Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V.
cholerae type sinh học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005). Ở Việt Nam, bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tiêu chảy hơn một thế kỷ nay, với 2.000 trường hợp được báo cáo trong năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả với tỉ lệ tử vong lên đến 50% và đến năm 1910-1930 có 5.000 trường hợp bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962).
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xảy ra 3 đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm ở 18 tỉnh, thành thuộc cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Năm 2009 - 2010, dịch tả lại xuất hiện tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (Nguyen et al. Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010.
Biển Duyên Hải và Cầu Ngang thuộc tỉnh Trà Vinh là vùng chuyên nuôi trồng thủy sản, trong đó phổ biến nhất là nghêu và tôm. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh thức ăn hải sản là nguồn lưu trữ vi khuẩn gây bệnh tả được xác định là V. Vi khuẩn này có cấu trúc gene của chủng thuộc type sinh học El tor, nhưng lại mang gene độc lực của type sinh học cổ điển, khiến nó tăng độc lực và gây bệnh với triệu chứng lâm sàng nặng hơn, người khỏe mang trùng và thời gian mang trùng dài hơn, khả năng tồn tại lâu hơn trong môi trường (Boyd et al. 1 Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy triệu chứng chính của bệnh tả trên người là do độc tố của vi khuẩn V.
cholerae gây ra. Vi khuẩn có mặt ở các môi trường nước biển và nguồn nước bị ô nhiễm (Nguyen Binh Minh et al. Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng.
Nhiễm sắc thể được chứng minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al. Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus et al. Thực phẩm và nước ô nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, càng quan tâm hơn nữa là kháng sinh được bổ sung vào thức ăn cho động vật đã góp phần vào việc kháng kháng sinh khi điều trị bệnh trên người (Smith et al, 1999).
Nhiều nghiên cứu về V. cholerae được phân lập từ các nguồn nước sông và nước biển, trên các loại mẫu thức ăn hải sản đều cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết các kháng sinh thường được sử dụng, điều này có thể khẳng định trong thực tế việc kháng kháng sinh đang gia tăng cả trong lĩnh vực chăn nuôi trang trại và y tế công cộng, đây cũng là vấn đề toàn cầu trong những thập kỷ gần đây do sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong các trang trại chăn nuôi và thực phẩm làm thức ăn gia súc, gia cầm (Teuber, 2001; Bywater, 2004). Với tính chất lây lan và nguy hiểm của bệnh dịch tả, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu này được thực hiện nhằm góp phần xác định tỉ lệ nhiễm của vi khuẩn V. cholerae và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn đang gia tăng cả trong môi trường và thức ăn từ hải sản, cùng với mục tiêu xác định mối liên quan về đặc điểm di truyền gene kháng kháng sinh của V.
cholerae phân lập được từ môi trường nước và trên các loại mẫu có nguồn gốc từ hải sản. Nghiên cứu đã tiến hành từ năm 2012 đến 2014 với nội dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 1.1 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V. cholerae phân lập được. - Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng V.
- Xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng Vibrio cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường. - Định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, định danh các loài thuộc Vibrio spp., trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản (tôm, nghêu) ở huyện Duyên Hải và Cầu Ngang; mẫu nước (sông, ao nuôi tôm, nước biển) tại thành phố Trà Vinh bắt nguồn từ sông Cổ Chiên và nước ao nuôi tôm tại huyện Duyên Hải; mẫu huyết heo từ các cơ sở giết mổ ở Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang, huyện Càng Long; mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh. Các giống vi khuẩn thuộc Vibrio được kiểm tra độ dài DNA bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA, sau đó tìm sự tương đồng về trình tự nucleotide với những chủng khác bằng công cụ BLAST.
Xác định sự kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae dựa trên các cặp mồi blaSHV (gene mã hoá kháng β-Lactam), aac(3)-IV (gene mã hoá kháng aminogly-cosid), tetA (gene mã hoá tính kháng tetracycline), dhfrI (gene mã hoá kháng trimethoprim); so sánh tính đột biến với các chủng V. cholerae hoang dại. Thử nghiệm trên thỏ nhằm khảo sát tính miễn dịch đối với vaccine hiện hành và sự đột biến đối với vi khuẩn phân lập được.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio trong đó loài V.
cholerae được nghiên cứu về sự đột biến và tính kháng kháng sinh. 3 Phạm vi nghiên cứu: 5 loại mẫu thu thập từ 4 huyện, 1 thành phố thuộc tỉnh Trà Vinh: mẫu nghêu (thu mua tại huyện Duyên Hải và Cầu Ngang), mẫu huyết heo (thu tại cơ sở giết mổ ở thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang và Càng Long), mẫu nước (nước ao nuôi tôm ở huyện Cầu Ngang và Duyên Hải, nước biển ở huyện Duyên Hải, nước sông tại thành phố Trà Vinh và sông Cổ Chiên), mẫu tôm (thu mua tại chợ huyện Duyên Hải); mẫu phân bệnh nhân có triệu chứng tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 4/2012 – 4/2014, tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ; Bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Bệnh viện trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ và Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản, trường Đại học Trà Vinh.5 Những đóng góp của luận án - Phân lập được 6 chủng V. cholerae và tỉ lệ nhiễm V. cholerae trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản như nghêu, tôm và mẫu nước từ môi trường nước sông và nước ao nuôi tôm.
- Xác định được type huyết thanh học Ogawa và Inaba của các gốc V. cholerae phân lập. - Xác định được sự tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng V. cholerae phân lập được với trình tự nucleotide của những chủng V.
cholerae ở các nước thuộc vùng Đông Nam Á dựa vào đoạn 16SrDNA. - Xác định được tính kháng kháng sinh của V. cholerae đối với kháng sinh vancomycin, streptomycin, azithromycin, trimethoprim-sulfamethoxazol và tetracycline. - Xác định được sự đột biến gene kháng tetracycline của V.
cholerae phân lập được.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án * Ý nghĩa khoa học: Định danh được 5 loài thuộc giống Vibrio hiện đang phổ biến ở trong môi trường nước sông, thức ăn có nguồn gốc thủy sản và có thể gây bệnh cho người. Kết quả của đề tài có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. * Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp số liệu về tỉ lệ nhiễm các loài thuộc giống Vibrio và sự kháng kháng sinh của V. 4 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) Năm 1816 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ, đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 đại dịch tả lan khắp thế giới.
Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi gây bệnh của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây bệnh chủ yếu xuất hiện ở Đông Nam Á. Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch tại Philippines và tạo làn sóng thứ bảy. Từ đó trở đi type vi khuẩn này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần Châu Âu (Colwell, 2004). Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn V.
cholerae O1 đã xảy ra ở Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất hiện và lây lan nhanh chóng bởi V.