Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae tại tỉnh Trà Vinh

Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae tại Trà Vinh, cung cấp thông tin quan trọng cho y tế công cộng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Đấu
• Người hướng dẫn: PGS. Hồ Thị Việt Thu
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Di Truyền Và Tính Kháng Thuốc Của Vibrio Cholerae Tại Trà Vinh
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Trà Vinh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
• 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
• 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 1.5. Những đóng góp của luận án
• 1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả
• 2.2. Tổng quan về Vibrio
• 2.2.1. Đặc điểm các loài thuộc giống Vibrio
• 2.2.2. Phân loại vi khuẩn V
• 2.2.3. Đặc điểm hình dạng của V
• 2.2.4. Đặc điểm sinh thái của V
• 2.2.5. Sức đề kháng của V
• 2.3. Tình hình dịch tễ học của bệnh tả do V
• 2.3.1. Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở các nước trên thế giới
• 2.3.2. Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở Việt Nam
• 2.3.3. Nguồn truyền nhiễm và các phương thức truyền lây của V
• 2.4. Đặc điểm di truyền của V
• 2.4.1. Độc lực của V
• 2.4.2. Đặc tính di truyền về độc lực của V
• 2.4.3. Các yếu tố về độc lực
• 2.4.4. Cơ chế gây bệnh của V
• 2.5. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn
• 2.5.1. Cơ chế kháng kháng sinh
• 2.5.2. Sự kháng kháng sinh do V. cholerae ở các nước trên thế giới
• 2.5.3. Sự kháng kháng sinh của V. cholerae ở Việt Nam
• 2.5.4. Cơ chế kháng kháng sinh của V
• 2.5.5. Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn đối với tetracycline
• 2.6. Tính miễn dịch đối với vaccine phòng bệnh tả trên người
• 2.6.1. Nguyên lý sử dụng vaccine
• 2.6.2. Cơ chế hoạt động của vaccine
• 3. CHƯƠNG 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp.
• 4.1.1. Kết quả phân lập Vibrio spp.
• 4.1.2. Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa
• 4.1.3. Kết quả định danh Vibrio spp. bằng máy định danh tự động
• 4.1.4. Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR
• 4.1.5. Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập
• 4.1.6. Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu ở huyện Cầu Ngang và Duyên Hải
• 4.1.7. Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện
• 4.2. Kết quả định type huyết thanh học
• 4.3. Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên Genbank bằng công cụ BLAST
• 4.4. Sự kháng kháng sinh của V
• 4.4.1. Kết quả khảo sát sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010)
• 4.4.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
• 4.4.3. Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập
• 4.4.4. Kết quả giải trình tự các đoạn gen kháng kháng sinh
• 4.4.5. So sánh trình tự nucleotid của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng V. cholerae hoang dại N16961
• 4.4.6. Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA
• 4.5. Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên thỏ
• 4.5.1. Kết quả đánh giá chủng V. cholerae không uống vaccine phòng bệnh tả
• 4.5.2. Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu di truyền và kháng thuốc của Vibrio cholerae

Nghiên cứu di truyền và kháng thuốc của Vibrio cholerae tại tỉnh Trà Vinh là một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực vi sinh vật học. Vibrio cholerae là tác nhân gây ra bệnh tiêu chảy cấp tính, có thể dẫn đến tử vong nếu không được điều trị kịp thời. Việc hiểu rõ về đặc điểm di truyền và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn này sẽ giúp cải thiện chiến lược điều trị và phòng ngừa bệnh. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về tình hình dịch tễ học mà còn giúp xác định các chủng vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học và dịch tễ học của Vibrio cholerae

Chủng Vibrio cholerae gây bệnh có hình dạng dấu phẩy, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm. Tình hình dịch tễ học cho thấy bệnh tả do Vibrio cholerae gây ra đã có nhiều đợt bùng phát trên toàn cầu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Việc phân tích các chủng vi khuẩn và sự lây lan của chúng là rất cần thiết để kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Tính cấp thiết của nghiên cứu kháng thuốc

Tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong quần thể Vibrio cholerae đã trở thành một thách thức lớn trong điều trị bệnh. Việc nghiên cứu tính kháng thuốc không chỉ giúp xác định các chủng kháng thuốc mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phác đồ điều trị hiệu quả hơn.

II. Vấn đề kháng thuốc của Vibrio cholerae tại Trà Vinh

Tình trạng kháng thuốc của Vibrio cholerae tại tỉnh Trà Vinh đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng. Nghiên cứu cho thấy nhiều chủng vi khuẩn đã phát triển khả năng kháng lại các loại kháng sinh thông dụng. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị mà còn làm gia tăng chi phí y tế và tỷ lệ tử vong. Việc phân tích các yếu tố di truyền liên quan đến kháng thuốc là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn.

2.1. Tình hình kháng thuốc hiện tại

Kết quả nghiên cứu cho thấy có đến 50% các chủng Vibrio cholerae phân lập được kháng lại streptomycin. Ngoài ra, một số chủng cũng cho thấy khả năng kháng tetracycline và trimethoprim-sulfamethoxazole. Việc này đặt ra yêu cầu cấp thiết trong việc theo dõi và quản lý tình trạng kháng thuốc.

2.2. Nguyên nhân dẫn đến kháng thuốc

Nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng thuốc của Vibrio cholerae có thể do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong điều trị bệnh. Ngoài ra, sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc từ môi trường cũng góp phần làm gia tăng tình trạng này.

III. Phương pháp nghiên cứu di truyền và kháng thuốc của Vibrio cholerae

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu từ nhiều nguồn khác nhau như nước, huyết heo và phân bệnh nhân. Các phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn được áp dụng bao gồm kỹ thuật PCR và các test sinh hóa. Những phương pháp này giúp xác định chính xác các chủng Vibrio cholerae và đánh giá khả năng kháng thuốc của chúng.

3.1. Quy trình thu thập mẫu

Mẫu được thu thập từ 160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước và 100 mẫu huyết heo. Việc thu thập mẫu từ nhiều nguồn khác nhau giúp đảm bảo tính đại diện và độ chính xác của nghiên cứu.

3.2. Kỹ thuật phân lập và định danh

Kỹ thuật PCR và các test sinh hóa theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-1:2007 được sử dụng để định danh các chủng vi khuẩn. Phương pháp này cho phép xác định chính xác mức loài của Vibrio cholerae và các chủng liên quan.

IV. Kết quả nghiên cứu về di truyền và kháng thuốc của Vibrio cholerae

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập được 25 chủng vi khuẩn thuộc Vibrio spp., trong đó có 6 chủng Vibrio cholerae. Các chủng này đều thuộc type O1, với tỷ lệ kháng thuốc đáng kể. Việc phân tích gen kháng thuốc cho thấy sự hiện diện của gene tetA, cho thấy khả năng kháng tetracycline của một số chủng.

4.1. Tỷ lệ phân lập và định danh

Trong số 25 chủng vi khuẩn phân lập, 6 chủng được xác định là Vibrio cholerae. Kết quả cho thấy tỷ lệ phân lập từ các mẫu nước và huyết heo là khá cao, cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong môi trường sống.

4.2. Phân tích gen kháng thuốc

Phân tích gen cho thấy 2 trong số 6 chủng Vibrio cholerae mang gene kháng kháng sinh tetA. Điều này cho thấy sự phát triển của khả năng kháng thuốc trong quần thể vi khuẩn này, cần có các biện pháp can thiệp kịp thời.

V. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu di truyền và kháng thuốc

Nghiên cứu về di truyền và kháng thuốc của Vibrio cholerae không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về vi khuẩn mà còn có ứng dụng thực tiễn trong y tế. Thông tin từ nghiên cứu có thể giúp các bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

5.1. Đề xuất phác đồ điều trị

Dựa trên kết quả nghiên cứu, các bác sĩ có thể điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh do Vibrio cholerae. Việc này giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc.

5.2. Chiến lược phòng ngừa dịch bệnh

Nghiên cứu cũng cung cấp thông tin quan trọng cho các cơ quan y tế trong việc xây dựng chiến lược phòng ngừa dịch bệnh. Việc theo dõi tình hình kháng thuốc sẽ giúp phát hiện sớm các chủng vi khuẩn mới và ngăn chặn sự bùng phát dịch bệnh.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về di truyền và kháng thuốc của Vibrio cholerae tại Trà Vinh đã cung cấp nhiều thông tin quý giá. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để theo dõi sự biến đổi của vi khuẩn và khả năng kháng thuốc của chúng. Việc này sẽ giúp cải thiện các biện pháp điều trị và phòng ngừa bệnh trong tương lai.

6.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc theo dõi sự biến đổi gen của Vibrio cholerae và khả năng kháng thuốc của chúng. Điều này sẽ giúp phát hiện sớm các chủng vi khuẩn mới và đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời.

6.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu kháng thuốc

Cần phát triển các phương pháp mới trong nghiên cứu kháng thuốc, bao gồm việc sử dụng công nghệ gen và phân tích sinh học phân tử. Những phương pháp này sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc và tìm ra các giải pháp hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh tả là một bệnh truyền nhiễm cấp tính đường tiêu hóa do phẩy khuẩn Vibrio cholerae gây ra, có khả năng lây lan nhanh và gây tử vong cao nếu không được bù nước và điện giải kịp thời. Lịch sử y học thế giới đã ghi nhận 7 đại dịch tả toàn cầu. Sáu đại dịch đầu tiên (1816–1923) khởi phát từ Ấn Độ do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 bắt đầu từ đảo Celebes (Indonesia) vào năm 1961 do V. cholerae type sinh học El Tor gây ra, kéo dài và lan rộng ra nhiều châu lục. Đến năm 1992, sự xuất hiện của nhóm huyết thanh mới O139 Bengal tiếp tục làm phức tạp thêm bức tranh dịch tễ học tả toàn cầu. Tại Việt Nam, dịch tả lưu hành hơn một thế kỷ với các đợt bùng phát lớn từ năm 1850, 1885 và giai đoạn 1910–1930. Gần đây, các đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm đã tái phát tại nhiều tỉnh miền Bắc và Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là các đợt bùng phát năm 2007–2010.

Tỉnh Trà Vinh nằm ở hạ lưu sông Tiền và sông Hậu thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, sở hữu bờ biển dài khoảng 65 km và mạng lưới sông ngòi nội địa dài 578 km, bao gồm các hệ thống sông lớn như sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít. Vị trí tiếp giáp sông Cổ Chiên nối liền Trà Vinh với tỉnh Bến Tre – địa phương từng ghi nhận bệnh nhân mắc dịch tả vào năm 2010. Địa bàn ven biển như huyện Cầu Ngang và Duyên Hải là trung tâm nuôi trồng và khai thác thủy hải sản lớn, trong đó nghêu và tôm là hai đối tượng chủ lực. Thủy hải sản và môi trường nước tự nhiên đã được nhiều công trình chứng minh là ổ chứa tự nhiên của V. cholerae. Đồng thời, việc lạm dụng kháng sinh trong y tế điều trị và ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản đã làm gia tăng tình trạng đa đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn đường ruột, đe dọa trực tiếp đến hiệu quả phác đồ can thiệp lâm sàng.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là sự thiếu hụt các dữ liệu thực địa mang tính hệ thống về tỉ lệ lưu hành, đặc điểm kiểu hình huyết thanh học, mức độ nhạy cảm kháng sinh, cũng như đặc tính di truyền phân tử của các chủng V. cholerae hiện diện trong môi trường nước, thủy sản thương phẩm và mẫu bệnh phẩm tại tỉnh Trà Vinh. Đề tài luận án tiến sĩ "Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh" của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Đấu (chuyên ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Cần Thơ, năm 2015, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu) được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chiến lược giám sát dịch tễ học và định hướng sử dụng kháng sinh hợp lý.

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V. cholerae phân lập được.
2. Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae.
3. Xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng V. cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường.
4. Định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố.

Nhiệm vụ nghiên cứu được phân bổ tương ứng gồm:

• Phân lập và định danh các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio trên các nhóm mẫu thủy hải sản, mẫu nước môi trường, mẫu huyết heo tại lò giết mổ và mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy tại tỉnh Trà Vinh.
• Kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR dựa trên gene 16S rRNA, giải trình tự và phân tích mức độ tương đồng nucleotide bằng công cụ BLAST.
• Khảo sát kiểu hình kháng kháng sinh đối với 8 loại kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
• Phát hiện sự hiện diện của các gene kháng kháng sinh (blaSHV, aac(3)-IV, tetA, dhfrI) bằng kỹ thuật PCR; giải trình tự gene tetA và so sánh đột biến amino acid với chủng chuẩn hoang dại N16961.
• Thử nghiệm đánh giá khả năng gây tích tụ dịch ruột và chỉ số bám dính của các chủng V. cholerae mang gene kháng thuốc vào niêm mạc ruột non thỏ có và không có uống vaccine tả đường uống.

Đối tượng nghiên cứu là các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio, trọng tâm là loài V. cholerae. Phạm vi nghiên cứu bao gồm 5 loại mẫu thu thập tại 4 huyện (Cầu Ngang, Duyên Hải, Châu Thành, Càng Long) và thành phố Trà Vinh, gồm:

• Mẫu nghêu: thu mua tại bãi nuôi huyện Cầu Ngang và Duyên Hải (160 mẫu).
• Mẫu nước: 150 mẫu gồm nước biển Duyên Hải (50 mẫu), nước sông Cổ Chiên và sông nội ô TP. Trà Vinh (50 mẫu), nước ao nuôi tôm Cầu Ngang và Duyên Hải (50 mẫu).
• Mẫu tôm: thu mua tại chợ huyện Duyên Hải.
• Mẫu huyết heo: thu tại các cơ sở giết mổ gia súc tập trung tại TP. Trà Vinh, Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang, Càng Long (100 mẫu).
• Mẫu phân bệnh nhân: thu từ người bệnh có triệu chứng tiêu chảy cấp điều trị tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh (40 mẫu).

Thời gian nghiên cứu diễn ra từ tháng 4 năm 2012 đến tháng 4 năm 2014. Địa điểm thực hiện các nội dung phân tích bao gồm: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng – Trường Đại học Cần Thơ; Bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; và Khoa Nông nghiệp – Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án hệ thống hóa chi tiết tiến trình lịch sử 7 đại dịch tả và các đợt bùng phát dịch quy mô lớn trên thế giới từ năm 1816 đến năm 2012:

• Đại dịch thứ nhất (1816–1826): khởi phát tại vùng Bengal, Ấn Độ, lan rộng ra khắp Ấn Độ vào năm 1820 làm hàng trăm nghìn người dân và binh lính Anh tử vong, sau đó tiến sang Trung Quốc, Indonesia và vùng biển Caspian (Pike, 2007).
• Đại dịch thứ hai (1829–1851): lan truyền sang Nga, Hungary (100.000 người chết), Đức (1831), Ai Cập (150.000 người chết), Anh và Pháp (1832, hơn 55.000 ca tử vong tại Paris), sau đó vượt Đại Tây Dương tới Canada, Hoa Kỳ, Mexico (200.000 nạn nhân; Byrne, 2008), và Cuba, quần đảo Canaria (1851). Tại Anh, đại dịch làm 52.000 người chết vào năm 1848–1849 (Charles, 1987).
• Đại dịch thứ ba (1852–1860): gây tử vong hơn một triệu người ở Nga, lan sang Trung Quốc, Nhật Bản, Philippines, Hàn Quốc, Iran, Iraq, Brazil. Tại London, trận dịch 1853–1854 làm 10.738 người chết, qua đó công trình kinh điển của John Snow đã chứng minh nguồn nước ô nhiễm là đường truyền lây chính của bệnh (Kohn, 2008). Tại Tây Ban Nha, hơn 236.000 người tử vong trong giai đoạn 1854–1855.
• Đại dịch thứ tư (1863–1875): lây lan ở châu Âu, châu Phi (Zanzibar mất 70.000 người năm 1869–1870; Algeria mất 80.000 người), Nga (90.000 ca tử vong năm 1866), Bắc Mỹ (50.000 ca tử vong; Beardsley, 2000).
• Đại dịch thứ năm (1881–1896): làm tử vong khoảng 250.000 người ở châu Âu và ít nhất 50.000 người ở châu Mỹ, ghi nhận 267.890 ca chết tại Nga (1892), 120.000 tại Tây Ban Nha, 90.000 tại Nhật Bản, 60.000 tại Ba Tư, 58.000 tại Ai Cập và 8.605 người tại Hamburg (Cholera, 1911).
• Đại dịch thứ sáu (1899–1923): tác động nghiêm trọng đến Nga (hơn 500.000 ca tử vong), Philippines (200.000 người chết giai đoạn 1902–1904), và Ấn Độ (hơn 800.000 ca tử vong).
• Đại dịch thứ bảy (1961–1975): bắt đầu từ Indonesia do type sinh học El Tor thay thế type sinh học cổ điển, lan sang Bangladesh (1963), Ấn Độ (1964), Liên Xô (1966), Thổ Nhĩ Kỳ (1970) và Ý (1973) (Hayes, 2005).

Giai đoạn từ năm 1991 đến năm 2012 chứng kiến các biến động dịch tễ học phức tạp:

• Dịch bùng phát tại Nam Mỹ bắt đầu từ Peru tháng 1/1991 đến tháng 9/1994 với 1.041.422 ca mắc và 9.642 ca tử vong (Faruque et al., 1998; Levine, 1991; Ries et al., 1992).
• Tháng 12/1992, chủng V. cholerae O139 Bengal xuất hiện tại Tamil Nadu (Ấn Độ) và Bangladesh, lây lan ra ít nhất 11 quốc gia châu Á (Shimada et al., 1993; Garg et al., 2000).
• Các đợt bùng phát tại châu Phi: Rwanda (1994, 1997 trong trại tị nạn Goma, Congo), Zimbabwe (2008–2009 với tỉ lệ tử vong từ 3,7% đến 4,2%), Nigeria (tháng 8/2010 với 6.400 ca mắc, 352 ca tử vong; Hayes, 2005), và Haiti (2010–2012 sau trận động đất; McNeil Jr et al., 2011).

Tại Việt Nam, dịch tả do type El Tor xuất hiện ở miền Nam từ năm 1964 làm 20.000 người mắc và 821 người tử vong, sau đó lan ra miền Bắc vào năm 1976 tại Hải Phòng và Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1996, 1999). Giai đoạn 2007–2008, đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm bùng phát tại Hà Nội và 20 tỉnh phía Bắc với 2.490 bệnh nhân nhập viện, trong đó 377 ca dương tính với V. cholerae O1 Ogawa biến thể mang gene độc tố cổ điển trên nền khung di truyền El Tor (Nguyen et al., 2008). Năm 2010, một chủng V. cholerae O139 ký hiệu ND1 được phân lập từ mẫu nước tại Nam Định (Dong Tu Nguyen et al., 2012). Tại Đồng bằng sông Cửu Long, đến tháng 8/2010 đã xuất hiện ca bệnh tại 4 tỉnh giáp ranh gồm Bến Tre, Tiền Giang, Cần Thơ và An Giang.

Về đặc điểm sinh học giống Vibrio, tác giả điểm lại các nghiên cứu cơ bản:

• Vibrio cholerae: trực khuẩn Gram âm, kích thước 0,3 x 3 µm, di động nhờ một tiên mao, phát triển thuận lợi ở pH kiềm (8,0–9,5), nồng độ muối NaCl 5–15 mmol/l, nhiệt độ 16–42 °C (tối ưu 37 °C). Gồm hơn 200 nhóm huyết thanh O, trong đó O1 và O139 chịu trách nhiệm gây dịch; nhóm O1 chia thành 3 type huyết thanh Ogawa (kháng nguyên A, B), Inaba (kháng nguyên A, C) và Hikojima (A, B, C) (Kaper et al., 1995).
• Vibrio parahaemolyticus: vi khuẩn ưa mặn, khuẩn lạc màu xanh trên thạch TCBS do không lên men sucrose, sinh indole, dương tính với lysine và ornithine decarboxylase, là tác nhân gây viêm dạ dày ruột liên quan đến hải sản (Fujino et al., 1953; Daniels et al., 2000).
• Vibrio vulnificus: khuẩn lạc màu xanh trên TCBS, không phát triển trên 40 °C hoặc môi trường không muối, gây nhiễm trùng huyết, viêm mô tế bào hoại tử sau khi ăn hàu sống hoặc vết thương tiếp xúc nước biển (Oliver et al., 1983; Janda et al., 1988).
• Vibrio fluvialis: ưa mặn, phát triển tốt ở nồng độ muối 6%–7%, lên men D-glucose sinh acid và hơi, gây tiêu chảy cấp mất nước (Furniss et al., 1977; Varghese et al., 2006).
• Vibrio alginolyticus: ưa mặn, chịu được nồng độ muối 6%–8%, không lên men lactose, chủ yếu gây nhiễm trùng vết thương ngoài da và nhiễm trùng tai (Hiratsuka et al., 1996; Caccemese et al., 1999).

Vị trí của luận án: Luận án bổ sung dữ liệu thực chứng về sự tồn lưu của các loài Vibrio nói chung và V. cholerae O1 nói riêng tại một địa bàn đặc thù có mạng lưới sông ngòi liên thông với biển và vùng nuôi nghêu tập trung ở Đồng bằng sông Cửu Long. Luận án giải quyết khoảng trống về mối liên hệ giữa kiểu hình đề kháng kháng sinh và cấu trúc di truyền phân tử của gene kháng tetA trên các chủng V. cholerae thực địa so với các chủng chuẩn quốc tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Bộ gene của V. cholerae type sinh học El Tor chủng N16961 gồm hai nhiễm sắc thể vòng: nhiễm sắc thể 1 (Chr 1) có kích thước 2.149 kbp chứa 2.770 khung đọc mở (ORF), mang các gene cốt lõi phục vụ sinh trưởng, sao chép, phiên mã và các yếu tố độc lực chính; nhiễm sắc thể 2 (Chr 2) có kích thước 1.315 kbp chứa 1.115 ORF, được xem là có nguồn gốc từ một megaplasmid tích hợp, đảm nhận chức năng biến dưỡng và điều hòa thích nghi sinh thái ngoài môi trường (Trucksis et al., 1998; Heidelberg et al., 2000).

Cơ chế sinh bệnh của V. cholerae phụ thuộc vào hai yếu tố độc lực trung tâm:

1. Tiêm mao đồng điều hòa độc tố (Toxin Coregulated Pilus - TCP): do cụm gene trên đảo gây bệnh Vibrio (VPI) mã hóa, trong đó subunit tcpA đóng vai trò quyết định khả năng bám dính và tạo khuẩn lạc trên biểu mô vi nhung mao ruột non chuột sơ sinh và người (Taylor et al., 1987; Herrington et al., 1988; Kirn et al., 2000). TCP đồng thời đóng vai trò là thụ thể bề mặt để bacteriophage sợi CTXΦ mang operon độc tố tả xâm nhập vào tế bào vi khuẩn theo cơ chế tiềm tan (Faruque, 1998; Boyd và Waldor, 2002).
2. Độc tố tả (Cholera Toxin - CTX): cấu trúc protein gồm một tiểu đơn vị A và năm tiểu đơn vị B. Tiểu đơn vị B liên kết đặc hiệu với thụ thể ganglioside GM1 trên bề mặt tế bào ruột non. Tiểu đơn vị A sau khi xâm nhập nội bào tách thành hai peptide A1 và A2; peptide A1 thực hiện phản ứng ADP-ribosyl hóa protein gắn GTP, kích hoạt liên tục enzyme adenylate cyclase làm gia tăng nồng độ cAMP nội bào. Sự tăng cao cAMP ức chế hấp thu ion Na⁺ và Cl⁻ đồng thời kích thích bài tiết dịch và điện giải đẳng trương vào lòng ruột, dẫn đến tiêu chảy mất nước cấp tính (Lencer, 2001; Handa, 2003; Torgersen et al., 2001). Quá trình này được kiểm soát qua mạng lưới điều hòa ToxR, TcpP và ToxT (Basel, 2009).

Về mặt sinh thái và thích nghi, vi khuẩn có khả năng chuyển sang trạng thái sống nhưng không nuôi cấy được (VBNC) dưới các tác động bất lợi của môi trường và tạo màng sinh học (biofilm) bám dính trên lớp chitin của động vật phù du (copepod, giáp xác) nhờ enzyme chitinase và mucinase (Huq et al., 1983; Colwell, 2004).

Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn tả được điều khiển bởi các yếu tố di truyền di động như plasmid, transposon, integron và yếu tố liên hợp tích hợp SXT (Burrus et al., 2004; Ghosh et al., 2010). Sự đề kháng với tetracycline chủ yếu qua cơ chế bơm đẩy phụ thuộc năng lượng do các gene tet (như tetA) mã hóa protein xuyên màng.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Quy trình thực nghiệm được triển khai theo các bước chuẩn hóa:

• Thu thập và chuẩn bị mẫu: 160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước (sông, biển, ao tôm), 100 mẫu huyết heo và 40 mẫu phân tiêu chảy.
• Tăng sinh và phân lập: Mẫu được nuôi cấy tăng sinh trong nước peptone kiềm (APW) hoặc nước peptone muối kiềm (ASPW) ở 37 °C trong 6–8 giờ, sau đó cấy ria lên môi trường chọn lọc Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS). Khuẩn lạc lên men sucrose (màu vàng) và không lên men sucrose (màu xanh lá) được tách thuần trên thạch dinh dưỡng bổ sung muối (SNA).
• Thử nghiệm sinh hóa: Kiểm tra phản ứng oxidase, catalase, nhuộm Gram, khả năng lên men và oxy hóa glucose (O/F Glucose), môi trường TSI, thử nghiệm di động, sinh indole, các phản ứng decarboxylase (Lysine Decarboxylase - LDC, Arginine Dihydrolase - ADH, Phenylalanine Deaminase - PAD) và thử nghiệm tính chịu mặn ở các nồng độ NaCl 0%, 3%, 6%, 8%, 10% theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-1:2007. Khẳng định bằng hệ thống định danh trực khuẩn Gram âm bán tự động IDS 14 GNR.
• Định type huyết thanh: Phản ứng ngưng kết trên lam kính sử dụng kháng huyết thanh đa giá polyvalent O1 và các kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu Inaba, Ogawa, cũng như kháng huyết thanh O139.
• Khuếch đại PCR và giải trình tự 16S rRNA: Tách chiết DNA tổng số; khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng cặp mồi phổ thông 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose, giải trình tự chuỗi nucleotide và phân tích đối chiếu bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI.
• Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh: Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh Kirby-Bauer trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI, 2010) đối với 8 kháng sinh: streptomycin (10 µg), norfloxacin (10 µg), ampicillin (10 µg), tetracycline (30 µg), azithromycin (15 µg), amoxicillin/clavulanic acid (30 µg), trimethoprim/sulfamethoxazole (25 µg), và vancomycin (30 µg). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
• Phát hiện gene kháng kháng sinh: Phản ứng PCR xác định 4 gene kháng thuốc gồm: blaSHV (kháng β-lactam), aac(3)-IV (kháng aminoglycoside), tetA (kháng tetracycline, cặp mồi tetAF/tetAR), và dhfrI (kháng trimethoprim). Sản phẩm PCR gene tetA được giải trình tự và so sánh với chủng hoang dại N16961.
• Thử nghiệm độc lực và đáp ứng miễn dịch in vivo: Sử dụng mô hình cột thắt đoạn ruột non thỏ trưởng thành (Removable Intestinal Tie-Adult Rabbit Diarrhoea - RITARD). Thỏ được chia thành nhóm có uống và không uống vaccine tả đường uống thương mại (moORCVAX). Gây nhiễm vi khuẩn V. cholerae phân lập (chủng T1 và T3), sau đó đánh giá thể tích dịch tích tụ (Fluid Accumulation - FA, tính bằng ml dịch/cm chiều dài ruột) và chỉ số bám dính của vi khuẩn trên niêm mạc ruột non tại các thời điểm 9 giờ và 16 giờ sau nhiễm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Giới thiệu

Chương I trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nguy cơ xâm nhập và lây truyền mầm bệnh tả tại tỉnh Trà Vinh – địa bàn giáp ranh tỉnh Bến Tre, nơi có hệ thống sông Cổ Chiên và nghề nuôi nhuyễn thể phát triển mạnh. Đề tài đặt trọng tâm vào việc giải quyết tình trạng đề kháng kháng sinh ngày càng lan rộng trong vi khuẩn gây bệnh đường ruột do tập quán lạm dụng thuốc trong chăn nuôi và y tế. Nội dung chương công bố đầy đủ 4 mục tiêu, nhiệm vụ nghiên cứu, đối tượng, không gian, thời gian lấy mẫu (4/2012–4/2014) và nêu bật ý nghĩa khoa học trong việc phân lập, giải mã di truyền các loài Vibrio lưu hành tại địa phương.

Chương II: Tổng quan tài liệu

Chương II tổng thuật sâu rộng 7 đại dịch tả và các ổ dịch quốc tế đến năm 2012; lịch sử bệnh tả tại Việt Nam từ năm 1850 đến các vụ dịch 2007–2010 tại miền Bắc; đặc điểm sinh học và phân loại của 5 loài Vibrio thường gặp (V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. alginolyticus); cấu tạo kháng nguyên O và H; sinh thái học trong môi trường nước và sinh vật phù du; cấu trúc bộ gene hai nhiễm sắc thể; các yếu tố độc lực (CTX, TCP, VPI, ToxR); cơ chế gây tiết dịch tiêu chảy ở tế bào biểu mô ruột non qua con đường cAMP; tổng quan cơ chế kháng kháng sinh và nguyên lý miễn dịch của vaccine tả đường uống.

Chương III: Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Chương III mô tả chi tiết phương tiện máy móc, hóa chất, môi trường (TCBS, APW, ASPW, TSI, MHA) và hệ thống kít IDS 14 GNR. Quy trình phân lập và định danh sinh hóa tuân thủ chuẩn ISO/TS 21872-1:2007; quy trình ngưng kết kháng huyết thanh đơn giá và đa giá xác định serotype; thông số chu nhiệt và trình tự mồi khuếch đại gene 16S rRNA và các gene kháng kháng sinh (blaSHV, aac(3)-IV, tetA, dhfrI); quy trình thử nghiệm kháng sinh đồ đĩa giấy theo tiêu chuẩn CLSI (2010); và quy trình phẫu thuật gây mê thắt ruột non thỏ theo mô hình RITARD nhằm xác định lượng dịch tích tụ và chỉ số bám dính vi khuẩn.

Chương IV: Kết quả và thảo luận

Từ 450 mẫu ban đầu, đề tài đã phân lập và định danh được 25 chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio, tương ứng với tỉ lệ phát hiện trên các loài và nguồn mẫu được tổng hợp tại Bảng 1.

Bảng 1: Phân bố các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio phân lập được tại Trà Vinh

Tên loài vi khuẩn	Số chủng phân lập	Tỉ lệ trong giống Vibrio (%)	Nguồn mẫu phân lập mang vi khuẩn
Vibrio cholerae	6	24,0%	Nghêu (3 chủng), Huyết heo (2 chủng), Nước sông (1 chủng)
Vibrio parahaemolyticus	8	32,0%	Thủy sản, nước
Vibrio vulnificus	4	16,0%	Thủy sản, nước
Vibrio fluvialis	5	20,0%	Môi trường nước, phân
Vibrio alginolyticus	2	8,0%	Môi trường nước
Tổng cộng	25	100,0%	Nghêu, nước sông, huyết heo

Trong 6 chủng V. cholerae phát hiện được, nguồn phân lập từ nghêu chiếm tỉ lệ cao nhất (50%, 3/6 chủng), tiếp đến là mẫu huyết heo tại cơ sở giết mổ (33,3%, 2/6 chủng) và mẫu nước sông Cổ Chiên (16,7%, 1/6 chủng). Không phát hiện chủng V. cholerae nào trong 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy tại Bệnh viện Đa khoa Trà Vinh trong giai đoạn khảo sát.

Kết quả định type huyết thanh học của 6 chủng V. cholerae cho thấy 100% (6/6 chủng) thuộc nhóm huyết thanh O1; trong đó 50% (3/6 chủng) mang kháng nguyên Inaba và 50% (3/6 chủng) mang kháng nguyên Ogawa. Không phát hiện chủng nào thuộc nhóm huyết thanh O139.

Bảng 2: Kết quả xác định nhóm và type huyết thanh 6 chủng Vibrio cholerae

Ký hiệu chủng	Nguồn gốc mẫu phân lập	Nhóm huyết thanh	Type huyết thanh	Kháng nguyên O
Ng3 (F11)	Mẫu nghêu Duyên Hải	O1	Inaba	A, C
Ng14	Mẫu nghêu Cầu Ngang	O1	Inaba	A, C
Ng22	Mẫu nghêu Cầu Ngang	O1	Ogawa	A, B
H1 (T1)	Mẫu huyết heo Châu Thành	O1	Ogawa	A, B
H2 (T3)	Mẫu huyết heo TP. Trà Vinh	O1	Inaba	A, C
S1 (O9.1)	Mẫu nước sông Cổ Chiên	O1	Ogawa	A, B

Phân tích mức độ tương đồng nucleotide của đoạn gene 16S rRNA bằng công cụ BLAST trên GenBank đối chiếu với các chủng tham chiếu quốc tế (MS6 của Thái Lan, O395 và N16961 của Ấn Độ, M66-62 của Indonesia, LMA 3894-4 của Brazil) cho thấy: 1 chủng trong 6 chủng tương đồng 100% với 56 chủng chuẩn trên thế giới, tương đồng 99% với 32 chủng và tương đồng 99% với 12 chủng gần. Riêng 2 chủng mang gene kháng kháng sinh (T1 và T3) có độ tương đồng 97% với 10 chủng, 96% với 1 chủng và 94% với 2 chủng đối chiếu.

Bảng 3: Mức độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của 6 chủng Vibrio cholerae (CLSI, 2010)

Kháng sinh thử nghiệm	Ký hiệu và nồng độ đĩa	Số chủng kháng (R)	Tỉ lệ kháng (%)	Số chủng nhạy (S)	Tỉ lệ nhạy (%)
Streptomycin	S (10 µg)	3	50,0%	3	50,0%
Tetracycline	TE (30 µg)	2	33,3%	4	66,7%
Trimethoprim/Sulfamethoxazole	SXT (25 µg)	2	33,3%	4	66,7%
Norfloxacin	NOR (10 µg)	0	0,0%	6	100,0%
Ampicillin	AMP (10 µg)	0	0,0%	6	100,0%
Azithromycin	AZM (15 µg)	0	0,0%	6	100,0%
Amoxicillin/Clavulanic acid	AMC (30 µg)	0	0,0%	6	100,0%
Vancomycin	VA (30 µg)	0	0,0%	6	100,0%

Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ cho thấy có hiện tượng kháng thuốc đối với streptomycin (50%), tetracycline (33,3%) và trimethoprim/sulfamethoxazole (33,3%). Hai chủng T1 và T3 phân lập từ huyết heo biểu hiện đặc tính đa kháng kháng sinh (MDR).

Khảo sát sự hiện diện của 4 gene kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR xác định:

• Gene tetA (mã hóa yếu tố kháng tetracycline): dương tính ở 2/6 chủng (chủng T1 và T3).
• Các gene blaSHV (kháng β-lactam), aac(3)-IV (kháng aminoglycoside) và dhfrI (kháng trimethoprim): không phát hiện trên cả 6 chủng kiểm tra.

So sánh trình tự nucleotide và chuỗi amino acid suy diễn của gene tetA ở hai chủng T1 và T3 với chủng hoang dại N16961 phát hiện đột biến chèn (thêm) hoặc mất từ 1 đến 3 nucleotide dẫn đến biến đổi amino acid tại 10 vị trí codon trên chủng T1 và tại 6 vị trí codon trên chủng T3.

Bảng 4: Chỉ số bám dính của vi khuẩn Vibrio cholerae trên niêm mạc ruột non thỏ

Chủng vi khuẩn thử nghiệm	Nhóm thỏ không uống vaccine (9 giờ)	Nhóm thỏ có uống vaccine moORCVAX (9 giờ)	Thời điểm 16 giờ sau nhiễm (cả hai nhóm)
Chủng T1	55,7 ± 13,9	12,4 ± 0,6	0 (không bám dính)
Chủng T3	59,3 ± 4,2	7,41 ± 1,9	0 (không bám dính)

Thí nghiệm in vivo trên mô hình thỏ RITARD khẳng định: Ở thời điểm 9 giờ sau khi gây nhiễm, chỉ số bám dính vào niêm mạc ruột non của thỏ không uống vaccine đạt mức cao (55,7 ± 13,9 đối với chủng T1 và 59,3 ± 4,2 đối với chủng T3). Ở nhóm thỏ đã được uống vaccine moORCVAX, chỉ số bám dính giảm rõ rệt xuống còn 12,4 ± 0,6 (T1) và 7,41 ± 1,9 (T3). Sau 16 giờ gây nhiễm, vi khuẩn bị đào thải hoàn toàn khỏi niêm mạc ruột non (chỉ số bám dính bằng 0) ở tất cả các cá thể thử nghiệm. Kết quả chứng minh các chủng phân lập thực địa chia sẻ cấu trúc kháng nguyên tương đồng với các chủng vi khuẩn được sử dụng sản xuất vaccine tả hiện hành tại Việt Nam.

Chương V: Kết luận và đề nghị

Chương V tóm tắt các phát hiện trọng tâm về tỉ lệ phân lập Vibrio spp. (25 chủng), định danh loài V. cholerae (6 chủng O1 Inaba và Ogawa), thực trạng kháng thuốc đối với streptomycin, tetracycline, SXT, việc xác định đột biến codon trên gene tetA, và hiệu quả bảo hộ ngăn cản bám dính của vaccine tả moORCVAX trên mô hình thỏ. Đề tài đề nghị tiếp tục duy trì mạng lưới kiểm soát định kỳ tại các vùng nuôi nhuyễn thể và cơ sở giết mổ nhằm ngăn chặn nguy cơ bùng phát dịch tả trong cộng đồng.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các đóng góp mới về lý luận khoa học và giá trị thực tiễn:

Về mặt lý luận khoa học:

• Luận án đã xác định được sự lưu hành của 5 loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio (V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. alginolyticus) trong hệ sinh thái nước, thực phẩm thủy sản và phủ tạng động vật tại tỉnh Trà Vinh.
• Khẳng định 100% các chủng V. cholerae phân lập được thuộc nhóm huyết thanh O1, phân bố đồng đều giữa hai type huyết thanh Inaba (50%) và Ogawa (50%); không phát hiện chủng O139.
• Xác định mức độ tương đồng trình tự nucleotide gene 16S rRNA của các chủng V. cholerae Trà Vinh đạt mức tương đồng cao (từ 94% đến 100%) so với các chủng chuẩn lưu hành tại Đông Nam Á (Thái Lan, Indonesia) và các quốc gia khác (Ấn Độ, Brazil).
• Xác định cấu trúc đột biến phân tử của gene kháng tetracycline (tetA) ở các chủng phân lập từ huyết heo (T1, T3), chỉ ra các đột biến chèn và mất 1–3 nucleotide trên 10 vị trí codon (chủng T1) và 6 vị trí codon (chủng T3) so với chủng hoang dại N16961.
• Chứng minh trên mô hình thực nghiệm động vật thỏ RITARD rằng vaccine tả đường uống moORCVAX đang lưu hành có khả năng ức chế hiệu quả sự bám dính của các chủng V. cholerae O1 phân lập tại Trà Vinh vào niêm mạc ruột non.

Về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất:

• Cung cấp dẫn liệu khoa học về nguy cơ lây truyền phẩy khuẩn tả từ nguồn nhuyễn thể hai mảnh vỏ (nghêu) và nguồn nước sông tự nhiên tiếp giáp các vùng dịch cũ.
• Cảnh báo sự xuất hiện của V. cholerae O1 đa kháng thuốc (kháng streptomycin, tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole) trên động vật giết mổ (huyết heo), chỉ ra mắt xích tiềm ẩn trong chuỗi truyền lây mầm bệnh từ gia súc sang người qua thực phẩm.
• Đề xuất định hướng điều trị: vi khuẩn phân lập vẫn nhạy cảm 100% với norfloxacin, ampicillin, azithromycin và amoxicillin/clavulanic acid; do đó các cơ sở y tế địa phương cần lựa chọn kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ thực địa, tránh dùng tetracycline hay co-trimoxazole khi chưa có chỉ định vi sinh nhằm hạn chế thất bại điều trị.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Số lượng chủng vi khuẩn V. cholerae phân lập được còn hạn chế (6 chủng từ 450 mẫu), do đó các phân tích về tần suất kháng thuốc và phân bố đột biến di truyền mang tính phản ánh cụ thể trên nhóm mẫu thu thập.
• Trong giai đoạn nghiên cứu (4/2012–4/2014), không thu thập được chủng V. cholerae nào từ 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh, khiến luận án thiếu dữ liệu đối chiếu trực tiếp giữa các chủng phân lập từ môi trường, thực phẩm với các chủng lâm sàng cùng thời điểm tại địa phương.
• Trong số 4 gene kháng kháng sinh được khảo sát bằng PCR (blaSHV, aac(3)-IV, tetA, dhfrI), chỉ có gene tetA được phát hiện; các cơ chế di truyền quy định kiểu hình kháng streptomycin và trimethoprim/sulfamethoxazole ở các chủng nghiên cứu chưa được giải mã chi tiết trong khuôn khổ đề tài.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng quy mô và tần suất thu thập mẫu theo chu kỳ mùa vụ qua các năm tại các vùng cửa sông, bãi nuôi nghêu và các trại chăn nuôi, cơ sở giết mổ gia súc.
• Tầm soát thêm các gene kháng thuốc nằm trên integron nhóm 1, nhóm 2 và yếu tố liên hợp SXT nhằm làm rõ bản chất di truyền của tính kháng đa kháng sinh ở các chủng V. cholerae.
• Tiếp tục theo dõi biến động cấu trúc kháng nguyên O1 và O139 trên các chủng vi khuẩn tả lưu hành trong tự nhiên để đánh giá tính tương thích kháng nguyên bảo hộ của các thế hệ vaccine tả đường uống tiếp theo.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Dịch tễ học, Thú y và Bệnh học thủy sản: có thể tham khảo quy trình phân lập, giám định sinh hóa vi khuẩn Vibrio theo chuẩn ISO/TS 21872-1:2007; các kỹ thuật khuếch đại, giải trình tự gene 16S rRNA và phân tích đột biến gene kháng thuốc tetA.
• Cán bộ y tế dự phòng và bác sĩ truyền nhiễm: tài liệu cung cấp số liệu thực chứng về tính nhạy cảm và kháng thuốc của V. cholerae đối với 8 loại kháng sinh thông dụng, hỗ trợ xây dựng hướng dẫn điều trị bệnh tả đường ruột tại địa phương.
• Cán bộ thú y và nhà quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm: luận án cung cấp bằng chứng thực địa về sự hiện diện của V. cholerae O1 trên nhuyễn thể và huyết gia súc, hỗ trợ thiết lập quy trình kiểm soát vi sinh tại các bãi nuôi thủy sản và lò giết mổ tập trung.
• Phần đáng tham khảo nhất trong luận án là quy trình thực nghiệm mô hình cột thắt đoạn ruột non thỏ (RITARD) để đánh giá chỉ số bám dính niêm mạc và khả năng bảo hộ của vaccine tả in vivo, là mô hình thực nghiệm động vật có độ chuẩn xác cao trong nghiên cứu bệnh học vi sinh đường ruột.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1: Tỉ lệ phân lập và thành phần các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio được phát hiện trong nghiên cứu là bao nhiêu?

Trong tổng số 450 mẫu khảo sát, nghiên cứu đã phân lập và định danh được 25 chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio (tương ứng tỉ lệ 100% mẫu dương tính với chi này), bao gồm 5 loài:

• Vibrio parahaemolyticus: 8 chủng (chiếm 32,0%).
• Vibrio cholerae: 6 chủng (chiếm 24,0%).
• Vibrio fluvialis: 5 chủng (chiếm 20,0%).
• Vibrio vulnificus: 4 chủng (chiếm 16,0%).
• Vibrio alginolyticus: 2 chủng (chiếm 8,0%).

Câu hỏi 2: Sáu chủng Vibrio cholerae phân lập được có nguồn gốc từ đâu và mang type huyết thanh học nào?

Sáu chủng V. cholerae được phân lập từ 3 nguồn mẫu khác nhau:

• 3 chủng từ mẫu nghêu thu tại huyện Duyên Hải và Cầu Ngang (chiếm 50%).
• 2 chủng (ký hiệu T1 và T3) từ mẫu huyết heo tại cơ sở giết mổ huyện Châu Thành và TP. Trà Vinh (chiếm 33,3%).
• 1 chủng từ mẫu nước sông Cổ Chiên tại TP. Trà Vinh (chiếm 16,7%). Về đặc điểm huyết thanh học, 100% (6/6) chủng đều thuộc nhóm huyết thanh O1, trong đó 50% (3/6) là type Inaba và 50% (3/6) là type Ogawa. Nghiên cứu không ghi nhận chủng nào thuộc nhóm huyết thanh O139.

Câu hỏi 3: Tính kháng kháng sinh và các gene kháng thuốc của các chủng Vibrio cholerae biểu hiện ra sao?

Thử nghiệm kháng sinh đồ đĩa giấy Kirby-Bauer theo chuẩn CLSI (2010) với 8 loại kháng sinh cho thấy:

• Kháng streptomycin: 50% (3/6 chủng).
• Kháng tetracycline: 33,3% (2/6 chủng).
• Kháng trimethoprim/sulfamethoxazole: 33,3% (2/6 chủng).
• Nhạy cảm hoàn toàn (100%): norfloxacin, ampicillin, azithromycin, amoxicillin/clavulanic acid và vancomycin. Về mặt di truyền, kỹ thuật PCR phát hiện gene tetA (mã hóa kháng tetracycline) hiện diện trên 2 chủng (T1 và T3). Cả 6 chủng đều âm tính với các gene blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI.

Câu hỏi 4: Đột biến trên gene tetA ở hai chủng T1 và T3 có đặc điểm gì so với chủng hoang dại N16961?

Khi giải trình tự và so sánh với chủng chuẩn hoang dại V. cholerae N16961, đoạn gene tetA của hai chủng phân lập tại Trà Vinh ghi nhận hiện tượng đột biến chèn hoặc mất từ 1 đến 3 nucleotide:

• Chủng T1: xuất hiện biến đổi tại 10 vị trí codon.
• Chủng T3: xuất hiện biến đổi tại 6 vị trí codon. Các biến đổi nucleotide này làm thay đổi chuỗi amino acid tương ứng của protein bơm đẩy tetA.

Câu hỏi 5: Thử nghiệm trên mô hình thỏ RITARD chứng minh điều gì về độc lực vi khuẩn và hiệu quả của vaccine tả moORCVAX?

Thử nghiệm trên thỏ cho thấy:

• Ở thời điểm 9 giờ sau khi gây nhiễm, chỉ số bám dính niêm mạc ruột non của chủng T1 và T3 ở thỏ không uống vaccine đạt mức cao (lần lượt là 55,7 ± 13,9 và 59,3 ± 4,2). Ở thỏ đã được uống vaccine moORCVAX, chỉ số bám dính giảm xuống rõ rệt (lần lượt là 12,4 ± 0,6 và 7,41 ± 1,9).
• Sau 16 giờ, không còn ghi nhận hiện tượng vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột non ở tất cả các cá thể thỏ. Kết quả khẳng định các chủng V. cholerae O1 phân lập tại Trà Vinh có cấu trúc kháng nguyên tương đồng với các chủng vi khuẩn được sử dụng để điều chế vaccine tả đường uống moORCVAX đang lưu hành tại Việt Nam, và vaccine có hiệu lực ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn vào biểu mô ruột non.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Đấu đã xác định được sự hiện diện của 5 loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio tại tỉnh Trà Vinh, trong đó phân lập được 6 chủng V. cholerae đều thuộc nhóm huyết thanh O1 (chia đều cho hai type Ogawa và Inaba) từ các nguồn mẫu nghêu, nước sông và huyết heo. Nghiên cứu đã chứng minh sự tồn tại của kiểu hình đa kháng kháng sinh (kháng streptomycin, tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole) gắn liền với sự hiện diện và đột biến nucleotide trên gene tetA ở các chủng vi khuẩn phân lập từ gia súc giết mổ. Đồng thời, các thử nghiệm in vivo trên mô hình thỏ RITARD đã khẳng định hiệu quả ức chế bám dính niêm mạc ruột non của vaccine tả thương mại moORCVAX đối với các chủng V. cholerae thực địa. Những kết quả thực nghiệm này cung cấp cơ sở dữ liệu vi sinh và di truyền học quan trọng cho công tác giám sát dịch tễ học bệnh tả, kiểm soát an toàn thực phẩm thủy hải sản và xây dựng phác đồ điều trị kháng sinh hợp lý tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V.

cholerae type sinh học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005). Ở Việt Nam, bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tiêu chảy hơn một thế kỷ nay, với 2.000 trường hợp được báo cáo trong năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả với tỉ lệ tử vong lên đến 50% và đến năm 1910-1930 có 5.000 trường hợp bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962).

Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xảy ra 3 đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm ở 18 tỉnh, thành thuộc cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Năm 2009 - 2010, dịch tả lại xuất hiện tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (Nguyen et al. Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010.

Biển Duyên Hải và Cầu Ngang thuộc tỉnh Trà Vinh là vùng chuyên nuôi trồng thủy sản, trong đó phổ biến nhất là nghêu và tôm. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh thức ăn hải sản là nguồn lưu trữ vi khuẩn gây bệnh tả được xác định là V. Vi khuẩn này có cấu trúc gene của chủng thuộc type sinh học El tor, nhưng lại mang gene độc lực của type sinh học cổ điển, khiến nó tăng độc lực và gây bệnh với triệu chứng lâm sàng nặng hơn, người khỏe mang trùng và thời gian mang trùng dài hơn, khả năng tồn tại lâu hơn trong môi trường (Boyd et al. 1 Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy triệu chứng chính của bệnh tả trên người là do độc tố của vi khuẩn V.

cholerae gây ra. Vi khuẩn có mặt ở các môi trường nước biển và nguồn nước bị ô nhiễm (Nguyen Binh Minh et al. Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng.

Nhiễm sắc thể được chứng minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al. Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus et al. Thực phẩm và nước ô nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, càng quan tâm hơn nữa là kháng sinh được bổ sung vào thức ăn cho động vật đã góp phần vào việc kháng kháng sinh khi điều trị bệnh trên người (Smith et al, 1999).

Nhiều nghiên cứu về V. cholerae được phân lập từ các nguồn nước sông và nước biển, trên các loại mẫu thức ăn hải sản đều cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết các kháng sinh thường được sử dụng, điều này có thể khẳng định trong thực tế việc kháng kháng sinh đang gia tăng cả trong lĩnh vực chăn nuôi trang trại và y tế công cộng, đây cũng là vấn đề toàn cầu trong những thập kỷ gần đây do sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong các trang trại chăn nuôi và thực phẩm làm thức ăn gia súc, gia cầm (Teuber, 2001; Bywater, 2004). Với tính chất lây lan và nguy hiểm của bệnh dịch tả, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu này được thực hiện nhằm góp phần xác định tỉ lệ nhiễm của vi khuẩn V. cholerae và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn đang gia tăng cả trong môi trường và thức ăn từ hải sản, cùng với mục tiêu xác định mối liên quan về đặc điểm di truyền gene kháng kháng sinh của V.

cholerae phân lập được từ môi trường nước và trên các loại mẫu có nguồn gốc từ hải sản. Nghiên cứu đã tiến hành từ năm 2012 đến 2014 với nội dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 1.1 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V. cholerae phân lập được. - Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng V.

- Xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng Vibrio cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường. - Định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, định danh các loài thuộc Vibrio spp., trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản (tôm, nghêu) ở huyện Duyên Hải và Cầu Ngang; mẫu nước (sông, ao nuôi tôm, nước biển) tại thành phố Trà Vinh bắt nguồn từ sông Cổ Chiên và nước ao nuôi tôm tại huyện Duyên Hải; mẫu huyết heo từ các cơ sở giết mổ ở Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang, huyện Càng Long; mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh. Các giống vi khuẩn thuộc Vibrio được kiểm tra độ dài DNA bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA, sau đó tìm sự tương đồng về trình tự nucleotide với những chủng khác bằng công cụ BLAST.

Xác định sự kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae dựa trên các cặp mồi blaSHV (gene mã hoá kháng β-Lactam), aac(3)-IV (gene mã hoá kháng aminogly-cosid), tetA (gene mã hoá tính kháng tetracycline), dhfrI (gene mã hoá kháng trimethoprim); so sánh tính đột biến với các chủng V. cholerae hoang dại. Thử nghiệm trên thỏ nhằm khảo sát tính miễn dịch đối với vaccine hiện hành và sự đột biến đối với vi khuẩn phân lập được.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio trong đó loài V.

cholerae được nghiên cứu về sự đột biến và tính kháng kháng sinh. 3 Phạm vi nghiên cứu: 5 loại mẫu thu thập từ 4 huyện, 1 thành phố thuộc tỉnh Trà Vinh: mẫu nghêu (thu mua tại huyện Duyên Hải và Cầu Ngang), mẫu huyết heo (thu tại cơ sở giết mổ ở thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang và Càng Long), mẫu nước (nước ao nuôi tôm ở huyện Cầu Ngang và Duyên Hải, nước biển ở huyện Duyên Hải, nước sông tại thành phố Trà Vinh và sông Cổ Chiên), mẫu tôm (thu mua tại chợ huyện Duyên Hải); mẫu phân bệnh nhân có triệu chứng tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa Trà Vinh.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 4/2012 – 4/2014, tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ; Bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Bệnh viện trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ và Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản, trường Đại học Trà Vinh.5 Những đóng góp của luận án - Phân lập được 6 chủng V. cholerae và tỉ lệ nhiễm V. cholerae trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản như nghêu, tôm và mẫu nước từ môi trường nước sông và nước ao nuôi tôm.

- Xác định được type huyết thanh học Ogawa và Inaba của các gốc V. cholerae phân lập. - Xác định được sự tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng V. cholerae phân lập được với trình tự nucleotide của những chủng V.

cholerae ở các nước thuộc vùng Đông Nam Á dựa vào đoạn 16SrDNA. - Xác định được tính kháng kháng sinh của V. cholerae đối với kháng sinh vancomycin, streptomycin, azithromycin, trimethoprim-sulfamethoxazol và tetracycline. - Xác định được sự đột biến gene kháng tetracycline của V.

cholerae phân lập được.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án * Ý nghĩa khoa học: Định danh được 5 loài thuộc giống Vibrio hiện đang phổ biến ở trong môi trường nước sông, thức ăn có nguồn gốc thủy sản và có thể gây bệnh cho người. Kết quả của đề tài có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. * Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp số liệu về tỉ lệ nhiễm các loài thuộc giống Vibrio và sự kháng kháng sinh của V. 4 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) Năm 1816 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ, đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 đại dịch tả lan khắp thế giới.

Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi gây bệnh của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây bệnh chủ yếu xuất hiện ở Đông Nam Á. Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch tại Philippines và tạo làn sóng thứ bảy. Từ đó trở đi type vi khuẩn này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần Châu Âu (Colwell, 2004). Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn V.

cholerae O1 đã xảy ra ở Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất hiện và lây lan nhanh chóng bởi V.