Nghiên cứu định lượng coumarin và một số phenylpropanoid trong quế bằng hplc và bước đầu nhận dạng quế theo vùng trồng

Nghiên cứu định lượng coumarin và phenylpropanoid trong quế bằng HPLC, nhận dạng quế theo vùng trồng, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm.

• Tác giả: Trịnh Tuấn Nam
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Coumarin Và Phenylpropanoid Trong Quế
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU QUẾ
• 1.1. Các loài Quế
• 1.2. Bộ phận sử dụng thường dùng của Quế
• 1.3. Tác dụng chữa bệnh của Quế
• 1.4. Thành phần hóa học trong Quế
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT TRONG QUẾ ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH
• 2.1. Acid 2-methoxyl cinnamic
• 2.2. Tổng quan về một số phương pháp toán hóa thống kê đa biến
• 2.2.1. Phân tích thành phần chính (PCA)
• 2.2.2. Đặc tính PCA
• 2.2.3. Phân tích phân biệt (DA)
• 2.2.4. Phân tích biệt số bình phương tối thiểu từng phần (PLS-DA)
• 2.2.5. Mạng neuron nhân tạo (ANN)
• 3. CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU)
• 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 3.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
• 3.2.1. Dung môi, hóa chất
• 3.2.2. Chất đối chiếu
• 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.4.1. Phương pháp định lượng Coumarin và các Phenylpropanoid
• 3.4.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
• 3.4.3. Định lượng các Phenylpropanoid và Coumarin trong mẫu nghiên cứu
• 3.4.4. Bước đầu phân loại vùng trồng bằng phương pháp toán hóa thống kê đa biến
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ MẪU
• 4.1.1. Khảo sát các phương pháp chiết siêu âm
• 4.2. ĐỊNH LƯỢNG CÁC PHENYLPROPANOID VÀ COUMARIN TRONG CÁC MẪU QUẾ
• 4.2.1. Định danh các chất nghiên cứu và đánh giá độ phù hợp của hệ thống
• 4.2.2. Xác định hàm lượng chất nghiên cứu
• 4.3. BƯỚC ĐẦU PHÂN LOẠI VÙNG TRỒNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP TOÁN HÓA THỐNG KÊ ĐA BIẾN
• 4.3.1. Phân loại bằng mô hình PCA-DA
• 4.3.2. Phân loại bằng mô hình PLS-DA
• 4.3.3. Phân loại bằng mô hình BNN
• 5. CHƯƠNG 5: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH COUMARIN VÀ CÁC PHENYLPROPANOID BẰNG HPLC
• 5.1. Điều kiện sắc ký HPLC
• 5.2. Điều kiện xử lý mẫu
• 5.3. Định danh các chất nghiên cứu và độ phù hợp hệ thống
• 6. CHƯƠNG 6: HÀM LƯỢNG CÁC PHENYLPROPANOID VÀ COUMARIN TRONG CÁC MẪU QUẾ VIỆT NAM
• 6.1. Tổng hàm lượng các Phenylpropanoid trong quế và phần trăm hàm lượng Cinnamadehyd trong tổng hàm lượng Phenylpropanoid
• 6.2. Khoảng hàm lượng quy định của 6 chất phân tích
• 6.3. Phân loại vùng trồng bằng toán hóa thống kê đa biến
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu coumarin và phenylpropanoid trong quế

Nghiên cứu về coumarin và phenylpropanoid trong quế đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Quế không chỉ là một gia vị phổ biến mà còn chứa nhiều hợp chất có giá trị dược lý. Các hợp chất này không chỉ quyết định hương vị mà còn có tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người. Việc hiểu rõ về cấu trúc hóa học và tác dụng của chúng là rất quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm từ quế.

1.1. Các thành phần hóa học chính trong quế

Quế chứa nhiều hợp chất hóa học, trong đó coumarin và phenylpropanoid là hai nhóm chất quan trọng. Coumarin có mùi thơm dễ chịu và được sử dụng trong ngành công nghiệp nước hoa, trong khi phenylpropanoid quyết định hương vị đặc trưng của quế. Nghiên cứu cho thấy rằng hàm lượng của các hợp chất này có thể thay đổi tùy theo vùng trồng và điều kiện khí hậu.

1.2. Tác dụng dược lý của coumarin và phenylpropanoid

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng coumarin có tác dụng chống đông máu và kháng viêm, trong khi phenylpropanoid có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn. Những tác dụng này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe mà còn có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu coumarin và phenylpropanoid

Mặc dù có nhiều lợi ích từ coumarin và phenylpropanoid, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng chúng trong thực tiễn vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự biến đổi hàm lượng các hợp chất này trong quế do điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng. Điều này làm cho việc tiêu chuẩn hóa sản phẩm quế trở nên khó khăn.

2.1. Biến đổi hàm lượng hợp chất trong quế

Hàm lượng coumarin và phenylpropanoid trong quế có thể thay đổi đáng kể giữa các vùng trồng khác nhau. Các yếu tố như độ pH của đất, lượng mưa và ánh sáng mặt trời đều ảnh hưởng đến sự phát triển của cây quế và hàm lượng các hợp chất này.

2.2. Khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng quế

Việc kiểm soát chất lượng quế là một thách thức lớn, đặc biệt là khi nhiều sản phẩm không có nhãn mác rõ ràng. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến người tiêu dùng mà còn làm giảm giá trị kinh tế của sản phẩm quế. Cần có các phương pháp phân tích chính xác để đảm bảo chất lượng và nguồn gốc của quế.

III. Phương pháp nghiên cứu coumarin và phenylpropanoid trong quế

Để nghiên cứu coumarin và phenylpropanoid, các nhà khoa học thường sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này cho phép xác định và định lượng chính xác các hợp chất trong mẫu quế. Việc áp dụng HPLC giúp nâng cao độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.

3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong nghiên cứu

HPLC là một phương pháp phân tích mạnh mẽ, cho phép tách biệt và định lượng các hợp chất trong quế. Phương pháp này đã được sử dụng để xác định hàm lượng coumarin và phenylpropanoid trong các mẫu quế từ nhiều vùng khác nhau, giúp so sánh và đánh giá chất lượng.

3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Điều kiện xử lý mẫu là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian chiết xuất và loại dung môi đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Việc tối ưu hóa các điều kiện này sẽ giúp nâng cao độ chính xác và độ nhạy của phương pháp HPLC.

IV. Ứng dụng thực tiễn của coumarin và phenylpropanoid trong y học

Các hợp chất coumarin và phenylpropanoid không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Chúng được sử dụng trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người.

4.1. Ứng dụng trong phát triển thuốc

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng coumarin có thể được sử dụng trong việc phát triển thuốc chống đông máu. Ngoài ra, phenylpropanoid cũng có tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm kháng viêm và chống oxy hóa.

4.2. Ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Các hợp chất từ quế, đặc biệt là coumarin và phenylpropanoid, đang được nghiên cứu để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng. Những sản phẩm này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe mà còn có thể phòng ngừa nhiều bệnh tật.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu coumarin và phenylpropanoid

Nghiên cứu về coumarin và phenylpropanoid trong quế đang mở ra nhiều triển vọng mới. Việc hiểu rõ về các hợp chất này không chỉ giúp nâng cao giá trị kinh tế của quế mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ có nhiều phát hiện mới và ứng dụng thực tiễn.

5.1. Tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về coumarin và phenylpropanoid sẽ tiếp tục được mở rộng, với nhiều phương pháp phân tích hiện đại hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc xác định hàm lượng các hợp chất này trong quế.

5.2. Ứng dụng trong phát triển sản phẩm

Các sản phẩm từ quế có thể được phát triển dựa trên các nghiên cứu về coumarin và phenylpropanoid. Điều này không chỉ giúp nâng cao giá trị kinh tế của quế mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Quế là một trong những vị thuốc quý truyền thống của y học cổ truyền phương Đông ("sâm, nhung, quế, phụ"), đồng thời được ứng dụng rộng rãi trong y học hiện đại, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và đồ uống. Tinh dầu và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong quế, đặc biệt là nhóm phenylpropanoid, quyết định hương vị, giá trị dược lý cũng như giá trị kinh tế của dược liệu. Tuy nhiên, hàm lượng các hợp chất này phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, giống cây và kỹ thuật chế biến của từng vùng sinh thái.

Tại Việt Nam, nhiều vùng trồng quế tập trung nổi tiếng đã được gây dựng lâu đời và được bảo hộ chỉ dẫn địa lý như quế Văn Yên (Yên Bái), quế Trà My (Quảng Nam), quế Thường Xuân (Thanh Hóa). Dù vậy, thị trường hiện nay vẫn tồn tại tình trạng trà trộn nguồn gốc, kinh doanh quế gắn nhãn hiệu nổi tiếng nhưng không đúng quy chuẩn xuất xứ. Xuất phát từ nhu cầu kiểm soát chất lượng và truy xuất nguồn gốc quế thương phẩm, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Trịnh Tuấn Nam (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2022) đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Định lượng các Phenylpropanoid và Coumarin trong quế (quế nhục) thu hái ở các vùng khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Nhận dạng quế theo vùng trồng dựa vào hàm lượng các Phenylpropanoid và Coumarin trong các mẫu quế nghiên cứu bằng phương pháp toán hóa thống kê đa biến (Chemometrics).

Đối tượng nghiên cứu của đề tài bao gồm 6 hợp chất: Coumarin (CM), Cinnamyl alcohol (CALC), Acid cinnamic (CA), Acid 2-methoxycinnamic (MCA), Cinnamaldehyd (CAL) và 2-Methoxycinnamaldehyd (MCAL). Đối tượng mẫu thực vật là 130 mẫu vỏ thân cây quế (quế nhục) được thu hái trong khoảng thời gian từ tháng 9 đến tháng 10 năm 2021 tại 4 địa phương: Quảng Ninh (42 mẫu), Quảng Nam (30 mẫu), Yên Bái (48 mẫu) và Thanh Hóa (5 mẫu). Toàn bộ mẫu thử sau thu hái được cân khoảng 100 g, đóng kín trong túi PE, bảo quản ở điều kiện mát và tránh ánh sáng trước khi xử lý phân tích.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài dựa trên việc ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo kết hợp đầu dò DAD và các thuật toán phân loại thống kê đa biến trong hóa phân tích:

• Cơ sở phân tích chất lượng dược liệu: Tham chiếu chuyên luận Cinnamomum cassia Twig powder trong Dược điển Mỹ phiên bản 43 (USP43), Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung Quốc. Trong đó, tiêu chuẩn USP43 yêu cầu hàm lượng tổng phenylpropanoid không thấp hơn 0,8% (so với dược liệu khô kiệt) và hàm lượng cinnamaldehyd chiếm tối thiểu 65% trong tổng lượng phenylpropanoid.
• Phương pháp phân tích dụng cụ: Kỹ thuật HPLC-DAD trên hệ thống Shimadzu 20A (Nhật Bản), pha tĩnh cột Inertsil ODS kích thước 250 mm × 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm; pha động gồm dung dịch acid phosphoric 0,05% trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chương trình gradient nồng độ trong 35 phút; bước sóng phát hiện UV tại 265 nm; thể tích tiêm mẫu 10 µL.
• Phương pháp xử lý mẫu: Khảo sát chiết siêu âm với dung môi methanol - nước (tỷ lệ thể tích 7:3). Xác định độ ẩm dược liệu bằng phương pháp cất đẳng phí với dung môi xylen (10 g mẫu) theo Phụ lục Dược điển.
• Phương pháp toán hóa thống kê đa biến (Chemometrics): Sử dụng phần mềm Matlab R2018a (Classification toolbox for MATLAB, giao diện class_gui) để xây dựng các mô hình nhận dạng dựa trên ma trận nồng độ hoạt chất:
  • Phân tích phân biệt kết hợp phân tích thành phần chính (PCA-DA).
  • Phân tích phân biệt kết hợp bình phương tối thiểu từng phần (PLS-DA).
  • Mạng nơ-ron nhân tạo lan truyền ngược (Backpropagation Neural Network - BNN).
• Nguồn dữ liệu thực nghiệm: Gồm tập dữ liệu định lượng 130 mẫu quế thực tế chia thành hai tập: tập luyện (training set) gồm 110 mẫu để huấn luyện mô hình và tập kiểm tra (testing set) gồm 20 mẫu (mỗi tỉnh lấy ngẫu nhiên 5 mẫu) để đánh giá độ chính xác phân loại độc lập. Chất đối chiếu gồm Trans-Cinnamic acid (độ tinh khiết 99%), Cinnamaldehyde (độ tinh khiết 99%) từ hãng Sigma-Aldrich và mẫu dược liệu chuẩn Cinnamomum cassia có nguồn gốc Việt Nam đã được xác định tên khoa học bởi PGS.TS Trần Văn Ơn.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp toàn diện các tư liệu về thực vật học, tác dụng sinh học, thành phần hóa học của chi Quế (Cinnamomum), các chất phân tích mục tiêu và lý thuyết toán hóa học:

• Thực vật và phân bố: Chi Cinnamomum (họ Lauraceae) gồm hơn 300 loài, trong đó Việt Nam ghi nhận 44 loài và 1 thứ. Hai loài trồng phổ biến nhất là C. cassia (quế bì, trồng nhiều ở Yên Bái chiếm 70% sản lượng cả nước, Quảng Ninh) và quế Thanh (C. loureiroi, trồng tại Thường Xuân - Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Nam).
• Hoạt tính dược lý và thành phần hóa học: Cập nhật các tác dụng chống đái tháo đường (thông qua ức chế enzym alpha-glucosidase, maltase, sucrase), ức chế tích tụ protein tau trong bệnh Alzheimer, vô hiệu hóa enzym HDAC8 trong bệnh u ác tính, kháng khuẩn (Listeria, Salmonella), kháng nấm hô hấp và chống oxy hóa. Vỏ quế chứa 2,7 - 3,11% tinh dầu, với hợp chất chính là aldehyd cinnamic chiếm 60 - 80%, cùng khoảng 160 hợp chất thuộc các nhóm terpenoid, phenylpropanoid, glycosid, lignan, lacton.
• Đặc tính 6 chất nghiên cứu: Khóa luận hệ thống hóa cấu trúc IUPAC, tính chất lý hóa và ý nghĩa phân tích của: Acid cinnamic (CA, nhiệt độ nóng chảy 131 - 136°C); Cinnamaldehyd (CAL, tỷ trọng 1,0497 g/mL); Coumarin (CM, độc tính vừa phải trên gan chuột qua chất chuyển hóa 3,4-coumarin epoxide, LD50 275 mg/kg); Cinnamyl alcohol (CALC, chất gây mẫn cảm giới hạn dưới 0,8% theo IFRA); Acid 2-methoxycinnamic (MCA, tiền chất tạo hoạt chất chống nắng ethylhexyl methoxycinnamat); và 2-Methoxycinnamaldehyd (MCAL, ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ qua điều hòa cyclin D1, D3, CDK4, CDK6).
• Lý thuyết Chemometrics: Trình bày nguyên lý giảm chiều dữ liệu của PCA, nguyên lý xây dựng ranh giới phân lớp của PLS-DA thông qua phương trình ma trận $X = Y \cdot C + r$, và cấu trúc đa tầng, hàm truyền synapse/axon của mạng nơ-ron BNN.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, hóa chất, thiết bị và quy trình thao tác chuẩn:

• Quy trình sắc ký HPLC: Thiết lập trên cột Inertsil ODS (250 mm × 4,6 mm; 5 µm), nhiệt độ thường, bước sóng 265 nm, thể tích tiêm 10 µL. Chương trình pha động rửa giải gradient giữa dung dịch acid phosphoric 0,05% (A) và acetonitril (B) được thiết kế chi tiết:

Thời gian (phút)	Kênh A: Acid phosphoric 0,05% (%)	Kênh B: Acetonitril (%)
0	75	25
1	75	25
21	62	38
30	60	40
35	60	40

• Tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu: So sánh 3 phương pháp chiết siêu âm với dung môi methanol - nước (7:3). Kết quả khảo sát trên mẫu quế Quảng Ninh (Qni 19) cho thấy: Phương pháp 1 (chiết 2 lần, mỗi lần 30 phút, tổng thời gian 60 phút); Phương pháp 2 (chiết 1 lần trong bình định mức 25 mL, siêu âm 30 phút, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút); Phương pháp 3 (chiết 1 lần, siêu âm 2 lần liên tiếp tổng cộng 60 phút). Tác giả chọn Phương pháp 2 do cho tỷ số diện tích pic trên khối lượng mẫu cao nhất ở tất cả các pic hoạt chất, đồng thời rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu.
• Thẩm định tính thích hợp của hệ thống và định danh: Định danh vị trí các pic thông qua thời gian lưu tương đối (RRT) so với acid cinnamic trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 2 (dược liệu chuẩn C. cassia) theo quy định USP43: CM (RRT 0,80; F = 2,10), CALC (RRT 0,90; F = 2,12), CA (RRT 1,00; F = 1,00), MCA (RRT 1,10; F = 1,82), CAL (RRT 1,30; F = 1,47), MCAL (RRT 1,50; F = 2,69). Công thức tính hàm lượng quy về phần trăm chất phân tích trong dược liệu khô kiệt có tính đến độ ẩm $H$, nồng độ chuẩn $C_s$, thể tích $V$, khối lượng cân $W$, diện tích pic mẫu thử $r_u$, diện tích pic chuẩn $r_s$ và hệ số đáp ứng $F$.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm, biện luận kết quả định lượng hoạt chất và đánh giá năng lực của các mô hình phân loại:

• Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Chuẩn CA tiêm lặp lại 6 lần cho thời gian lưu trung bình 17,252 phút, hệ số kéo đuôi trung bình $T = 1,162 \le 2,0$, độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic đạt 1,84% ($\le 2%$). Dung dịch đối chiếu 1 có RRT của CAL so với CA đạt 1,3. Dung dịch đối chiếu 2 có độ phân giải $Rs$ giữa CM và CALC đạt 3,487; giữa CALC và CA đạt 4,732 (đều vượt ngưỡng quy định $\ge 1,5$).
• Kết quả định lượng hoạt chất: Định lượng được 5 trong số 6 chất khảo sát. Riêng acid 2-methoxycinnamic (MCA) không xuất hiện trên sắc ký đồ của bất kỳ mẫu nào trong cả 130 mẫu nghiên cứu. Mẫu quế Thanh Hóa có đặc điểm riêng biệt là không phát hiện thấy cinnamyl alcohol (CALC = 0%).
• So sánh hàm lượng các nhóm hợp chất theo vùng:

Tỉnh thu hái	Số mẫu (N)	CALC (%)	CA (%)	CAL (%)	MCAL (%)	CM (%)	Tổng PNP (%)	% CAL trong tổng PNP
Quảng Ninh	42	0,02	0,04	4,48	0,17	0,06	4,77	95%
Quảng Nam	30	0,08	0,05	4,39	0,02	0,40	4,95	97%
Yên Bái	48	0,04	0,04	3,84	0,17	0,387	4,47	94%
Thanh Hóa	5	0,00	0,09	2,16	0,03	0,203	2,48	95%

• Đối chiếu tiêu chuẩn Dược điển Mỹ (USP43): Toàn bộ các mẫu tại 4 tỉnh đều đạt tiêu chuẩn về tổng hàm lượng phenylpropanoid ($> 0,8%$) và tỷ lệ phần trăm cinnamaldehyd trong tổng phenylpropanoid ($> 65%$, thực tế đạt 94 - 97%). Tuy nhiên, khi xét khoảng hàm lượng từng chất riêng lẻ (như coumarin từ 0,0070% đến 0,93%), hầu như không có mẫu nào nằm trọn vẹn trong khoảng quy định của USP43, ngoại trừ chỉ tiêu acid cinnamic của mẫu quế Thanh Hóa (đạt khoảng 0,050 - 0,20%).
• Kết quả nhận dạng vùng trồng trên tập kiểm tra (20 mẫu):
  • Mô hình PCA-DA: Phân loại đúng 19/20 mẫu, đạt độ đúng 95%. Có 1 mẫu Yên Bái bị nhận định nhầm thành Quảng Nam. Đồ thị phân tán 130 mẫu có độ chụm kém, không tách biệt rõ ràng bằng mắt thường.
  • Mô hình PLS-DA: Phân loại đúng 17/20 mẫu, đạt độ đúng 85%. Có 2 mẫu Yên Bái và 1 mẫu Thanh Hóa bị xếp vào nhóm không xác định (không đạt ngưỡng yêu cầu $\ge 95%$).
  • Mô hình BNN: Đạt độ chính xác 100% (20/20 mẫu kiểm tra xếp đúng nhóm). Đồ thị phân tách không gian giữa các lớp mẫu của 4 tỉnh rõ rệt, không có sự chồng lấn.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những kết quả phân tích định lượng cụ thể trên tập mẫu thực tế:

• Xây dựng thành công quy trình định lượng đồng thời coumarin và 4 dẫn xuất phenylpropanoid trong vỏ quế bằng HPLC-DAD với thời gian sắc ký 35 phút, sử dụng một chất chuẩn duy nhất là acid cinnamic kết hợp hệ số đáp ứng $F$ và thời gian lưu tương đối RRT để tính toán hàm lượng.
• Chỉ ra hàm lượng cinnamaldehyd áp đảo trong mọi mẫu quế nghiên cứu, chiếm từ 94% đến 97% tổng lượng phenylpropanoid. Khóa luận cũng phát hiện các nét đặc trưng theo địa lý: quế Quảng Nam có hàm lượng coumarin trung bình cao nhất (0,40%), quế Thanh Hóa có hàm lượng tổng hoạt chất thấp nhất (tổng PNP đạt 2,48%) và hoàn toàn không chứa cinnamyl alcohol, trong khi acid 2-methoxycinnamic vắng mặt ở toàn bộ 130 mẫu nghiên cứu.
• Chứng minh tính ưu việt của mô hình học sâu phi tuyến BNN so với các mô hình phân loại tuyến tính cổ điển (PCA-DA, PLS-DA) trong phân tích trắc lượng hóa học: BNN đạt độ chính xác phân loại tuyệt đối 100% trên tập thử nghiệm gồm 20 mẫu quế từ 4 vùng sinh thái khác nhau.
• Đóng góp so sánh học thuật: Tác giả chỉ ra các bất cập khi áp dụng khung giới hạn hàm lượng của USP43 đối với các quần thể quế tại Việt Nam, qua đó cung cấp dữ liệu thực nghiệm giúp xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và chỉ dẫn địa lý phù hợp hơn cho dược liệu quế trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế trong quá trình thực hiện:

• Kích thước mẫu tại vùng trồng Thanh Hóa còn khiêm tốn (chỉ có 5 mẫu) so với các tỉnh còn lại (Quảng Ninh 42 mẫu, Quảng Nam 30 mẫu, Yên Bái 48 mẫu), điều này phần nào ảnh hưởng đến tính đại diện thống kê của mẫu quế Thường Xuân.
• Điều kiện pha động với nồng độ acid phosphoric 0,05% chưa tối ưu để tách và phát hiện được acid 2-methoxycinnamic (khác với tài liệu tham khảo của tác giả Yan Ding sử dụng nồng độ acid 0,1% và thời gian 45 phút phát hiện được cả 7 chất).
• Hướng nghiên cứu tiếp theo: Mở rộng thu thập số lượng mẫu lớn hơn tại Thanh Hóa và các vùng trồng khác, lấy mẫu ở các thời điểm thu hái khác nhau trong năm để kiểm soát biến thiên mùa vụ; đồng thời nghiên cứu sử dụng toàn bộ phổ sắc ký (sắc ký đồ toàn phần) thay vì chỉ chọn diện tích pic đơn lẻ làm biến số đầu vào cho mô hình mạng nơ-ron BNN.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng:

• Sinh viên, học viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Dược liệu: Tham khảo chi tiết phương pháp chiết siêu âm tối ưu, kỹ thuật gradient pha động trên HPLC và cách thẩm định các thông số hệ thống sắc ký theo hướng dẫn của USP.
• Các nhà nghiên cứu về Kiểm nghiệm dược liệu và Hóa trắc học (Chemometrics): Cung cấp quy trình từng bước áp dụng hộp công cụ Classification toolbox for MATLAB (class_gui), cách xử lý ma trận số liệu nồng độ/diện tích pic, cũng như kỹ thuật so sánh hiệu năng giữa PCA-DA, PLS-DA và BNN trong việc phân loại xuất xứ dược liệu.
• Cơ quan quản lý chất lượng và doanh nghiệp kinh doanh quế: Tham khảo dữ liệu nền tảng về khoảng hàm lượng coumarin và phenylpropanoid thực tế tại 4 vùng trồng trọng điểm để xây dựng hồ sơ truy xuất nguồn gốc và kiểm soát gian lận thương mại.

Câu hỏi thường gặp

Hệ thống HPLC và điều kiện sắc ký nào đã được tác giả lựa chọn trong nghiên cứu? Tác giả sử dụng hệ thống HPLC-DAD Shimadzu 20A, cột Inertsil ODS (250 mm × 4,6 mm; 5 µm), bước sóng 265 nm, thể tích tiêm 10 µL. Pha động gồm acid phosphoric 0,05% (kênh A) và acetonitril (kênh B) chạy theo chương trình gradient trong 35 phút.

Phương pháp xử lý mẫu quế tối ưu được lựa chọn là gì? Phương pháp chiết siêu âm số 2: Cân chính xác 0,25 g bột vỏ quế vào bình định mức 25 mL, thêm 18 mL dung môi methanol - nước (7:3), lắc nhẹ 1 phút, siêu âm 30 phút, thêm dung môi đến vạch, ly tâm 5 mL dịch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó lọc qua màng 0,45 µm trước khi tiêm sắc ký.

Chất phân tích nào không phát hiện được trong toàn bộ các mẫu quế nghiên cứu? Hợp chất acid 2-methoxycinnamic (MCA) không xuất hiện trên sắc ký đồ của bất kỳ mẫu nào trong tổng số 130 mẫu nghiên cứu thu hái từ 4 tỉnh. Ngoài ra, cinnamyl alcohol (CALC) hoàn toàn không phát hiện được trong các mẫu quế thu hái tại tỉnh Thanh Hóa.

Hiệu quả phân loại vùng trồng của 3 mô hình toán hóa thống kê đa biến khác nhau như thế nào? Trên tập thử nghiệm độc lập 20 mẫu: mô hình BNN đạt độ chính xác cao nhất với 100% (20/20 mẫu phân loại đúng); mô hình PCA-DA đạt 95% (nhận nhầm 1 mẫu Yên Bái sang Quảng Nam) nhưng biểu đồ có độ chụm kém; mô hình PLS-DA cho hiệu quả thấp nhất với 85% (có 3 mẫu không thể xếp loại).

Các mẫu quế khảo sát có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng theo chuyên luận USP43 không? Tất cả các mẫu đều đạt hai tiêu chí tổng quát của USP43 là tổng phenylpropanoid $> 0,8%$ và tỷ lệ cinnamaldehyd trong tổng phenylpropanoid $> 65%$. Tuy nhiên, khi xét tiêu chí khoảng hàm lượng của từng chất riêng lẻ (đặc biệt là coumarin), hầu hết các mẫu đều nằm ngoài giới hạn quy định của USP43.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của Trịnh Tuấn Nam đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xây dựng quy trình định lượng HPLC đồng thời coumarin và 4 dẫn xuất phenylpropanoid trong 130 mẫu quế nhục tại Quảng Ninh, Quảng Nam, Yên Bái và Thanh Hóa. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm quan trọng về sự phân bố hoạt chất sinh học, khẳng định tỷ lệ cinnamaldehyd luôn chiếm ưu thế vượt trội ($> 94%$) và chỉ ra những nét đặc thù về hàm lượng hoạt chất của quế từng địa phương. Đặc biệt, việc ứng dụng thành công mô hình mạng nơ-ron lan truyền ngược (BNN) với độ chính xác phân loại tuyệt đối 100% đã mở ra phương hướng khoa học tin cậy trong việc ứng dụng hóa trắc học vào công tác nhận dạng và truy xuất nguồn gốc địa lý cho dược liệu quế Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Quế là dược liệu được sử dụng trong đời sống hàng ngày như một gia vị. Thế nhưng, ít ai biết rằng nó còn là một vị thuốc đem lại nhiều lợi ích cho cơ thể. Quế đã được sử dụng trong y học cổ truyền hàng nghìn năm và được xem là một trong bốn vị thuốc quý: “sâm, nhung, quế, phụ”[2] nhờ những đặc tính hữu dụng như điều trị, phòng chống một số bệnh như: chữa đau bụng, đau dạ dày, ỉa chảy, choáng, cảm lạnh, buốt các ngón tay ngón chân, ho hen,…Hiện nay, ngoài sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, quế còn được dùng trong rất nhiều sản phẩm thuốc từ dược liệu cũng như các sản phẩm là thực phẩm chức năng. Các nghiên cứu khoa học gần đây cũng đã chỉ ra được một số tác dụng dược lý của cây quế như: chống ung thư, kháng viêm và giảm đau, chống tiểu đường và chống béo phì, kháng khuẩn và kháng vi-rút, bảo vệ tim mạch, bảo vệ tế bào, bảo vệ thần kinh…[15][22] Trong các bộ phận của quế, vỏ quế và tinh dầu lá quế thường được sử dụng làm cơ sở cho nhiều loại hóa chất có nguồn gốc tổng hợp được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm.

[43] Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, trong quế chứa nhiều thành phần hóa học khác nhau như các dẫn xuất của terpenoid, phenyl propanoid, glycosid, lignan, lacton…[45] Trong đó, hàm lượng các Phenylpropanoid có trong quế được coi là chất quyết định mùi hương và vị của quế, cũng như quyết định tác dụng dược lý, đặc biệt là giá trị kinh tế của loại cây này. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bên cạnh yếu tố giống, chế độ canh tác, kĩ thuật chế biến,. thì điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng có ảnh hưởng rất lớn đến các thành phần hóa học trong quế, bao gồm cả các chất trong nhóm Phenylpropanoid. Do vậy, quế thành phẩm ở các vùng địa lý khác nhau sẽ có giá trị kinh tế khác nhau.

Trong những năm gần đây, một số loại quế đã được đăng ký nhãn hiệu chứng nhận, chỉ dẫn địa lý như: quế Văn Yên, quế Trà My, quế Thường Xuân. Tuy nhiên, hiện nay vẫn tồn tại nhiều điểm bán quế với thương hiệu nổi tiếng nhưng không có nhãn mác đúng quy chuẩn. Trước thách thức trên, việc kiểm soát chất lượng và truy xuất nguồn gốc sản phẩm dần trở thành nhu cầu tất yếu mang lại những lợi ích thiết thực cho nhà sản xuất và người tiêu dùng. Để truy xuất nguồn gốc sản phẩm thì hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng các phương pháp thống kê đa biến dựa trên tập số liệu về kết quả phân tích các thành phần hóa học trong mẫu.

Chính vì vậy, dựa trên cơ sở trên, nghiên cứu này nhắm tới 2 mục tiêu như sau: - Định lượng các Phenylpropanoid và Coumarin trong quế (quế nhục) thu hái ở các vùng khác nhau bằng HPLC - Nhận dạng quế theo vùng trồng dựa vào hàm lượng các Phenylpropanoid và Coumarin trong các mẫu quế nghiên cứu bằng phương pháp toán hóa thống kê đa biến.1 TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU QUẾ 1.1 Các loài Quế Quế được xem là một trong bốn vị thuốc quý: “sâm, nhung, quế, phụ” nhờ những đặc tính hữu dụng trong việc phòng và chữa bệnh cho người. Các loài quế đều thuộc chi Quế, có tên khoa học là Cinnamomum, thuộc họ Long não (Lauraceae). Theo Ravindran và các cộng sự, chi Quế (Cinnamomum) là một chi lớn trong họ Long não (Lauraceae). [34] Lá và vỏ cây của các loài thuộc chi này có tinh dầu thơm, gồm hơn 300 loài, phân bố từ vùng đại lục châu Á đến khắp vùng Đông Nam Á, Australia và khu vực Tây Thái Bình Dương.