I. Tổng Quan Về Nấm Sợi Aspergillus Niger Giới Thiệu
Aspergillus niger là một trong những loài nấm sợi phổ biến và quan trọng nhất thuộc chi Aspergillus. Loài nấm này có thể được tìm thấy khắp nơi trên Trái Đất, từ đất, thức ăn, các sản phẩm thực vật và ngay cả trong không khí. A. niger đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn và sản phẩm do nó sinh ra được sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm và đồ uống. A. niger có khả năng tiết nhiều loại enzyme vào môi trường nuôi cấy, do đó loài nấm này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các axit hữu cơ và các enzyme ngoại bào, điển hình là axit citric, axit gluconic, các enzyme quan trọng như phytase, amylase, protease, α-galactosidase và hàng loạt các enzyme khác. Nghiên cứu chức năng gen ở nấm sợi đã có những bước tiến lớn trong những năm gần đây.
1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu và Đặc Điểm Sinh Học Nấm Aspergillus Niger
Chi Aspergillus là một chi nấm sợi gồm hàng trăm loài phân bố ở các điều kiện khí hậu khác nhau trên toàn thế giới, bao gồm một số tác nhân gây bệnh cơ hội (A. terreus), sản xuất độc tố (A. parasiticus) và các loài được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp như A. oryzae, trong đó nổi bật hơn cả là A. niger. Năm 1867, lần đầu tiên A. niger được mô tả bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem trong bản thảo ―Physiologie des mucédiпées”. Khi đó, ông phân lập được Aspergillus sp. có bào tử tương tự như Aspergillus glaucus nhưng có màu đen trên các môi trường khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác. Ông đã đặt tên cho loài nấm này là A. niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm Nigri hay tên gọi khác là phân nhóm Aspergillus đen [45].
1.2. Phân Bố và Môi Trường Sống Của Nấm Sợi Aspergillus Niger
Aspergillus niger phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, nó có thể được phân lập trên tất cả các châu lục và không có sự chọn lọc nào với điều kiện môi trường, chúng sinh trưởng một cách tự nhiên trên vật chất hữu cơ [92]. Loài nấm này phát triển mạnh trong đất và rác, phân compost và nguyên liệu thực vật đang phân rã, thậm chí có thể được tìm thấy trong môi trường băng giá và môi trường biển. A. niger là vi sinh vật hiếu khí, sinh trưởng và phát triển khi có mặt oxy. Chúng có thể sinh trưởng ở các điều kiện môi trường đa dạng từ nhiệt độ đến pH. A. niger phát triển ở nhiệt độ từ 6 - 47°C, tối ưu ở khoảng 35 - 37°C. A. niger sinh trưởng rất rộng, từ 1,5 - 9,8 và tối ưu nhất là ở pH = 6 [7, 41, 57].
II. Hình Thái và Cấu Trúc Tế Bào Nấm Aspergillus Niger
Ở 30°C, đường kính khuẩn lạc của A. niger tăng khoảng 0,25 mm trong vòng 1 giờ với điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy rằng vùng mép ngoài của khuẩn lạc A. niger 7 ngày tuổi chỉ gồm một lớp sợi nấm duy nhất. Một vài milimet phía trong vùng ngoại vi thì hệ sợi dày hơn và có thể lên đến sáu lớp sợi nấm chồng lên nhau. Sáu lớp sợi nấm này chia thành 3 lớp riêng biệt: lớp trên cùng, lớp dưới cùng và các lớp ở giữa gồm mạng lưới hệ sợi mỏng và dày. Cấu trúc hệ sợi với ba lớp riêng biệt cũng được quan sát thấy ở trung tâm của khuẩn lạc [47].
2.1. Quá Trình Phát Triển và Sinh Sản Vô Tính Của Aspergillus Niger
Sau thời kỳ tăng trưởng sinh dưỡng, A. niger tạo thành hai loại sợi nấm khí sinh. Một loại khá giống với sợi nấm sinh dưỡng và có đường kính khoảng 2 - 3 µm, loại còn lại có đường kính khoảng 6 - 7 µm. Các sợi nấm khí sinh đường kính 2 - 3 µm của được hình thành sau khi cấy bào tử trên môi trường đầy đủ khoảng 8 giờ. Mặc dù thời gian hình thành sợi nấm khí sinh dường như không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy nhưng mật độ của chúng trên môi trường tối thiểu thấp hơn so với môi trường đầy đủ. Sự hình thành của hệ sợi khí sinh bắt đầu ở trung tâm khuẩn lạc, di chuyển ra ngoài và dừng lại khi cách mép hệ sợi nấm vài milimet.
2.2. Cấu Trúc Sinh Sản Vô Tính Đặc Trưng Của Nấm Aspergillus Niger
A. niger cũng như phần lớn các loài thuộc chi Aspergillus được biết mới chỉ có hình thức sinh sản vô tính với cấu trúc sinh bào tử khá đặc trưng [5]. Cấu trúc sinh bào tử được biệt hóa từ cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử đầu tiên của A. niger hình thành sau 10 giờ và cấu trúc sinh bào tử hình thành sau 20 giờ nuôi cấy ở 30°C. Khi cuống sinh bào tử đạt đến chiều cao tối đa của nó, phần đỉnh sợi sẽ phồng lên và hình thành bọng bào tử có đường kính 10 μm. Trên các bọng bào tử này sẽ hình thành các chồi, từ đó phát triển thành thể bình. Thể bình gồm hai lớp, lớp thể bình sơ cấp hình tam giác cân ngược, lớp thể bình thứ cấp hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 µm [27].
III. Đặc Điểm Di Truyền và Vai Trò Của Nấm Aspergillus Niger
Kích thước hệ gen của A. niger ước tính vào khoảng từ 35,5 - 38,5 megabase (Mb) gồm tám nhiễm sắc thể có kích thước khác nhau, dao động từ 3,5 - 6,6 Mb. Năm 2007, trình tự toàn bộ hệ gen của chủng A. niger ATCC 1015 đã được công bố và dữ liệu hệ gen được lưu trữ tại http://www.aspergillusgenome.org. Kích thước hệ gen của A. niger ATCC 1015 là 33,9 Mb; gồm 14165 gen được dự đoán là mã hóa cho protein. Trong đó, khoảng 6505 protein có thể thuộc các nhóm protein chức năng liên quan đến chuyển hóa, vận chuyển nội bào và số phận (cuộn gập, chỉnh sửa và hướng đích) của protein [79].
3.1. So Sánh Hệ Gen Aspergillus Niger Với Các Loài Nấm Sợi Khác
Một so sánh chi tiết về các nhóm protein chức năng đã được thực hiện giữa A. niger và một số loài nấm sợi khác (Hình 1.2). Kết quả cho thấy, so với các loài nấm sợi khác, A. niger chứa một lượng đáng kể các protein đặc trưng liên quan đến chuyển hóa các hợp chất cacbon, cacbohydate, lipid, axit béo, isoprenoid và chuyển hóa thứ cấp. Trong khi đó, số lượng protein đặc trưng liên quan đến vận chuyển tế bào, quá trình tiết và số phận của protein là khá ổn định giữa các loài nấm sợi khác nhau. A. niger rõ ràng có thể sử dụng bộ máy tiết protein của nó một cách rất hiệu quả và linh hoạt như một nhà máy tế bào đầy triển vọng cho ngành công nghiệp công nghệ sinh học [79].
3.2. Ứng Dụng Quan Trọng Của Nấm Sợi Aspergillus Niger Trong Công Nghiệp
Aspergillus niger là một trong những vi sinh vật quan trọng nhất được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để sản xuất công nghiệp phụ gia thực phẩm, axit hữu cơ và các enzyme ngoại bào [9, 92]. A. niger sử dụng an toàn và có lịch sử lâu đời trong sản xuất enzyme và axit hữu cơ. Nhiều sản phẩm trong số này được công nhận là an toàn (GRAS) bởi Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) [92]. Sản xuất axit hữu cơ có một vị trí quan trọng trong sản xuất công nghệ sinh học của hóa chất hàng hóa – hóa chất được sản xuất với quy mô rất lớn để đáp ứng thị trường toàn cầu.
IV. Sản Xuất Axit Citric Từ Nấm Aspergillus Niger Quy Trình
Năm 1784, axit citric được phân lập lần đầu tiên từ nước chanh bởi nhà hóa học người Thụy Điển Carl Scheele. Axit này được sản xuất thương mại đầu tiên ở Anh sử dụng chanh nhập khẩu từ Ý vào khoảng năm 1826. Nước chanh vẫn là nguồn sản xuất axit citric thương mại cho đến khi A. niger được sử dụng để sản xuất axit citric trong công nghiệp lần đầu tiên vào năm 1919 ở Bỉ. A. niger vẫn là vi sinh vật sản xuất công nghiệp axit citric hàng đầu mặc dù nhiều loài khác cũng được sử dụng để sản xuất axit này như A. foetidus, Candida lipolytica, C. guilliermondii và Yarrowia lipolytica [90].
4.1. Ứng Dụng Rộng Rãi Của Axit Citric Trong Công Nghiệp Thực Phẩm
Axit citric (kí hiệu thương mại là E330) với sản lượng toàn cầu đạt tới 2 triệu tấn/năm, được sử dụng như là chất tạo hương vị và chất bảo quản trong thực phẩm và nước giải khát công nghiệp, làm giảm độ ngọt trong các sản phẩm như bánh kẹo, các loại nước ép trái cây, mứt, thạch và nhiều mặt hàng khác [90]. Trong công nghiệp dược phẩm, axit citric được sử dụng như một chất bảo quản để lưu trữ máu và trong các ngành công nghiệp mỹ phẩm được sử dụng như một bộ đệm và chất chống oxy hóa [85].
4.2. Sản Xuất Axit Gluconic và Các Enzyme Từ Aspergillus Niger
Một axit hữu cơ khác cũng được sản xuất thương mại bởi A. niger là axit gluconic. Axit gluconic với sản lượng toàn cầu hằng năm ước tính khoảng 100000 tấn, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp và trong gia đình. Axit gluconic được sử dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm (kí hiệu thương mại là E574) và đặc biệt trong các chế phẩm dược phẩm rất tinh khiết. Axit gluconic được dùng như một chất tạo phức giúp làm sạch kim loại trong ngành công nghiệp sữa, làm sạch bề mặt trong chất tẩy rửa, khử kiềm trong ngành luyện kim và chống lắng đọng sắt trong ngành công nghiệp dệt và là một tác nhân tạo phức cho việc khai thác các ion như canxi, đồng và sắt.
V. Vai Trò Của Enzyme Phytase Từ Aspergillus Niger
Phytate là dạng lưu trữ chính của phospho và chiếm hơn 80% tổng phospho trong ngũ cốc và các loại đậu – nguyên liệu chính của thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, những động vật dạ dày đơn như lợn và gia cầm lại không có khả năng sử dụng phospho dưới dạng phytate. Điều này dẫn đến ô nhiễm phospho ở các khu vực có ngành chăn nuôi phát triển vì gần như toàn bộ lượng phospho dạng phytate trong khẩu phần ăn của các loài này sẽ bài tiết ra ngoài môi trường. Hơn nữa, phytate có thể hình thành các phức không tan với khoáng kim loại và có thể là protein, gây nên hiện tượng kháng dinh dưỡng và ngăn cản sự hấp thu các chất dinh dưỡng này [34].
5.1. Ứng Dụng Của Enzyme Phytase Trong Thức Ăn Chăn Nuôi
Để phân giải phytate, cần phải có sự xúc tác của enzyme phytase. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate thành myo-inositol và một số gốc phosphate vô cơ. Thức ăn chăn nuôi có bổ sung phytase không những giúp cải thiện hiệu quả hấp thu lượng phospho và một số thành phần khác có sẵn trong thức ăn mà còn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phospho gây ra. A. niger là một trong những nguồn sản xuất phytase thương mại quan trọng nhất [34].
5.2. Aspergillus Niger Trong Sản Xuất Protein Ngoại Lai
A. niger được sử dụng làm vật chủ để sản xuất các protein ngoại lai [80]. Ví dụ, một nghiên cứu đã sử dụng A. niger để sản xuất protein kháng thể đơn dòng (mAb) có khả năng liên kết với kháng nguyên ung thư. Kết quả cho thấy A. niger có thể sản xuất mAb với hiệu suất cao và protein mAb được sản xuất có hoạt tính sinh học tương đương với mAb được sản xuất từ tế bào động vật có vú [81].
