mở đầu cho việc ứng dụng liệu pháp phage trong phòng và trị bệnh gan thận mủ ở cá tra. Trên cơ sở đó, để có thể thực hiện các thử nghiệm lâm sàng, tiến đến sản xuất thương mại chế phẩm phage, các dòng phage cần phải được phân tích đặc tính sinh học, kiểm tra trình tự genome, tìm hiểu các đặc tính xâm nhiễm cũng như khả năng sản xuất chế phẩm phage. Do đó, đề tài luận văn Thạc sĩ này được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề trên. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá tính an toàn của thực khuẩn thể PVN09 để dùng kháng bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình sản xuất chế phẩm thực khuẩn thể này.
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung sau: - Phân tích trình tự bộ gene phage PVN09 phân lập từ gan cá tra; - Xác định phổ xâm nhiễm của phage PVN09; - Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố (loại môi trường, MOI, pH, tốc độ lắc, nhiệt độ, thời điểm xâm nhiễm và chất bổ trợ) đến quá trình sản xuất chế phẩm phage PVN09, mẻ 40 mL. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là phage PVN09 được phân lập từ gan cá tra do Th.S Phạm Đỗ Trà My thực hiện, năm 2018 và vi khuẩn chủ Edwardsiella ictaluri E1 được cung cấp bởi Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ, năm 2015. Đề tài ứng dụng các đối tượng nghiên cứu trên để sản xuất chế phẩm phage theo phương pháp mẻ 40 mL. Tính cấp thiết và ý nghĩa khoa học của đề tài Liệu pháp phage là liệu pháp có vị trí quan trọng trong việc thay thế kháng sinh trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở cá.
Do đó, sự an toàn và đặc tính của phage là cần thiết để ứng dụng liệu pháp phage trong phòng ngừa bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra. Kết quả nghiên cứu của đề tài là một phần trong đề tài cấp ĐHQG – HCM, loại B, mã số 562-2020-20-1, kéo dài 24 tháng thực hiện từ tháng 1/2020, do PGS.TS Lê Phi Nga chủ nhiệm; đồng thời, đề tài là cơ sở khoa học để thực hiện các nghiên cứu thử nghiệm trên cá tra và định hướng sản xuất chế phẩm phage ở quy mô lớn hơn. Tình hình nuôi trồng và dịch bệnh bệnh trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở Việt Nam 2.1 Tình hình nuôi trồng cá tra P. hypophthalmus tại Việt Nam Việt Nam – quốc gia có đường bờ biển dài và nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa – có truyền thống nuôi trồng thủy sản lâu đời, trong đó, tôm và cá tra là hai đối tượng được nuôi trồng và xuất khẩu nhiều nhất; cá tra là mặt hàng xuất khẩu thứ 2 (sau tôm), chiếm 17.7% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản.
Cá tra được nuôi tập trung ở khu vực ĐBSCL với gần 4000 ha ương dưỡng cá tra giống, sản xuất được khoảng 2 tỷ cá tra giống theo báo cáo thống kê của Hiệp hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản Việt Nam năm 2020 [1]. Khu vực ĐBSCL hiện có khoảng 120 cơ sở sản xuất cá tra giống và cả nước có gần 100 nhà máy chế biến, sản xuất các sản phẩm từ cá tra với các trang thiết bị tiên tiến, tự động hóa, tuân thủ các tiêu chuẩn chất lượng quốc tế và an toàn thực phẩm nghiêm ngặt như GlobalGAP, ASC, BAP, v. Nhờ giá trị dinh dưỡng, nhu cầu nguồn cung cá tra không ngừng tăng cao và “đòn bẩy” là các hiệp định thương mại tự do (theo Tổng cục Thống kê), cá tra đã và đang chiếm một tỷ trọng rất lớn trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam [2]. Giá trị xuất khẩu cá tra từ năm 2017 đến Quý I/2022 và dự kiến năm 2022 được mô tả như Hình 2.
Giá trị xuất khẩu cá tra 2017 - Quý I/2022 2.5 0 2017 2018 2019 2020 2021 I/2022 Dự kiến Thời gian (năm) 2022 Hình 2. Giá trị xuất khẩu cá tra từ 2017 đến Quý I/2022 3 Năm 2021, xuất khẩu cá tra đạt hơn 1.4 tỷ USD, tăng 1.3% so với cùng kỳ năm 2020 [3]. Đầu năm 2022, tình hình xuất khẩu cá tra có nhiều chuyển biến tích cực. Trong quý I/2022, xuất khẩu cá tra đạt 646 triệu USD, hướng đến mục tiêu đạt 2 tỷ USD trong năm 2022 [4].
Để đạt được mục tiêu trên kết hợp nhu cầu cá tra ngày càng cao, cần có các biện pháp đảm bảo điều kiện nuôi cá tra, an toàn vệ sinh thực phẩm, tuân thủ chất lượng sản phẩm xuất khẩu, đầu tư lâu dài và phát triển bền vững. Tuy nhiên, biến đổi khí hậu ngày càng diễn ra một cách cực đoan, tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng cá tra P. hypothalmus cần được theo dõi và chuẩn bị các phương án phòng trừ thích hợp, hạn chế rủi ro, đảm bảo số lượng và chất lượng cá tra. Dịch bệnh trong nuôi trồng cá tra P.
hypophthalmus Vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm là ba tác nhân chủ yếu gây bệnh trên cá tra tại ĐBSCL, ngoài ra còn có các hội chứng vàng da, bệnh trắng gan trắng mang, v. Trong đó, các bệnh do vi khuẩn gây tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cá tra, đặc biệt là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ và vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết [7–10]. Nội tạng cá tra biểu hiện nhiều đốm trắng do E. ictaluri gây ra [10] Bệnh gan thận mủ là một trong những bệnh nguy hiểm, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho người nuôi trồng cá tra ở tất cả giai đoạn phát triển của cá, đặc biệt là giai đoạn cá giống.
Bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa, khi nhiệt độ xuống dưới 28 o C, đặc biệt là vào các tháng 7, 8 và 9 thông qua sự sự xuất hiện của các đốm trắng đục có kích thước từ 1 – 3 mm ở gan, thận, v. ictaluri là nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra P. Tại Mỹ, cá nheo Ictalurus punctatus cũng xuất hiện bệnh nhiễm trùng huyết (Enteric Septicemia of Catfish – ESC) cũng do vi khuẩn E. ictaluri gây nên, ước lượng tử vong khoảng 60% [11].
Trước những hậu quả nặng nề của bệnh gan thận mủ trên đàn cá tra P. hypophthalmus, việc hiểu rõ về đối tượng gây bệnh, vi khuẩn E. ictaluri, là cần thiết, để có những biện pháp phòng và điều trị bệnh hiệu quả. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Edwardsiella ictaluri thuộc vi khuẩn Gram âm, có môi trường sống và phạm vi ký chủ hạn chế, thường được tìm thấy trong môi trường nước ngọt và nước biển [12].
Hình thái vi khuẩn E. ictaluri [7], [13]; TEM (A), SEM (B), nhuộm Gram (C), hình thái khuẩn lạc sau 48 giờ ở 30 ± 2oC (D) Đặc điểm phân loại khoa học của vi khuẩn này được thể hiện ở Bảng 2. Chi Edwardsiella có 4 loài chủ yếu: E. ictaluri có đặc điểm tương đồng nhất với vi khuẩn E.
tarda (50 – 62% DNA); do đó, thường được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp để phân loại đặc điểm sinh lý, sinh hóa, hình thái tế bào, v. ictaluri là vi khuẩn hình que (0.3) di chuyển nhờ tiên mao như mô tả của tác giả Từ Thanh Dung, năm 2010 [16], chuyển động kém ở 25 – 30 oC nhưng không di chuyển ở nhiệt độ cao hơn. Khuẩn lạc phát triển trên môi 5 trường BHI từ 36 – 48 giờ ở 28 – 30 oC, phát triển kém ở 37 oC. Hầu hết các chủng E.
ictaluri phân lập từ các môi trường và vùng địa lý khác nhau đều là vi khuẩn hiếu khí; tuy nhiên, các chủng E. ictaluri có khả năng sống yếm khí cũng đã được báo cáo [15, 17–19]. Phân loại khoa học vi khuẩn E. ictaluri [17] Phân loại khoa học Giới Bacteria Ngành Proteobacteria Lớp Gammaproteobacteria Bộ Enterobacteriales Họ Enterobacteriaceae Chi Edwardsiella Loài Edwardsiella ictaluri Với các đặc điểm trên, vi khuẩn E.
ictaluri không chỉ gây bệnh gan thận mủ trên cá tra P. hypophthalmus ở Việt Nam, mà còn gây bệnh trên cá da trơn Clarius batrachus ở Thái Lan, cá trê vàng Pelteobagrus fulvidraco ở Trung Quốc, cá Ayu Plecoglossus altevelis ở Nhật Bản và nhiều loài cá khác với tỉ lệ tử vong cao (10 – 90 %) [15]. Để giảm mức thiệt hại cũng như phòng tránh sự nhiễm bệnh trên cá do vi khuẩn E. ictaluri gây nên, cần có các biện pháp phòng và điều trị bệnh hiệu quả, an toàn và bền vững.
Các phương pháp phòng và điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra P. hypothalmus Đối với công tác phòng và điều trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản nói chung và bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra nói riêng, chất lượng giống, nguồn thức ăn, điều kiện ao nuôi, các biện pháp dự phòng như sử dụng vắc xin, theo dõi tình trạng cá theo vụ mùa, thời tiết, … cần được đảm bảo trong từng bước để hạn chế và giảm thiểu rủi ro khi dịch bệnh xảy ra [20]. Tuy nhiên, trong trường hợp dịch bệnh bùng phát, kháng sinh là biện pháp nhanh và hiệu quả nhất với 6 hầu hết người nuôi trồng thủy sản nhờ những ưu điểm vượt bậc của kháng sinh trong điều trị bệnh: dễ sử dụng và hiệu quả tức thời.
Song, việc không tìm hiểu kỹ về nguyên nhân gây bệnh cũng như việc sử dụng kháng sinh quá mức cho phép đã gây ra những hậu quả nặng nề. Đây có thể được xem là những khó khăn khi sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh trên cá ở giai đoạn hiện nay. Đầu tiên, việc sử dụng kháng sinh quá liều, lượng thức ăn dư thừa và phân cá chứa kháng sinh sẽ lắng xuống đáy ao hoặc kháng sinh sẽ bị rửa trôi qua các vùng lân cận. Việc thải bỏ nước ao nuôi cá tra không qua xử lý làm ảnh hưởng đến chất lượng nguồn nước.
Ngoài ra, lượng kháng sinh thải ra ngoài môi trường gây ảnh hưởng đến các sinh vật khác, làm tăng khả năng kháng kháng sinh của nhiều vi sinh vật [21–23]. Thứ hai, lượng kháng sinh quá mức cho phép có nguy cơ còn tồn đọng trong các sản phẩm từ cá, gây ảnh hưởng đến kinh tế của ngành xuất khẩu thủy sản. Giai đoạn 2006 – 2010, Việt Nam là một trong ba nước đứng đầu về số vụ bị từ chối nhập khẩu thủy sản vào 4 thị trường EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản và Úc theo thống kê của Tổ chức Phát triển Công nghiệp Liên hợp quốc (UNIDO) [21–23]. Thứ ba, sử dụng quá liều và kết hợp các loại kháng sinh trong điều trị bệnh ở cá đã gây xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh [21, 23].
ictaluri gây bệnh trên cá tra P. hypophthalmus kháng nhiều loại kháng sinh, được ghi nhận ở Bảng 2.