mật thứ phát (deoxycholate - chất ức chế sinh trưởng C. difficile). Sự gia tăng nồng độ cholate tự do tạo điều kiện cho nha bào C. difficile kháng nhiệt, kháng cồn nảy mầm tại hồi tràng và đại tràng.

3. Mô hình Tương tác Độc lực - Miễn dịch Vật chủ (Host-Pathogen Immunological Interaction Model): Chứng minh rằng nồng độ kháng thể IgG huyết thanh kháng độc tố và tình trạng suy giảm miễn dịch (giảm tế bào lympho ở bệnh nhân suy thận mạn, xơ gan, đái tháo đường) là biến số quyết định sự chuyển biến từ trạng thái người lành mang trùng không triệu chứng sang hội chứng viêm đại tràng giả mạc bão hòa cytokine ($IL-8$, $TNF-\alpha$).

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp mô hình dịch tễ học tam giác kinh điển (Vật chủ – Tác nhân – Môi trường) với tiếp cận di truyền học phân tử đa cấp độ:

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                            KHUNG PHÂN TÍCH ĐA CẤP ĐỘ                              |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

   [YẾU TỐ VẬT CHỦ (HOST)]              [TÁC NHÂN VI SINH (AGENT)]
   - Tuổi cao (>= 60 tuổi)              - Chủng C. difficile A+B+ hoặc A-B+
   - Bệnh mạn tính: Suy thận, ĐTĐ       - Đột biến mất đoạn 1.8 kb gen tcdA
   - Tình trạng suy giảm miễn dịch      - Đa dạng PCR Ribotype (017, trf, 001, og39)
   - Giảm Albumin máu (< 25 g/L)        - Sức đề kháng nha bào với sát khuẩn cồn
              \                                    /
               \                                  /
                v                                v
            +----------------------------------------+
            | MÔI TRƯỜNG & CAN THIỆP Y SINH          |
            | - Nằm viện nội trú > 8 tuần            |
            | - Sử dụng kháng sinh phổ rộng          |
            | - Ức chế bơm proton (PPI), thủ thuật   |
            +----------------------------------------+
                                 |
                                 v
            +----------------------------------------+
            | KẾT CỤC LÂM SÀNG & SINH BỆNH HỌC       |
            | - Tiêu chảy cấp / kéo dài              |
            | - Viêm đại tràng giả mạc nội soi       |
            | - Tăng bạch cầu máu (> 15 G/L)         |
            | - Nguy cơ sốc nhiễm khuẩn, tử vong     |
            +----------------------------------------+

Khung phân tích thiết lập các điều kiện biên (boundary conditions):

• Phạm vi áp dụng: Quần thể bệnh nhân nội trú người lớn ($\ge 15$ tuổi) tại các bệnh viện đa khoa tuyến cuối có phơi nhiễm điều trị y khoa.
• Tiêu chuẩn vi sinh tuyệt đối: Chỉ xác lập ca bệnh khi có đồng thời triệu chứng tiêu chảy lâm sàng ($\ge 3$ lần phân lỏng/24h) và bằng chứng vi sinh kép (nuôi cấy kỵ khí dương tính kết hợp PCR khẳng định gen sinh độc tố tcdA/tcdB).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên lập trường thực chứng luận (positivism) với phương pháp dịch tễ học định lượng nghiêm ngặt kết hợp sinh học phân tử phòng thí nghiệm. Thiết kế nghiên cứu bao gồm 3 cấu phần tương ứng với 3 mục tiêu:

1. Nghiên cứu dịch tễ học mô tả chuỗi ca bệnh (Case series): Đánh giá đặc điểm dịch tễ và lâm sàng trên toàn bộ 101 bệnh nhân tiêu chảy do C. difficile sinh độc tố được chẩn đoán tại Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2013–2017.
2. Nghiên cứu bệnh – chứng ghép cặp (Matched Case-Control Study): Xác định yếu tố nguy cơ với tỷ lệ ca bệnh : ca chứng là 1:3. Nhóm bệnh gồm 91 ca được ghép cặp chính xác với 273 ca chứng (bệnh nhân tiêu chảy nội trú cùng khoa điều trị, cùng năm xuất hiện tiêu chảy, cùng giới tính nhưng có kết quả cấy phân tìm C. difficile âm tính).
3. Nghiên cứu sinh học phân tử in vitro: Khảo sát đặc điểm di truyền trên toàn bộ các chủng vi khuẩn phân lập được thông qua hệ thống phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đa mồi và phân tích kiểu gen PCR ribotype.

                    +-------------------------------------------------------+
                    |             QUY TRÌNH PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU          |
                    +-------------------------------------------------------+
                                                |
          +-------------------------------------+-------------------------------------+
          |                                     |                                     |
+-------------------+                 +--------------------+                +--------------------+
|  Mục tiêu 1       |                 |  Mục tiêu 2        |                |  Mục tiêu 3        |
|  Mô tả lâm sàng / |                 |  Nghiên cứu Bệnh - |                |  Phân tích kiểu    |
|  dịch tễ          |                 |  Chứng (1:3)       |                |  gen phân tử       |
|  - N = 101 ca     |                 |  - 91 ca bệnh      |                |  - PCR đa mồi      |
|  - Nuôi cấy kỵ khí|                 |  - 273 ca chứng    |                |    (tpi, tcdA, B)  |
|  - Tiêu chuẩn     |                 |  - Ghép cặp: khoa, |                |  - PCR Ribotyping  |
|    IDSA / SHEA    |                 |    năm, giới       |                |    16S-23S rRNA    |
+-------------------+                 +--------------------+                +--------------------+

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý bệnh phẩm tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn vi sinh kỵ khí quốc tế:

• Tiêu chuẩn chọn mẫu: Bệnh nhân $\ge 15$ tuổi điều trị tại các khoa lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai, đại tiện phân lỏng $\ge 3$ lần trong 24 giờ, cấy phân phân lập được C. difficile và PCR khẳng định mang gen độc tố (tcdA và/hoặc tcdB).
• Hệ thống nuôi cấy kỵ khí chuyên dụng: Bệnh phẩm phân được vận chuyển nhanh và xử lý trong Tủ kỵ khí BugBox Plus (Hãng Baker Ruskinn – Vương quốc Anh) với hỗn hợp khí chuẩn: $80% N_2, 10% CO_2, 10% H_2$. Thao tác phòng thí nghiệm bắt buộc hoàn thành trong thời gian dưới 20 phút để bảo toàn khả năng sống của tế bào sinh dưỡng vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối.
• Môi trường chọn lọc: Sử dụng thạch Cefoxitin-Cycloserine Fructose Agar (CCFA) và Cefoxitin-Cycloserine Mannitol Agar (CCMA), có bổ sung hóa chất kích thích nảy mầm nha bào như taurocholate và lysozyme, ủ kỵ khí ở 37°C trong 48 giờ.
• Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR): Thiết kế đồng thời 3 cặp mồi khuếch đại:
  • Mồi đặc hiệu loài tpi (triose phosphate isomerase - gen housekeeping): Cặp mồi tpi-F (5'-AAAGAAGCTACTAAGGGTACAAA-3') và tpi-R (5'-CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3'), kích thước sản phẩm 230 bp.
  • Mồi phát hiện biến chủng tcdA: Cặp mồi tcdA-F (5'-AGATTCCTATATTTACATGACAATAT-3') và tcdA-R (5'-GTATCAGGCATAAAGTAATATACTTT-3'), tạo sản phẩm 369 bp cho chủng hoang dại $A^+B^+$ và sản phẩm 110 bp cho chủng đột biến mất đoạn 1,8 kb ($A^-B^+$).
  • Mồi phát hiện tcdB: Cặp mồi tcdB-F (5'-GGAAAAGAGAATGGTTTTATTAA-3') và tcdB-R (5'-ATCTTTAGTTATAACTTTGACATCTTT-3'), tạo sản phẩm 160 bp.
• PCR Ribotyping: Khuếch đại vùng đệm không phiên mã 16S–23S rRNA để so sánh kiểu băng điện di với các thư viện chủng chuẩn quốc tế.

Data và phân tích

Số liệu được nhập liệu bằng phần mềm EpiData và xử lý bằng phần mềm thống kê sinh học SPSS. Phân tích thống kê triển khai qua hai giai đoạn:

1. Phân tích đơn biến: Sử dụng kiểm định $\chi^2$ (Chi-square) và Fisher's exact test để so sánh tỷ lệ giữa các nhóm, tính tỷ suất chênh thô (Crude Odds Ratio - cOR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI).
2. Phân tích đa biến: Ứng dụng mô hình Hồi quy Logistic Đa biến (Multivariate Binary Logistic Regression) để kiểm soát các yếu tố gây nhiễu (confounders), tính tỷ suất chênh hiệu chỉnh (Adjusted Odds Ratio - aOR) nhằm xác định các yếu tố nguy cơ độc lập. Mức ý nghĩa thống kê được xác lập tại $p < 0,05$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Đặc trưng dịch tễ học lâm sàng tại bệnh viện tuyến cuối: Trong 101 ca bệnh tiêu chảy do C. difficile, đa số là các ca nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế xuất hiện tại bệnh viện (HO-HCFA). Triệu chứng lâm sàng chủ yếu là tiêu chảy phân lỏng nhiều nước (hôi đặc trưng), đau quặn bụng dưới (chiếm tỷ lệ cao), sốt $>38,3^\circ\text{C}$, tăng bạch cầu máu $>15\text{ G/L}$, và hạ albumin máu trầm trọng ($<25\text{ g/L}$). Khảo sát nội soi phát hiện các tổn thương điển hình của viêm đại tràng giả mạc với các mảng mủ nhầy màu vàng kích thước 2–10 mm bám trên niêm mạc xung huyết xuất huyết.

2. Xác lập hệ thống yếu tố nguy cơ độc lập qua phân tích đa biến: Mô hình hồi quy logistic đa biến khẳng định mối liên quan có ý nghĩa thống kê của các yếu tố:

   • Tiền sử sử dụng kháng sinh trong vòng 8 tuần trước khi tiêu chảy: Nhóm kháng sinh Cephalosporins thế hệ 3/4, Fluoroquinolones và Carbapenems làm tăng nguy cơ mắc bệnh rõ rệt.
   • Tiền sử nằm viện trong vòng 8 tuần trước đó: Là yếu tố phơi nhiễm hàng đầu, phản ánh tình trạng nhiễm nha bào từ môi trường bệnh viện.
   • Tuổi cao ($\ge 60$ tuổi) và Bệnh lý mạn tính kèm theo: Bệnh nhân mắc bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối hoặc đái tháo đường có nguy cơ mắc cao hơn, tiên lượng diễn biến nặng hơn.
   • Sử dụng thuốc ức chế bơm proton (PPI) và can thiệp thủ thuật xâm lấn.

3. Cấu trúc gen độc tố và sự thống trị của đột biến mất đoạn gen $tcdA$: Nghiên cứu sinh học phân tử đã chứng minh tỷ lệ cao các chủng C. difficile mang kiểu gen sinh độc tố $A^-B^+$ do đột biến mất đoạn 1,8 kb ở đầu 3' của gen tcdA. Điều này bác bỏ giả định lâm sàng cho rằng các xét nghiệm chẩn đoán chỉ tìm độc tố A là đủ để phát hiện căn nguyên gây bệnh tại Việt Nam.

4. Đặc điểm phân bố kiểu gen PCR Ribotype tại Việt Nam: Không ghi nhận sự bùng phát áp đảo của chủng siêu độc lực NAP1/027 như ở Bắc Mỹ, mà thay vào đó là sự hiện diện chủ đạo của Ribotype 017 (chủng $A^-B^+$ điển hình của khu vực Châu Á) cùng các ribotype đặc trưng khác như trf, 001, og39, cc835, và cr.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        TỔNG HỢP CÁC PHÁT HIỆN THEN CHỐT                           |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 1. DỊCH TỄ HỌC:                                                                   |
|    - 101 ca khẳng định tại Bệnh viện Bạch Mai (2013-2017).                        |
|    - Đa số thuộc nhóm HO-HCFA (nhiễm trùng xuất hiện tại bệnh viện sau 48h).      |
|                                                                                   |
| 2. YẾU TỐ NGUY CƠ ĐỘC LẬP (Phân tích đa biến Logistic Regression):               |
|    - Tiền sử dùng kháng sinh trong 8 tuần (Cephalosporins, Quinolones).           |
|    - Tiền sử nằm viện trong 8 tuần trước tiêu chảy.                               |
|    - Tuổi >= 60 và bệnh thận mạn / đái tháo đường.                                |
|                                                                                   |
| 3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ:                                                    |
|    - Chiếm tỷ lệ lớn chủng đột biến mất đoạn 1,8 kb gen tcdA (kiểu gen A-B+).     |
|    - Thống trị bởi Ribotype 017 và các phân nhóm trf, 001, og39.                  |
|    - Không ghi nhận ổ dịch chủng siêu độc lực Bắc Mỹ NAP1/027.                    |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Khẳng định độc tố B (tcdB) là yếu tố sinh bệnh học cốt lõi gây tổn thương biểu mô đại tràng ở người bệnh tại Việt Nam; cung cấp dữ liệu tiến hóa phân tử của C. difficile trong môi trường áp lực kháng sinh cao tại các nước đang phát triển.
• Về phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật kết hợp giữa nuôi cấy kỵ khí chọn lọc (tủ BugBox Plus) và PCR đa mồi phát hiện đồng thời loài (tpi) cùng các biến chủng độc tố (tcdA/tcdB), có thể chuyển giao ứng dụng tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng trên toàn quốc.
• Về thực hành lâm sàng: Cảnh báo các bác sĩ không được loại trừ C. difficile khi chỉ sử dụng test nhanh EIA đơn thuần phát hiện độc tố A; khuyến nghị ưu tiên sử dụng Vancomycin uống hoặc Fidaxomicin cho các ca bệnh nặng thay vì Metronidazole theo hướng dẫn IDSA/SHEA mới nhất.
• Về chính sách y tế và quản trị bệnh viện: Thúc đẩy xây dựng Chương trình Quản lý Kháng sinh (Antimicrobial Stewardship Program - ASP) tại các bệnh viện tuyến tỉnh và trung ương; chuyển đổi hóa chất khử khuẩn bề mặt sang các dung dịch có hoạt tính diệt nha bào (như sodium hypochlorite hoạt hóa) thay thế cồn sát khuẩn thông thường vốn không có tác dụng ức chế nha bào C. difficile.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những đóng góp học thuật và thực tiễn to lớn, luận án tồn tại một số giới hạn nghiên cứu:

1. Thiết kế đơn trung tâm tuyến cuối: Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Bạch Mai, nơi tập trung các ca bệnh nặng chuyển tuyến từ miền Bắc, do đó tỷ lệ lưu hành và mức độ nặng có thể cao hơn so với mặt bằng chung tại cộng đồng hoặc các bệnh viện tuyến dưới.
2. Kỹ thuật phân tích phân tử: Kỹ thuật PCR ribotyping đối chiếu băng điện di thông thường có độ phân giải thấp hơn so với phương pháp Giải trình tự Toàn bộ Hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) hay Phân tích Đa hình Chiều dài Đoạn Cắt Giới hạn (REA).
3. Theo dõi dọc tái phát: Chưa theo dõi dài hạn sau xuất viện để đánh giá đầy đủ tỷ lệ tái phát sau 8–12 tuần và hiệu quả của các phác đồ điều trị bổ sung như cấy ghép vi sinh vật phân (FMT).

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda) cần tập trung vào 5 hướng:

• Mở rộng mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử đa trung tâm quy mô toàn quốc tại 3 miền Bắc – Trung – Nam.
• Ứng dụng giải trình tự WGS để giải mã chi tiết các đột biến điểm trên vùng gen tcdC và các đảo kháng thuốc (antimicrobial resistance islands).
• Đánh giá sự lưu hành của C. difficile trong chuỗi cung ứng thực phẩm và cộng đồng (CA-CDI).
• Thực hiện thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng (RCT) đánh giá hiệu quả của cấy ghép phân (FMT) trong điều trị nhiễm trùng tái phát tại Việt Nam.
• Nghiên cứu cơ chế tương tác giữa microbiome đường ruột người Việt Nam với sự nảy mầm của nha bào C. difficile.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình nghiên cứu tạo ra tác động sâu rộng trên nhiều bình diện:

• Ảnh hưởng học thuật: Là tài liệu tham khảo nền tảng cho các nghiên cứu sinh, bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm, Vi sinh lâm sàng và Tiêu hóa; ước tính là nguồn trích dẫn chủ đạo cho các nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện tại Việt Nam.
• Chuyển đổi thực hành lâm sàng: Thay đổi nhận thức chẩn đoán của các bác sĩ hồi sức, truyền nhiễm, tiêu hóa đối với bệnh cảnh tiêu chảy liên quan đến kháng sinh; thúc đẩy chỉ định nội soi đại tràng và xét nghiệm sinh học phân tử kịp thời.
• Tác động chính sách y tế: Cung cấp bằng chứng thực tiễn để Bộ Y tế ban hành và cập nhật các Hướng dẫn Quốc gia về Kiểm soát Nhiễm khuẩn Bệnh viện và Hướng dẫn Chẩn đoán, Điều trị Tiêu chảy do Clostridioides difficile.
• Hiệu quả kinh tế - xã hội: Giúp rút ngắn số ngày nằm viện trung bình, giảm tỷ lệ biến chứng phẫu thuật cắt đại tràng do viêm đại tràng tối cấp hoặc phình giãn đại tràng nhiễm độc, từ đó tiết kiệm hàng tỷ đồng chi phí điều trị trực tiếp và gián tiếp cho người bệnh và bảo hiểm y tế.

Đối tượng hưởng lợi

+---------------------------------------------------------------------------------------+
|                              ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI TRỰC TIẾP                           |
+---------------------------------------------------------------------------------------+
| 1. NGHIÊN CỨU SINH & HỌC THUẬT:                                                      |
|    - Khung lý thuyết PaLoc và quy trình thực nghiệm nuôi cấy kỵ khí chuẩn xác.        |
|                                                                                       |
| 2. BÁC SĨ LÂM SÀNG (Hồi sức, Tiêu hóa, Truyền nhiễm):                                 |
|    - Nhận diện sớm ca bệnh qua các chỉ số: Sốt, Albumin < 25 g/L, Bạch cầu > 15 G/L.  |
|    - Phác đồ điều trị kháng sinh trúng đích (Vancomycin, Fidaxomicin).                |
|                                                                                       |
| 3. HỘI ĐỒNG KIỂM SOÁT NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN:                                         |
|    - Thay thế cồn rửa tay bằng xà phòng và nước; dùng hóa chất diệt nha bào.          |
|                                                                                       |
| 4. CÁC NHÀ HOẠCH ĐỊNH CHÍNH SÁCH Y TẾ:                                                |
|    - Xây dựng quy chuẩn giám sát vi sinh kỵ khí và chương trình quản lý kháng sinh.   |
+---------------------------------------------------------------------------------------+

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Luận án đã chứng minh trên thực nghiệm lâm sàng tại Việt Nam rằng các chủng C. difficile mang đột biến mất đoạn 1,8 kb ở đầu 3' của gen tcdA (tạo ra kiểu gen $A^-B^+$) vẫn có khả năng gây bệnh cảnh lâm sàng toàn phát và viêm đại tràng giả mạc nặng nề. Phát hiện này củng cố và mở rộng Thuyết Locus Gây bệnh PaLoc, khẳng định độc tố B (tcdB) giữ vai trò độc lực độc lập và thiết yếu trong sinh bệnh học của C. difficile tại quần thể bệnh nhân Việt Nam.

2. Điểm đổi mới trong phương pháp nghiên cứu so với các công trình trước đây là gì?

Khác với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chỉ dừng lại ở báo cáo ca bệnh đơn lẻ (Nguyễn Thị Hương Giang et al., 2015) hoặc khảo sát dịch tễ học không có phân tích gen độc tố (Đặng Thị Thùy Dương, 2014), luận án là công trình đầu tiên thiết lập thiết kế nghiên cứu bệnh - chứng ghép cặp 1:3 hoàn chỉnh ($n=91$ bệnh : $273$ chứng), chuẩn hóa quy trình nuôi cấy kỵ khí tuyệt đối trong tủ BugBox Plus kết hợp hệ thống Multiplex PCR khuếch đại đồng thời gen đặc hiệu loài tpi và gen độc tố tcdA/tcdB, cùng kỹ thuật PCR Ribotyping xác định kiểu gen dịch tễ học phân tử.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ số liệu nghiên cứu là gì?

Hoàn toàn không phát hiện sự hiện diện của chủng siêu độc lực Bắc Mỹ NAP1/027/BI trong quần thể 101 chủng phân lập tại Bệnh viện Bạch Mai, mặc dù tỷ lệ kháng sinh cephalosporin và fluoroquinolones được sử dụng rất cao. Thay vào đó, Ribotype 017 và các phân nhóm nội địa (trf, og39) chiếm ưu thế tuyệt đối, cho thấy đặc trưng sinh thái vi sinh vật và cấu trúc dịch tễ học phân tử riêng biệt của Việt Nam so với các nước phương Tây.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lặp (replication protocol) không?

Có. Luận án mô tả chi tiết từng bước: từ kỹ thuật thu thập, bảo quản mẫu phân, quy trình chuẩn bị môi trường thạch CCFA/CCMA bổ sung hóa chất hoạt hóa nha bào, thiết lập khí trường tủ kỵ khí ($80% N_2, 10% CO_2, 10% H_2$), trình tự mồi PCR cụ thể (tpi-F/R, tcdA-F/R, tcdB-F/R), chu nhiệt phản ứng PCR, đến quy trình phân tích đối chiếu băng điện di PCR Ribotyping.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào?

Xây dựng Mạng lưới Giám sát Nhiễm trùng C. difficile Quốc gia (Vietnam CDI Surveillance Network); tích hợp công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing/WGS) vào giám sát dịch tễ học thời gian thực; và triển khai các thử nghiệm can thiệp hệ vi sinh đường ruột (Fecal Microbiota Transplantation và Probiotics thế hệ mới) trong điều trị bệnh nhân kháng trị.

Kết luận

1. Xác lập mô hình dịch tễ học: Khẳng định C. difficile là căn nguyên hàng đầu gây tiêu chảy nhiễm trùng bệnh viện ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai, chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân nội trú có phơi nhiễm chăm sóc y tế (HO-HCFA).
2. Đặc trưng hóa hội chứng lâm sàng: Xác định bệnh cảnh điển hình gồm tiêu chảy phân lỏng nhiều lần, sốt cao $>38,3^\circ\text{C}$, tăng bạch cầu máu $>15\text{ G/L}$, hạ albumin máu $<25\text{ g/L}$ và hình ảnh tổn thương viêm đại tràng giả mạc trên nội soi.
3. Nhận diện hệ thống yếu tố nguy cơ độc lập: Chứng minh tiền sử nằm viện trong 8 tuần, sử dụng kháng sinh phổ rộng (Cephalosporins, Quinolones), tuổi cao $\ge 60$ và bệnh thận mạn tính là các yếu tố dự báo nguy cơ độc lập qua phân tích đa biến.
4. Đột phá về cấu trúc di truyền phân tử: Phát hiện tỷ lệ thống trị của các chủng đột biến mất đoạn 1,8 kb gen tcdA (kiểu gen sinh độc tố $A^-B^+$), khẳng định tầm quan trọng sống còn của việc phát hiện gen tcdB trong chẩn đoán vi sinh.
5. Định danh bản đồ PCR Ribotype: Nhận diện sự lưu hành phổ biến của Ribotype 017 và các kiểu gen trf, 001, og39, cc835, xác lập tính tương đồng với dịch tễ học phân tử khu vực Đông Á và bác bỏ sự xâm nhập của chủng siêu độc lực NAP1/027.
6. Đặt nền móng chính sách và thực hành: Cung cấp cơ sở khoa học xác thực để nâng cấp quy trình chẩn đoán vi sinh kỵ khí, tối ưu hóa phác đồ điều trị kháng sinh và chuẩn hóa các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện trên phạm vi toàn quốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Một số điểm đại cương về tiêu chảy do Clostridium difficile 1. Vi khuẩn Clostridium difficile 1. Lịch sử phát hiện Clostridium difficile Clostridium difficile được Hall và O’Toole phát hiện đầu tiên vào năm 1935, coi như một thành phần của vi khuẩn chí bình thường trong phân trẻ nhỏ.

Vì khó nuôi cấy trong ống nghiệm nên lúc đầu vi khuẩn được đặt tên là Bacillus difficilis, sau đó là Clostridium difficile. Năm 2016, nó được đổi tên thành Clostridioides difficile. Khi mới được phát hiện, C.difficile dường như không liên quan tới gây bệnh cho người và bị lãng quên cho đến thời kỳ của kháng sinh. Những trường hợp viêm đại tràng giả mạc (mô tả lần đầu tiên vào năm 1893), trở nên nhiều hơn và ban đầu được cho là do Staphylococcus aureus gây nên.

Uống vancomycin rất có hiệu quả, trở thành thuốc chỉ định điều trị các trường hợp viêm đại tràng giả mạc. Đầu những năm 1970, Tedesco và cộng sự nhận thấy, clindamycin điều trị nhiễm trùng kỵ khí dường như gây tiêu chảy nặng hơn ở một vài bệnh nhân. Đánh giá tần xuất tiêu chảy liên quan đến điều trị bằng clindamycin kết hợp với soi đại tràng, 42 trong 200 bệnh nhân xuất hiện tiêu chảy, 20 bệnh nhân có bằng chứng viêm đại tràng giả mạc trên nội soi, được gọi là “viêm đại tràng clindamycin”.aureus không phát hiện thấy trong mẫu phân của các bệnh nhân này. Các nghiên cứu và quan sát sau đó cho thấy, sử dụng vancomycin uống cùng lúc có thể ngăn được viêm đại tràng clindamycin.

Laughon và cộng sự đã phát hiện độc tố tế bào trong mẫu phân bệnh nhân viêm đại tràng giả mạc. Năm 1978, Bartlett và cộng sự tìm ra liên quan giữa C.difficile sinh độc tố và viêm đại tràng giả mạc ở người. Những năm 1980 và 1990, bệnh do C.difficile không phải là nguyên 4 nhân chính gây tử vong và được cho là đã có hiểu biết cần thiết để quản lý và điều trị nhiễm trùng do C. Tuy nhiên, trong thiên niên kỷ mới này, C.difficile lại tái xuất hiện, gia tăng về tần xuất và mức độ nặng.

Tại Hoa Kỳ, số bệnh nhân nằm viện liên quan đến C.difficile năm 2008 - 2009 lên tới 349. Báo cáo dịch tễ gần đây của Hoa Kỳ đánh giá nhiễm trùng do C.difficile là nguyên nhân phổ biến đáng ngại nhất, thay thế cả vấn đề S.aureus kháng methicillin trong nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế [100]. Một số đặc điểm của vi khuẩn Clostridium difficile C.difficile là trực khuẩn gram dương, kỵ khí tuyệt đối bắt buộc, sinh nha bào, sản xuất ra ngoại độc tố gây bệnh. Điều kiện ủ môi trường nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí phải đảm bảo không có oxy, thay vào đó là khí trường hỗn hợp các khí N2 (80%), CO2 (10%), H2 (10%).

Thời gian tiến hành các thao tác nuôi cấy phòng thí nghiệm cũng phải rất nhanh (dưới 20 phút), để không làm chết vi khuẩn. Chất lượng khí ủ phải đảm bảo không có oxy ổn định trong toàn bộ quá trình để tránh thất bại khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí.difficile là vi khuẩn rất khó sinh trưởng, đòi hỏi môi trường nuôi cấy đặc biệt, giàu chất sinh dưỡng, có bổ sung các chất như vitamin K, hemin, máu ngựa hoặc cừu, nhũ tương lòng đỏ trứng. Cần bổ sung chất kích thích quá trình nảy mầm của nha bào khi phân lập C.difficile từ mẫu phân hoặc từ môi trường như cholate, taurocholate, glycocholate hay glycine [146]. Trong tự nhiên, C.difficile tồn tại ở 2 dạng: dạng nha bào và dạng hoạt động.

Nha bào tồn tại ở bề mặt môi trường bên ngoài, đất, đường tiêu hóa động vật và người, là dạng không hoạt động, không chịu tác động của kháng sinh. Dạng hoạt động của C.difficile chỉ có trong đại tràng của người; một số vật nuôi trong nhà và động vật có vú hoang dại, chịu tác động của kháng sinh, có thể sinh độc tố hoặc không.difficile dạng hoạt động, sinh 5 độc tố mới gây bệnh [26], [157].difficile có ở đường tiêu hóa của 3% người lớn khỏe mạnh, 20% bệnh nhân nằm viện và 25% - 80% trẻ sơ sinh [158].difficile trong điều kiện không thuận lợi sẽ tạo nha bào, tồn tại ở bề mặt môi trường bệnh viện rất dài, tới 12 tháng mà không mất khả năng gây bệnh.difficile trong đại tràng người và động vật nhiễm, không chịu tác động của kháng sinh, rất khó bị loại bỏ, là nguyên nhân gây nhiễm cho người xung quanh do nuốt phải đồ ăn nhiễm nha bào và là nguyên nhân của 20% – 25% tái phát bệnh sau điều trị [133]. Nha bào trong môi trường ở cộng đồng và bệnh viện có sức đề kháng cao với nhiệt độ, chất bức xạ, hoá chất, cồn sát khuẩn… [15]. Sát khuẩn bằng cồn rửa tay nhanh không diệt được nha bào, cho thấy sự lây nhiễm cao trong bệnh viện.difficile dạng hoạt động (tế bào sinh dưỡng) C.difficile có nội bào tử Nha bào C.1: Hình ảnh nhuộm gram Clostridium difficile từ môi trường nuôi cấy [55] Các tế bào vi khuẩn dạng hoạt động hình que (tế bào sinh dưỡng); tế bào sinh dưỡng có nội bào tử và nha bào tự do 6 Hình 1.

cho thấy ở tiêu bản nhuộm gram, C.difficile là trực khuẩn gram dương, kích thước 1 x 3 µm. Nha bào ở gần đầu cực của vi khuẩn hoặc ở dạng nha bào tự do. Vi khuẩn dễ mất màu tím gentian trong quá trình nhuộm gram. Nha bào vi khuẩn C.2: Bề mặt nha bào của C.difficile [157] Kính hiển vi điện tử độ phân giải cao, quét được các lớp xếp chồng nhau, truyền dữ liệu hình thái nha bào của chủng C.difficile VPI10463 dàn trên một mặt phẳng.

Trật tự sắp xếp các phần protein của nha bào có thể quan sát được dễ dàng: lõi (core), vỏ (cortex), áo ngoài (coat), cấu trúc phần ngoài của nha bào (exosporium) là phần dải rườm rà xung quanh. Bộ sưu tập ảnh chụp hiển vi, phòng thí nghiệm Vedantam.difficile có thể tồn tại lâu và bền vững trong môi trường là do cấu trúc của nó. Nha bào gồm 3 thành phần chính: lớp áo ngoài, lớp vỏ và lõi. Lớp ngoài cùng, nơi tiếp xúc của nha bào với môi trường gọi là exosporium, có đặc điểm của một protein giống collagen, gồm một lớp đáy paracrystalline gắn các sợi xơ, tạo bông lên.

Có hay không phần exosporium sẽ quyết định khả năng nảy mầm gây bệnh của nha bào. Phá vỡ hoặc làm mất lớp exosporium sẽ thấy lớp áo ngoài, là lớp bảo vệ nha bào trong môi trường bất lợi bằng cấu trúc dày đặc các electron và protein, bao bọc lớp vỏ và lõi. DNA nằm trong lõi của nha bào [15]. 7 Áo ngoài ngoaifngng Áo ngoài oài nngoàin goài Vỏ Màng Lõi Hình 1.3: Cấu trúc nha bào Clostridium difficile [133] Phần ngoài của nha bào (exosporium), áo ngoài, vỏ, màng, ribosome và lõi.

Độc tố và khả năng gây bệnh của C.difficile có trong đại tràng người, sản xuất ngoại độc tố và gây bệnh. Hầu như không có sự xâm nhập của C.difficile vào tế bào niêm mạc đại tràng. Hai ngoại độc tố do C.difficile sản xuất ra gồm: độc tố A (toxin A hay tcdA) là độc tố ruột, 308 kD và độc tố B (toxin B hay tcdB) là độc tố tế bào, 250 – 270 kD. Cả 2 độc tố A và B đều có hoạt tính độc tế bào.

Hiệu quả gây độc xảy ra khi độc tố gắn với các thụ thể nội bào của màng tế bào ruột, đi vào trong tế bào. Để có chức năng này, các tcdA và tcdB phải vào tế bào vật chủ bằng enzyme nội bào và cần axit nội bào để vào được dịch bào. Sau khi xâm nhập, độc tố A vào trong tế bào ruột, thay thế khung tế bào actin làm các tế bào tròn lại. Độc tố B khi cấy vào tế bào cũng gây ra sự vo tròn của tế bào, cho thấy cả hai độc tố này có thể có cùng phương thức hoạt động.

Hai độc tố này làm ảnh hưởng đến sinh lý tế bào và dẫn đến chết tế bào theo chương trình. TcdA cũng kích thích sản xuất cytokine đóng góp vào giai đoạn sớm của quá trình viêm trong 8 viêm đại tràng giả mạc [113]. Tìm thấy độc tố trong phân là chỉ điểm cho nhiễm trùng do C. Độc tố A gây tăng tiết dịch, phá hủy màng nhầy và viêm ruột khi tiêm vào ruột động vật thí nghiệm.

Độc tố B có khả năng gây độc gấp 10 - 1000 lần độc tố A, là một độc tố tế bào trong cấy mô [82]. Khi tiêm độc tố A và độc tố B cho động vật thí nghiệm, có khả năng gây cho chúng tổn thương thần kinh thực vật và tử vong. Cơ chế hoạt động trong tế bào của độc tố A và độc tố B vẫn còn chưa được hiểu rõ. Hoạt động của tcdA và tcdB đang được đánh giá lại về chức năng và các tác động phụ thêm của nó.difficile sản xuất ra độc tố A, độc tố B và gây bệnh.

Lúc đầu, người ta nghĩ độc tố A là tác nhân độc tố chính, nhưng gần đây tầm quan trọng của độc tố B đã được khẳng định. Cả hai độc tố A và B đều gây viêm đại tràng lan tỏa và tổn thương tế bào biểu mô, gây mất dịch với biểu hiện tiêu chảy. Chưa ghi nhận trên người trường hợp bị bệnh do C.difficile chỉ có độc tố A mà không có độc tố B. Do vậy, khi chẩn đoán bệnh do nhiễm C.difficile, người ta ghi nhận chủng C.difficile A+B+ hoặc chủng C.

Một số ít chủng sản xuất độc tố kép (binary toxin) hay CDT (Clostridium difficile transferase) có trọng lượng phân tử 43 kD. Những chủng có thêm độc tố kép (chủng ribotype B1/NAP1/027 và chủng ribotype 078) gây bệnh cảnh lâm sàng nặng hơn những chủng không có độc tố này [19]. Vai trò chính xác trong sinh bệnh học về độc lực của chủng sinh độc tố kép vẫn chưa biết rõ, nhưng một số nghiên cứu cho rằng độc tố kép có vai trò trong việc dễ dàng cư trú của C.difficile trong vật chủ bị nhiễm [15].difficile gây bệnh thông qua sản sinh độc tố kép [27]. Fatima (2019) đề cập đến cơ chế hoạt động của độc tố A là hủy hoại phần actin của các tế bào đích, gây xâm nhập bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, viêm và hoại tử tế bào biểu mô ruột.

Độc tố B phá hủy liên kết của các tế bào biểu mô, tăng tính 9 thấm thành mạch và gây xuất huyết. Độc tố kép làm tăng khả năng gắn của vi khuẩn vào tế bào biểu mô ruột [54]. Tiêu chảy do Clostridium difficile 1. Tiêu chảy Tiêu chảy là nguyên nhân gây bệnh và tử vong thứ 2 trên thế giới, ước tính mỗi năm có 3,1 triệu người tử vong.